O epithelium retinal do pigment (RPE) é um epitélio multi-funcional do olho. Aqui nós apresentamos um protocolo para estabelecer culturas de célula primária derivadas o RPE murino.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Culturas de células primárias do Mouse epithelium Retinal do Pigment
Neste artigo
Resumo
Resumo
O epithelium retinal do pigment (RPE) é um altamente polarizado epitélio multi-funcional que se localiza entre a retina neural e a coroide do olho. É uma única folha de células pigmentadas que são embaladas hexagonalmente e conectadas por junções apertadas. As principais funções do RPE incluem a absorção da luz, fagocitose dos segmentos exteriores galpão fotoreceptor, buffer espacial dos íons, transporte de nutrientes, íons e água, bem como participação activa no ciclo visual. Com tais funções importantes e diversas, é criticamente importante estudar a biologia das células RPE. Um número de linhas de células RPE foram estabelecido; no entanto, passadas e imortalizadas células são conhecidas para perder rapidamente algumas das características morfológicas e fisiológicas das células RPE naturais. Assim, as células primárias são mais adequadas para estudar diferentes aspectos da biologia de pilha RPE e função. Cultura de células RPE primária mouse é muito útil para pesquisadores, desde modelos de mouse são amplamente utilizados em estudos biológicos, no entanto, coletar RPE células de rato também é muito difícil devido ao seu pequeno tamanho. Aqui, apresentamos um protocolo para o estabelecimento de culturas de células RPE mouse principal que inclui Enucleação e dissecção dos olhos e isolamento das folhas de RPE para produzir as células para cultivo. Este método permite a recuperação eficiente da célula. As células RPE obtidas de dois ratos podem chegar a confluência em uma inserção de membrana de poliéster 12mm pré-carregado em placa de cultura, depois de uma semana de cultura e mostrar algumas das propriedades originais de boa-fé RPE células como forma hexagonal e pigmentação após dois semanas de cultura.
Introdução
O epithelium retinal do pigment (RPE) é uma única camada de células epiteliais polarizadas que se localiza entre a retina neural e a coroide do olho. A funcionalidade das células RPE e a integridade da monocamada RPE são críticos para a visão porque o RPE desempenha um papel importante em vários processos, tais como a manutenção da barreira hemato-retiniana exterior, transporte de água e íons entre a retina e o absorção de coroide, luz, proteção contra o estresse oxidativo, controle do metabolismo de retinoide e fagocitose dos segmentos exteriores dos FOTORRECEPTORES1,2. A localização do RPE na parte de trás d....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) na Universidade de Pittsburgh e institucional Cuidado Animal
1. Preparar soluções
- Prepare o crescimento médio pela completa Dulbecco modificado águia médio (DMEM), glicose alta com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina/estreptomicina, 2,5 mM L-glutamina e 1 x MEM não essenciais aminoácidos. Pré-aquecer a mídia na incubadora de 37 ° C antes do uso.
- Prepare a solução de trabalho 2% (wt/vol) dispase II:
- Prepare uma solução stock de dispase 100mg/mL II dissolvendo-se 30 mg de dispase II em 300 µ l HEPES salino (50mm KOH/HEPES....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A rato RPE cultura primária estabelecida de 2 ratos em 12mm membrana de poliéster inserção atinge 90-95% confluência após 1 semana na cultura. Depois de 2 semanas de cultura, as células alcançou a confluência de 100% e começaram a formar um mosaico de células hexagonais, pigmentadas e bi-nucleated. Por 3 semanas de cultura, as células continuou a formar a forma e pigmentação, no entanto, após 4 semanas uma parte das células tem hiperpigmentadas (Figura 2).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo detalhado apresentado permite estabelecimento confiável de rato primário RPE culturas que atingem a confluência após 1 semana e apresentar as principais características RPE como forma hexagonal e pigmentação após 2 semanas. As células RPE obtidas podem ser usadas para um número de aplicações a jusante, tais como vitamina A metabolismo9, fagocitose do fotoreceptor segmentos exterior10 e íon transporte11, células epiteliais polaridade
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
DS recebeu pesquisa financiamento da Bayer HealthCare e F. Hoffmann-La Roche, Alemanha, Suíça. Os restantes autores declaram sem interesses financeiros concorrentes. Este trabalho é apoiado pela pesquisa para evitar cegueira (subvenções irrestritas para o Wilmer Eye Institute e Universidade de Pittsburgh). Este trabalho também é apoiado por fundos de start-up para DS de Oftalmologia, Universidade de Pittsburgh.
Agradecimentos
Este estudo foi parcialmente financiado pela Fundação de BrightFocus (para DS).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| animals | |||
| 2~3 semanas de idade camundongos | |||
| Nome | Company | Número de catálogo | Comentários |
| reagentes | |||
| Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), alta glicose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS), 1X, pH 7,4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamina (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Álcool etílico | Fisher Scientific | 111000200 | |
| Anticorpo RPE65 | Um presente do Dr. Michael Redmond | ||
| Fluoresceína Faloidina | Invitrogen | F432 | |
| IgG anti-coelho para cabras (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Soro | de cabra Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldeído (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Anticorpo Policlonal | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Nome< | strong>Empresa | Catalog Número | Comentários |
| instrumentos e equipamentos | |||
| Armário de fluxo laminar | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Microscópio de dissecação (estereomicroscópio Zoom) | Incubadora de | Nikon SMZ1500 | |
| com aglutinante de esterilização por ar quente | C150 | ||
| Centrífuga | Eppendorf | 5702 | |
| Placas de Petri | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Inserções de Membrana de Poliéster Pré-Carregadas em Placas de Cultura de 12 Poços, Tamanho do Poro: 0.4 µ m, Tesoura de | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| , lâminas padrão, | instrumentos STEPHENS | S7-1320 | |
| Pinça de sutura Castroviejo 0,12 mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Faca reta crescente | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Pinças #5, 11 cm, retas, pontas de 0,1x0,06 mm, Tesoura de Instrumentos de Precisão Mundial Dumostar | 500233 | ||
| Vannas, 8 cm, 45° Ângulo, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Unidade de Filtro de Seringa Millex-GS, 0.22 µ m | Seringa | SLGL0250S | |
| , 5 mL | BD | 309632 | |
| Microscópio de Laboratório Invertido Leica DM IL LED& | nbsp; Leica | ||
| Pipeta | Gilson | ||
| Barreira e ponteiras de pipeta não filtradas | Thermo Scientific |
Referências
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE c....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
