Engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado

Resumo

Nós descrevemos instruções passo a passo para: 1) eficientemente projetar organóides intestinais usando nanopartículas magnéticas para Lenti-ou transdução retroviral, e, 2) gerar seções congeladas a partir de organóides projetados. Esta abordagem fornece uma poderosa ferramenta para alterar eficientemente a expressão gênica em organóides para investigação de efeitos a jusante.

Resumo

As culturas organoides intestinais proporcionam uma oportunidade única para investigar a biologia intestinal da célula-tronco e da cripta in vitro, embora abordagens eficientes para manipular a expressão gênica em organóides tenham feito progressos limitados nesta arena. Enquanto a tecnologia CRISPR/Cas9 permite a edição precisa do genoma das células para a geração de organoides, essa estratégia requer extensa seleção e triagem por análise de sequência, que é demorada e dispendiosa. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a transdução viral eficiente de organoids intestinais. Essa abordagem é rápida e altamente eficiente, diminuindo assim o tempo e a despesa inerentes à tecnologia CRISPR/Cas9. Nós igualmente apresentamos um protocolo para gerar seções congeladas das culturas organoid intactas para uma análise mais adicional com mancha immunohistochemical ou Immunofluorescent, que pode ser usada para confirmar a expressão ou o silenciamento do gene. Após a transdução bem-sucedida de vetores virais para expressão gênica ou silenciamento é alcançada, a função de célula-tronco intestinal e cripta pode ser rapidamente avaliada. Embora a maioria dos estudos organoides empreguem ensaios in vitro, os organóides também podem ser entregues em camundongos para análises funcionais in vivo. Além disso, nossas abordagens são vantajosas para prever respostas terapêuticas às drogas porque as terapias atualmente disponíveis geralmente funcionam modulando a expressão gênica ou a função protéica em vez de alterar o genoma.

Introdução

A capacidade de cultura de rato ou células de criptas humanas como tridimensional (3D) organóides do intestino delgado ou cólon durante períodos prolongados de tempo proporcionou um grande avanço, porque estas culturas exibem características definidoras do epitélio intestinal in vivo ^{1. º , 2. º , 3}. organóides derivados de criptas primárias são capazes de autorenovação e autoorganização, exibindo funções celulares semelhantes aos seus tecidos de origem. Na verdade, os organóides recapitulam não só a organização estrutural das criptas in vivo, mas também muitas característica....

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de cuidados e uso de animais das instituições médicas Johns Hopkins (IACUC). Este protocolo é modificado a partir de um métodos publicados anteriormente¹⁰,^11,12,13.

1. preparação de reagentes

1. Prepare um meio fresco de 293T com várias horas de antecedência e aqueça a 37 ° c em um banho de água por pelo menos 10 min antes da utilização (tabela 1).
2. Prepare DNA plasmídeo^2,13

Resultados

Aqui, nós descrevemos uma técnica rápida e altamente eficiente da transdução que chicotes nanopartículas magnéticas expor a um campo magnético para entregar o Lentivirus às pilhas do interesse. Com ferramentas prontamente disponíveis, aplicamos esta abordagem não só para transduce células criptárias recém-isoladas (Figura 1a), mas também para organóides (Figura 2) e outras células refratárias a abordagens de transdução mais rotin.......

Discussão

A cultura preliminar do epitélio intestinal adulto como organóides fornece uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos moleculars envolvidos na função da pilha de haste, na homeostase epithelial intestinal, e na patologia^1,2,^3, a ⁴. Embora a tecnologia CRISPR/Cas9 possa ser usada para projetar geneticamente organóides⁹, ela é limitada pela necessidade de triagem e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965092	Meio de base para células 293T
DMEM/F12+	Thermo Fisher Scientific	12634010	Meio de base para meio de cultura organoide e tampão de digestão de organoides
OPTI-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	Vírus plasmídeos meio de transfecção
Soro bovino fetal	Corning	35-011-CV	Componente do meio de coleta de vírus e meio 293T
Pen/Strep	Thermo Fisher Scientific	15140122	Componente do meio de cultura organoide e tampão de dissociação de cripta
PBS (sem Ca2+, Mg2+)	Thermo Fisher Scientific	10010049	Um tampão de lavagem e componente de tampão de dissociação de cripta
Mem-NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140050	Componente do meio de cultura organoide
GlutamaxII	Thermo Fisher Scientific	35050061	Componente do meio de cultura organoide
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630080	Componente do meio de cultura organoide
EGF	Millipore Sigma	E9644	Componente do meio de cultura organoide
Noggin	Peprotech	250-38 B	Componente do meio de cultura organoide
R-spondin	R& D	7150-RS-025/CF	Componente do meio de cultura organoide
Insulina recombinante humana	Millipore Sigma	I9278-5ml	Componente do meio de cultura organoide
Nicotinamida	Millipore Sigma	N3376-100G	Componente do meio de transdução
Wnt3A	R& D	5036-WN-010	Componente do meio de transdução
Y27632	Millipore Sigma	Y0503-1MG	Componente do meio de transdução
0,5 M EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Componente do tampão de dissociação de criptas
DTT (ditiotreitol)	Thermo Fisher Scientific	R0861	Componente do tampão de dissociação de criptas
Dispase I	Millipore Sigma	D4818-2MG	Componente do tampão de digestão organoide
DNase I	Millipore Sigma	11284932001	Componente da matriz de tampão de digestão organoide
(fator de crescimento reduzido)	Corning	356231	Usado como matriz para incorporar organoides
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985070	Medium para transfecção na produção viral
ViralMag R / L	Oz Biosiences	RL40200	Partículas magnéticas de transdução viral
Placa magnética	Oz Biosiences	MF10000	Placa magnética para facilitar a transdução viral
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019	Agente de transfecção na produção viral
Poli-D-Lisina	Millipore Sigma	A-003-E	Revestimento para placas antes da semeadura de células 293T
Solução de Formaldeído a 4%	Boster	AR1068	Solução para fixar organoides
O.C.T composto de incorporação	Thermo Fisher Scientific	4583S	Para incorporação dos organoides
5 mL Tubos de poliestireno Falcon	Corning	352054
50 mL Tubos Falcon	Sarstedt	62.547.100
Orbitron rotator II Rocker Shaker	Boekel Scientific	260250
Olympus Microscop invertido CK30	Olympus	CK30	para escanear e contar criptas
Zeiss Axiovert 200 fluorescência invertida	Nikon	Axiovert 200	para visualização de fluorescência nas criptas
Unidade de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 com membrana Ultracel-100	Milipore Sigma	UFC910024	Para concentrar vírus
pluriStrainer 20 µ m (Cell Strainer)	pluriSelect	SKU 43-50020	Para preparar fragmentos de organoides
Falcon Cell Strainer	Fisher Scientific	352340	Para preparar cyrpts de tamanho semelhante após isolamento de cripta
Greiner CELLSTAR  placas de cultura multipoços 48 poços (TC tratado com tampa)	Millipore Sigma	M8937-100EA	ForD2:D37+D16:D37g fragmentos organoides Cepa
animal: C57BL/6J	Jackson Lab	#000664	Para cultura organoide