Ensaio de reparação da membrana celular usando um microscópio de dois fotões Laser

Resumo

Membrana celular ferindo através de dois fotões laser é um método amplamente utilizado para avaliar a capacidade de fechamento de membrana e pode ser aplicado a vários tipos de células. Aqui, descrevemos um protocolo para em vitro viver de imagem membrana efectuou em dysferlinopathy paciente células após ablação a laser de dois fotões.

Resumo

Numerosos insultos fisiopatológicos podem danificar as membranas celulares e, quando combinada com defeitos inatos na reparação da membrana celular ou integridade, podem resultar em doença. Compreender os mecanismos moleculares subjacentes em torno de reparo da membrana celular, portanto, é um objectivo importante para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para doenças associadas à dinâmica disfuncional da membrana celular. Muitos estudos in vitro e em vivo vistos compreender a membrana celular de fechamento em diversos contextos de doença utilizam ablação a laser dois fotões como um padrão para determinar os resultados funcionais após tratamentos experimentais. Neste ensaio, as membranas celulares são sujeitas a ferindo com um laser de dois fotões, que faz com que a membrana da célula, ruptura e tintura fluorescente para se infiltrar na célula. A intensidade da fluorescência dentro da célula em seguida pode ser monitorada para quantificar a capacidade da célula de selar em si. Existem vários métodos alternativos para a avaliação da membrana celular resposta a lesão, bem como a grande variação na laser dois fotões ferindo abordagem em si, portanto, um modelo de célula ferindo unificada beneficamente serviria para diminuir o variação entre estas metodologias. Neste artigo, nós esboçamos um laser simples de dois fotões ferindo o protocolo para a avaliação da membrana celular reparação in vitro em ambos saudáveis e dysferlinopathy paciente fibroblastos células transfectadas com ou sem um plasmídeo dysferlin completos.

Introdução

A membrana celular das células eucarióticas é composto por uma camada dupla de fosfolipídios cravejado de proteína que define o ambiente intra/extracelular da célula e é essencial para manter a sobrevivência celular de homeostase e célula. Membrana celular lesões decorrentes de insultos mecânicos ou químicos são comuns em vários tipos de células de mamíferos, incluindo esquelético e músculo cardíaco, estômago e pulmão células^1,2,3,4. Além de lesões consequentes para funções fisiológicas diárias, as membranas das células também podem ser danificadas por insultos ambientais, toxinas bacterianas e reperfusão isquêmica⁵. Falha de selar rupturas na membrana celular leva ao influxo não regulamentado de extracelular Ca^{2 +}- juntamente com outros componentes extracelulares potencialmente tóxicos - dentro da célula, desencadeando cascatas de sinal a jusante que rapidamente podem resultar em células morte^1,4,5,6.

Até à data, tem havido vários modelos propostos para o reparo de membrana nas células. Mecanismos de reparação diferentes podem ser ativados, dependendo do tamanho e da natureza da ruptura da membrana. Por exemplo, sugere-se que as membranas celulares podem utilizar fluxo lateral ou proteína entupimento para reparar pequenas interrupções (< 1 nm). O modelo de fusão lateral propõe que rupturas de membrana são rapidamente reparadas através de recrutamento lateral de dysferlin contendo membrana⁷, enquanto a proteína entupimento modelo sugere que pequenas perfurações são remendadas através de agregações de proteínas (principalmente anexinas) ⁸. Inversamente, desencadear lesões maiores de membrana Ca^{2 +}-dependente, mediada por dysferlin vesículas fusão e formação de um remendo do reparo. No modelo de remendo de reparação, um rápida Ca^{2 +} influxo para a célula dispara o recrutamento de várias proteínas (dysferlin, anixinas, mitsugumin-53 e proteínas EDH) que formam um complexo ou "patch", juntamente com uma fusão de vesículas intracelulares ou lisossomos no local da membrana danificar^4,9,10,11,12. É importante notar que estes modelos não são necessariamente mutuamente exclusivos e podem trabalhar em conjunto para facilitar a reparação da membrana. Falha de selar corretamente o dano da membrana celular está associada a vários Estados da doença, incluindo distrofia muscular (dysferlinopathy - incluindo Miyoshi miopatia, membro-cinta distrofia muscular tipo IIB e miopatia distal com início tibial anterior) ¹³, cardiomiopatia¹⁴e Chediak-Higashi síndrome (CHS)¹⁵.

Dada essa integridade adequada da membrana celular e peças de fechamento um papel tão importante na saúde e na doença, uma compreensão mais profunda dos mecanismos moleculares subjacentes do reparo da membrana celular seria benéfica na busca de novas estratégias terapêuticas. É, portanto, necessário possuir técnicas experimentais adequadas para a cinética de monitorar e avaliar a capacidade de reparação da membrana celular. Vários métodos em vitro para reparação de membrana de modelagem foram projetados. Uma estratégia envolve lesão mecânica, que pode ser facilitado através da célula a raspar com uma lâmina/navalha pipeta/cirúrgico ou pelo rolamento esferas de vidro sobre as células de¹⁶. No entanto, este tipo de lesão mecânica gera lesões maiores e cria um elevado grau de variação no ferimento da pilha, tanto dentro como entre culturas.

