Method Article

Análise cinética de Vasculogenesis quantifica a dinâmica de Vasculogenesis e angiogênese In Vitro

DOI:

10.3791/57044

⸱

January 31st, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine, 2Herman B Wells Center for Pediatric Research, Indiana University School of Medicine, 3Indiana Center for Biological Microscopy, Indiana University School of Medicine, 4Department of Medicine, Indiana University School of Medicine, 5Department of Pediatrics, Indiana University School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 7Indiana University Simon Cancer Center, Indiana University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para a imagem latente de lapso de tempo, e a análise de vasculogenesis em vitro usando juntamente com o software de fonte aberta, análise cinética de Vasculogenesis de microscopia de contraste de fase. Este protocolo pode ser aplicado para avaliar quantitativamente o potencial de vasculogenic de numerosos tipos de células ou condições experimentais que o modelo de doença vascular.

Abstract

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Vasculogenesis é um complexo processo pelo qual células tronco e progenitoras endoteliais passam por formação de navio de novo . Avaliação quantitativa de vasculogenesis tornou-se uma leitura central de funcionalidade de células progenitoras endoteliais, e portanto, várias tentativas foram feitas para melhorar os modelos de vasculogenesis tanto in vitro e in vivo . No entanto, os métodos padrão são limitados em escopo, com medições estáticas falhando capturar muitos aspectos deste processo altamente dinâmico. Portanto, o objetivo de desenvolver este novo protocolo foi avaliar a cinética de vasculogenesis em vitro para dosar taxas de formação de rede e estabilização, bem como fornecer insights sobre potenciais mecanismos subjacentes vascular disfunção. Aplicação do presente protocolo é demonstrada usando células (ECFCs) expostas a mellitus de diabetes materna de formadoras endotelial fetal. ECFCs fetais foram derivados de sangue de cordão umbilical após o nascimento, culta e banhados em slides contendo a matriz da membrana basal, onde se realizou a vasculogenesis. Imagens dos poços slide inteiro foram adquiridas usando microscopia de contraste de fase de lapso de tempo a mais de 15 horas. Imagens foram analisadas para a derivação de dados quantitativos, usando um software de análise chamado Análise cinética de Vasculogenesis (KAV). KAV usa a segmentação de imagens, seguida por esqueletonização para analisar os componentes da rede de pilhas de imagens de contraste de fase de tempo multi ponto para derivar dez parâmetros (medida 9, 1 calculado) de rede, incluindo estrutura: fechado redes, áreas de rede, Nós, ramos, comprimento total do ramo, comprimento médio do ramo, nós triplo-ramificado, nós quad-ramificado, estruturas de rede e o ramo à relação de nó. Aplicação do presente protocolo identificado alterou taxas de vasculogenesis em ECFCs obtidos de gravidez complicada por diabetes mellitus. No entanto, esta técnica tem grandes implicações para além do âmbito relatado aqui. Implementação desta abordagem vai melhorar a avaliação mecanicista e melhorar funcionais leituras de vasculogenesis e outros processos biologicamente importantes ramificação em numerosos tipos de células ou Estados de doença.

Introduction

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A capacidade de células progenitoras endoteliais submeter-se a vasculogenesis, ou formação de navio de novo , é fundamental no estabelecimento de vasculatura embrionária durante o desenvolvimento1. Além disso, mais formação de navio e maturação dos vasos pré-existentes, que é conhecida como angiogênese, também é um processo fundamental no desenvolvimento e na vida pós-natal para manter o fluxo de sangue e homeostase ao longo do corpo2. Cada órgão do corpo é dependente do sistema vascular para a entrega de oxigênio e nutrientes e para a remoção de resíduos3. Se a homeostase vascular não é mantida, tal que o reparo e a formação de vasos sanguíneos são insuficientes ou em excesso, doenças vasculares podem resultar4. Portanto, adaptação e formação vascular são comumente estudados, que são essenciais na manutenção da saúde do órgão e estão implicados no desenvolvimento de numerosos estados patológicos.

Devido a uma maior compreensão do envolvimento do sistema vascular em desenvolvimento, bem como na progressão e manifestação da doença, os ensaios têm sido desenvolvidos para o modelo vasculogenesis e angiogênese in vitro e em vivo5 ,6,7. Formação de navio de modelagem envolve chapeamento células vasculares, tais como células endoteliais, na matriz da membrana basal que promove a organização celular e a formação de redes de navio a8,9,10. Normalmente, a seguir durante a noite, incubação, imagens de célula redes são capturadas em um ponto único de tempo, resultando em um pequeno número de imagens para análise11,12,13. Portanto, abordagens analíticas em grande parte foram desenvolvidas e otimizadas para tempo único ponto avaliações10,14. No entanto, análises estáticas são simplesmente insuficientes para capturar o processo dinâmico da formação de vasos e fornecem informações limitada sobre potenciais mecanismos envolvidos. Embora aumentando a frequência de imagem provavelmente iria fornecer os dados necessários para identificar a cinética de formação, aplicação de análise previamente desenvolvido para um ponto multi tempo imagem abordagem seria ineficiente e mão de obra intensiva14. Além disso, apesar do desenvolvimento de análises disponíveis comercialmente, uma taxa de pagamento-por-imagem processa esta opção custo proibitivo para estudos cinéticos, em que milhares de imagens são gerados15. Portanto, há uma necessidade no campo para uma abordagem simplificada e eficiente capturar e quantificar vasculogenesis em vitro, incluindo a capacidade de analisar conjuntos de grande imagem gerados pela microscopia de lapso de tempo célula viva.

Para superar essas limitações, uma nova abordagem foi desenvolvida com o objetivo de expandir o tempo único ponto imagem para permitir a avaliação dinâmica de vasculogenesis com imagens adquiridos a cada 15 min de16. Através da captura de vários pontos de tempo ao longo de várias horas, essa abordagem fornece uma descrição mais detalhada do processo de vasculogenesis, bem como insight sobre potenciais mecanismos que contribuem para a formação e manutenção de redes de navio. Além de melhorar a frequência e a qualidade de aquisição de imagem, esta abordagem incorpora software de romance na forma de um plug-in de código-fonte aberto17. O software, referido como cinética análise de Vasculogenesis (KAV), é uma aplicação simplificada que incorpora o processamento de imagem e análise especificamente para moda grande imagem gerada a partir de aquisições tempo multi ponto. KAV analisa imagens de contraste de fase através da segmentação de imagens, seguido por esqueletonização,18. Dez parâmetros de estrutura de rede são quantificados por KAV incluindo: Ramos, redes fechadas, nós, áreas de rede, estruturas de rede, nós triplo-ramificado, nós quad-ramificado, comprimento total do ramo, comprimento médio do ramo e o ramo à relação de nó (ver esquemática na Figura 1)16. Aplicação da abordagem de KAV inclui um fenótipo de novela, calculado de em vitro vasculogenesis, conhecido como o ramo à relação de nó. Nossos trabalhos recentes demonstraram que esta proporção é indicativa de conectividade de rede e pode estar associada a outros processos celulares envolvidos na formação de rede, tais como motilidade,16.

Embora fetal endotelial formadoras de célula (ECFC) vasculogenesis foi avaliada nestes estudos, esta abordagem de aquisição e análise de imagem pode ser prontamente aplicada para avaliar quaisquer tipos de células que passam por vasculogenesis ou angiogênese. Além disso, esta abordagem pode ser usada para identificar a alteração da função vascular resultante de uma variedade de estados patológicos, tais como diabetes mellitus gestacional, como mostrado nestes estudos. Além disso, este método pode ser adaptado para avaliar a formação de rede e ramificações, que são importantes para outros processos biologicamente relevantes. Assim, o impacto potencial de aplicação desta nova abordagem de sistemas biológicos exclusivos ainda está para ser determinado.