Outro método de gerar feridas de membrana é ablação a laser por microscopia de dois fotões. Em contraste com a microscopia confocal laser tradicional que emprega a excitação de fóton único, o laser de dois fotões usa simultaneamente dois fótons de comprimento de onda longa, baixo consumo de energia para facilitar a excitação de um elétron de alta energia¹⁷. Este processo não-linear resulta em excitação exclusivamente dentro do plano focal e não ao longo do trajeto da luz toda¹⁷ (Figura 1). Este reduzido excitação volume ajuda a minimizar Fotodano quando de imagens ao vivo de células^18,19. Pesquisadores, portanto, são capazes de gerar lesões precisas na membrana celular e monitor membrana efectuou em tempo real usando corantes fluorescentes e observar as alterações da intensidade de fluorescência como a ruptura da membrana celular e, depois, regenere.

Esta abordagem tem sido usada repetidamente para estudar a membrana ferindo em vitro e em vivo e em célula de vários tipos de^20,21. Por exemplo, a membrana reparar defeitos em fibroblastos e myotubes derivado de dysferlinopathy, os pacientes foram avaliados utilizando esta técnica^22,23. Também, única fibras musculares isoladas de ratos foram usadas para monitorar reparo remendo formação^13,24,25. O movimento de proteínas fluorescente etiquetados também pode ser observado durante o reparo da membrana em fibras de músculo único⁹. Além disso, o processo de reparação mecanismos a seguir dois fotões laser ferindo em embriões de peixe-zebra pode ser observado em tempo real na vivo²⁶.

Neste artigo, descrevem uma metodologia para avaliar a dinâmica de reparo da membrana celular em fibroblastos usando dois fotões laser ferindo, embora esta metodologia pode ser aplicada a vários tipos de células com a finalidade de quantificar a membrana plasmática, capacidade de fechamento em vitro. Neste método, as células são incubadas com FM4-64, um corante lipofílico, célula-impermeável que fluoresce rapidamente a como liga-se ao negativamente carregada de fosfolipídios no citoplasma ao entrar na célula através da lesão de membrana (Figura 2& 3). quantificação da fluorescência do corante adjacente à lesão de membrana permite o monitoramento do tempo que leva para a membrana da célula de selar em si. Para exemplificar a utilidade desse método, usamos dysferlinopathy paciente fibroblastos transfectados com plasmídeos dysferlin completos GFP-conjugados (DYSF) para avaliar o resgate de reparo da membrana celular.

Protocolo

Células de fibroblastos humanos utilizadas neste estudo foram utilizadas com aprovação do Comitê de ética humana da faculdade de medicina e Odontologia da Universidade de Alberta.

1. transfecção de células com longa-metragem do plasmídeo DYSF

1. Células de cultura de fibroblastos num balão de T225 contendo 40 mL de meio de crescimento - de mL 36 Dulbecco modificado águia médio (DMEM), 4 mL de soro fetal bovino (FBS) e 20 µ l de penicilina/estreptomicina (P/S) - numa incubadora de CO₂ a 37 ° C.
   Nota: As células devem ser cultivadas para aproximadamente 70-80% de confluência e não devem tornar-se completamente confluentes.
2. Para preparar células para semeadura, enxagúe as células com 40 mL de salina tamponada fosfato (PBS) duas vezes e, em seguida, adicionar 5 mL de tripsina 0,05% para separar as células. Retorno as células a 37 ° c CO₂ incubadora e incube as celulas por 5 min.
   1. Quando as células são totalmente isoladas, adicione 40 mL de meio de crescimento para parar a reação de tripsina.
   2. Conte as células usando um hemocytometer ou outra célula contando o dispositivo.
3. Sementes de 2 mL de células a 1 x 10⁵ células/mL em pratos de vidro-fundo revestido de colágeno de 35 mm. Incubar as células durante a noite em uma incubadora de CO₂ a 37 ° C.
   Nota: As células devem ser aproximadamente 50-60% de confluencia no dia seguinte.
4. Remova a mídia de crescimento e substituí-lo com 2 mL de soro-privado media (mídia de crescimento sem FBS).
5. Transfect as células com plasmídeo dysferlin completos usando lipotransfection.
   1. Prepare 150 µ l de meios privados de soro em um tubo de 1,5 mL (um tubo para cada prato a transfected).
   2. Adicione 3 µ l de reagente de Transfeccao para cada tubo de 1,5 mL contendo meios privados de soro. Incube-lo pelo menos 5 min à temperatura ambiente.
   3. Em um tubo separado 1,5 mL, adicione 175 µ l dos meios de comunicação privados de soro e 3,5 µ g do ADN do plasmídeo.
      Nota: Multiplica os valores acima para cada prato adicional a transfected.
   4. Combine a 150 µ l de mídia contendo o plasmídeo de DNA em um tubo com 150 µ l de soro privado de mídia e reagente de transfeccao. -Incube por 20 min em temperatura ambiente.
   5. Distribua uniformemente 300 µ l de mídia com o reagente do plasmídeo e transfecção em todo o prato. Incubar os pratos para 24h numa incubadora de CO₂ a 37 ° C.
6. Substituir a mídia com a mídia de crescimento fresco com soro e incube-lo para um adicional 24h numa incubadora de CO₂ a 37 ° C.