Protocol

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1. preparações

  1. Cultura endotelial formadoras de células (ECFCs)
    Nota: Amostras ECFC Fetal usadas nesses experimentos foram isoladas de sangue humano do cordão umbilical e cultivadas por BioCore a Angio (ABC) na Indiana University School of Medicine, como descrito anteriormente,6. Fenotipagem de rotina de controle de qualidade foi realizada dentro do ABC para confirmar a expressão de antígenos endoteliais como descrito anteriormente19,20,21. As amostras utilizadas nos experimentos foram passadas minimamente (2 - 3 vezes). Todo trabalho de cultura de tecidos foi realizado em uma capa de cultura de tecidos. Todos os reagentes, incluindo placas de cultura de tecidos e soluções, eram estéreis.
    1. Dois dias antes do experimento, casaco 100mm redonda placas de cultura de tecido com 6 mL de colágeno do tipo 1 de 0,05 mg/mL e incubar a 37 ° C durante a noite.
      Nota: Colágeno tipo 1 é diluído em água bidestilada, contendo 20 nM de ácido acético a uma concentração de trabalho de 0,05 mg/mL.
    2. O dia antes do experimento, trypsinize e replate ECFCs com as placas do tipo 1 colágeno revestida em 1.1.1. (Ver nota abaixo dos 1.1).
    3. Para trypsinize ECFCs, mídia de células chapeadas de aspirar e lavar com 7 mL de PBS. Aspire PBS, em seguida, adicionar 2-3 mL de 0.5% tripsina e incubar as células por 2-5 min a 37 ° C.
    4. Imediatamente após a incubação com tripsina, adicionar 3 mL de EGM2 e pipetar acima e para baixo para desalojar todas as células aderentes. Transferi a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL.
    5. Centrifugar as amostras a 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
    6. Aspire o sobrenadante e ressuspender pelotas de célula em 1-2 mL de EGM2. Homogeneizar a suspensão de células e remover uma pequena alíquota (20-40 μL) para a contagem.
    7. Adicionar partes iguais trypan azul à alíquota de célula e pipetar 10 µ l em um hemocytometer. Conte o número de células nos quatro quadrantes primários do hemocytometer.
      Nota: Use ambos os lados do hemocytometer para todas as acusações de amostra para aumentar a precisão.
    8. Lave as placas de cultura de tecido colágeno-revestido, que foram preparadas na etapa 1.1.1, duas vezes, com 7 mL de PBS. Depois de aspirar a segunda lavagem PBS, adicionar 10 mL de meio de crescimento endotelial 2 (EGM2) cultura mídia suplementada com 10% de soro bovino fetal para as placas.
    9. Usando a contagem de células obtida na etapa 1.1.7, calcule o volume da suspensão de células necessária para células de placa 4 x 105 . Placa 4 x 105 ECFCs sobre as placas de cultura de tecidos preparados na etapa 1.1.8 e incubar a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono (CO2) durante a noite.
  2. Antes do experimento, armazenar suprimentos em 4 °C durante a noite
    1. Armazene uma 3 "x 2" placa de metal, slide (manter em pacote até abrir no capô), uma caixa de estéril 20 dicas microlitro (µ l) e a matriz da membrana basal (matriz).
      Nota: A matriz é mantida a-80 ° C para armazenamento a longo prazo; sempre descongele a 4 ° C durante a noite ou durante várias horas antes de usar.
  3. Confirme a disponibilidade de espaço adequado para as imagens em discos rígidos do computador.
    Nota: Usando a configuração descrita no presente protocolo, cerca de 60 gigabytes (GB) de espaço foram requeridos por experiência (4 GB/poço). No entanto, as estimativas de espaço baseiam-se na configuração de hardware e terá de ser determinado para cada sistema.

2. Protocolo 1: Instalação Experimental: preparando o Slide

  1. Coletar e preparar suprimentos
    1. No dia do experimento, recolher suprimentos para chapear pilhas do slide, incluindo um balde de gelo, um pequeno recipiente de gelo seco, um par de tesouras e uma pipeta de 20 μL. Spray todos os itens com 70% de etanol, seque com papel toalha e coloque itens em uma capa de cultura de tecido estéril.
    2. Reunir todas as fontes armazenadas a 4 ° C (consulte a etapa 1.2) incluindo a placa de metal, caixa de sugestões, slide e matriz. Pulverizar caixa de dicas com 70% de etanol e coloque a caixa no recipiente de gelo seco.
      Nota: Remova a matriz da 4 ° C geladeira somente quando estiver pronto para usar e manter sempre a matriz no gelo.
    3. Pulverizar a placa de metal com 70% de etanol e incorporá-lo no gelo no balde de gelo. Abra o pacote contendo o slide e coloque o slide sobre a placa de metal para mantê-lo frio.
  2. Matriz de carga para o slide
    1. Definir a pipeta de 10 μL e retire a ponta do caixa ponta fria com a pipeta. Corte aproximadamente 1 cm da extremidade da ponta com a tesoura.
      Nota: corte perpendicular à ponta para reduzir as bolhas na matriz. A pipeta pode ser definida como um volume ligeiramente maior do que 10 μL para contabilizar matriz degola para o interior da ponta.
    2. Lentamente, atrair a matriz para a ponta da pipeta. Imediatamente, coloque a ponta da pipeta no centro do poço. Tocar suavemente a ponta da pipeta no fundo do poço e empurrar lentamente a matriz para fora.
      Nota: faça não sobre pipeta, como isto causará bolhas de forma. Se uma forma de bolha, colocá-la imediatamente, usando uma pequena dica.
    3. O slide contém 15 poços individuais. Repita a etapa anterior para cada poço. Use uma ponta de pipeta nova para cada poço para manter a consistência e reduzir a matriz solidificando dentro a ponta.
    4. Assim que o slide é carregado com todos os poços que contém a matriz, empurre a tampa até no slide e incubar a 37 ° C por 30-60 min, até que a matriz se solidifica.
      Nota: Não deixa a matriz secar. Adicione um volume pequeno (2-3 mL) de PBS na tampa de um tubo cónico de 50 mL, perto do slide na incubadora para reduzir o risco de matriz de secagem.