2. preparação de células para ensaio ferindo dois fotões

1. Remova a mídia pipetando e enxágue as células uma vez com 1 mL de solução de Tyrode, em seguida, adicione 1 mL de solução de Tyrode fresco contendo 1 µ l de 2,5 mM FM 4-64 tintura.
   Nota: A concentração final de tintura de FM 4-64 é 2,5 µM.
2. Se avaliação de reparação da membrana em um ambiente empobrecido cálcio é desejada, enxágue as células com 1 mL de PBS e em seguida, adicione 1 mL de PBS contendo 1 mM EGTA.
   Nota: Como PBS fará com que as células a se destacar ao longo do tempo, o ensaio ferindo deve ser concluído mais rapidamente possível.

3. dois fotões laser ferindo ensaio

1. Usando um microscópio confocal invertido e o software programa associado, criar um destino de µm de 0,2 µm x 2 e colocá-lo na borda da membrana celular, para que a linha de destino se sobrepõe e encontra-se perpendicular à direção da membrana celular (Figura 2).
2. Use um laser aqui vai de 543-nm para excitar o sinal de FM tintura e definir a escala da deteção para 600-760 nm. Use um laser de argônio 488 nm para excitar o sinal GFP (Figura 4) e definir a escala da deteção para 500-550 nm.
   1. Criar uma série de tempo de 5 min de exames de imagem sequencial, células de imagem a cada 5 s.
   2. Para gerar uma lesão de membrana, lixívia células usando um laser de dois fotões definido como 820 nm, usando 15% poder com 10 iterações do laser e lixívia células 25 s após o início da série de tempo.
3. Para quantificar a FM 4-64 fluorescência de tintura, use o software para desenhar um 6 µm x 6 µm região de interesse (ROI) e colocá-lo adjacente para o local do ferimento e dentro da célula (Figura 3).
   Nota: Evite áreas de amostragem de supersaturação pixel usando a função de "Indicador de intervalo" no software - nesta aplicação, pixels vermelhos representam pixels saturadas. Exporte valores de fluorescência cru em uma planilha eletrônica para análise estatística.
4. Calcular os valores de fluorescência relativo para cada ponto de tempo subtraindo o valor do fundo (valor médio de fluorescência momentos antes da membrana ferindo) e dividindo o aumento líquido por fluorescência valor em t = 0 (Figura 5, 6) .

Resultados

Fibroblastos humanos saudáveis, fibroblastos de pacientes não tratados dysferlinopathy e pacientes fibroblastos transfectados com um plasmídeo que contém a sequência de dysferlin completos foram submetidas a dois fotões laser ferindo para avaliar a capacidade de fechamento de membrana em tempo real. Células de fibroblasto humano saudável exibida baixos níveis de ativação de fluorescência FM 4-64 seguindo do laser ferindo e fibroblastos de pacientes não tratados exibiram um alto grau de in...

Discussão

Dois fotões laser ferindo da membrana celular é uma técnica precisa e versátil para avaliar a dinâmica da membrana em vitrode fechamento. Neste artigo, descrevemos um protocolo para a determinação da membrana celular, habilidade em dysferlinopathy paciente células usando o laser de dois fotões ferindo o ensaio de fechamento. Nossos resultados mostram que a paciente células dysferlinopathy são defeituosas na membrana celular de fechamento, que é consistente com resultados por outros pesquisadores e que destaca ai...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)	Thermo Fisher	11320033
Soro Fetal	Bovino Sigma-Aldrich	F1051
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher	15140122
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Thermo Fisher	25300062
Dulbecco' s Fosfato tampolado com solução salina	Sigma-Aldrich	D8537
35mm pratos com fundo de vidro revestidos de colágeno	MatTek	P53GCOL-1.5-14-C
Mídia privada de soro	Thermo Fisher	31985070
Reagente de transfecção	Thermo Fisher	15338100
FM 4-64 Corante	Invitrogen	T13320
Tyrode' s Sais Solução	Sigma-Aldrich	T2397
Microscópio confocal de varredura a laser	Carl Zeiss	NA
Chameleon Laser de dois fótons	Coerente	NA