3. protocolo 2: Chapeamento ECFCs na matriz

  1. Remover o aderente ECFCs de placas de cultura de tecidos e recolher em suspensão
    1. Obter cultura do tecido placas contendo os ECFCs chapeadas no dia anterior (consulte a seção 1.1.9). Aspire EGM2 mídia e lavar aderente ECFCs uma vez com 7 mL de PBS.
    2. Aspire o PBS, adicionar 2-3 mL de tripsina e incubar as células aderentes para 2-5 min a 37 ° C.
    3. Imediatamente após a incubação, adicionar 3 mL de EGM2 e pipetar acima e para baixo para desalojar todas as células aderentes. Transferi a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL.
    4. Repita etapas 3.1.1-3.1.3 para as restantes três amostras ECFC até que todas as amostras de quatro células são coletadas em suspensão.
  2. Preparar a mistura de mestre
    1. Centrifugar as amostras a 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
    2. Aspire o sobrenadante e ressuspender pelotas de célula em 1-2 mL de EGM2.
    3. Homogeneizar a suspensão de células e remover uma pequena alíquota (20-40 μL) para a contagem.
    4. Adicionar partes iguais trypan azul à célula alíquota e adicionar 10 μL em um hemocytometer. Conte o número de células nos quatro quadrantes primários do hemocytometer.
      Nota: Use ambos os lados do hemocytometer para todas as acusações de amostra para aumentar a precisão.
    5. Usando a célula conta de cima, calcular o volume de cada amostra de células que contém as células de4 1.4x10. Homogeneiza todas as suspensões celulares e alíquota 1.4 x 104 células para um tubo de fresco para preparar uma mistura de mestre para cada condição experimental. Adicione mídia EGM2 para que o volume final da mistura cada mestre é 175 μL.
    6. Misture cada mestre mistura delicadamente pipetagem e alíquota de 50 μL de mistura mestre em poços individuais no slide.
      Amostras de nota: todos são banhadas em triplicado, com misturas de mestre calculadas para 3,5 poços assegurar um volume suficiente para 3 poços.
  3. Incubar o slide
    1. Incube o slide a 37 ° C, até que ela pode ser movida para a câmara de microscópio para a imagem latente.
      Nota: O tempo entre a imagem e chapeamento deve ser tão breve quanto possível limitar a perda de dados durante os estágios iniciais de vasculogenesis.

4. protocolo 3: Configuração do microscópio e aquisição de imagem

Nota: Para nossos estudos, protocolos 2 e 3 foram realizadas simultaneamente por indivíduos separados. Se os protocolos 2 e 3 devem ser concluídas pelo mesmo indivíduo, protocolo 3 etapas 4.1 e 4.2 abaixo devem ser concluídas antes de iniciar o protocolo 2 acima.

  1. Ligar o microscópio e o computador
    1. Aproximadamente uma a duas horas antes de iniciar o experimento, ligar e pré-aqueça a incubadora de estágio superior a 37 ° C, defina o CO2 a 5% e definir a umidade de 85%. Encha o reservatório de humidade da incubadora, se estiver vazio.
    2. Coloque um slide vazio septado em uma das duas posições abertas e encha com água destilada. Fixe o termômetro de gabarito para controle de temperatura da câmara, se disponível.
      Nota: Se o termômetro do gabarito está disponível, use esta temperatura de"incubadora" para verificar que a câmara tem incubado.
    3. Liga um ventilador secundário definido como 39-42 ° C para aquecer os slides abaixo e minimizar a condensação.
    4. Adicione um segundo slide como um espaço em branco até que o slide experimental pode ser adicionado. Este slide serve como um espaço reservado local para configuração, as configurações de aquisição de imagem para poços individuais durante a instalação.
    5. Adicione água para o reservatório em torno dos poços no segundo slide para imitar as condições durante o experimento de imagem. A água ao redor dos poços permite a avaliação da umidade durante a instalação do microscópio e pré-aquecimento.
      Nota: Pré-equilíbrio da incubadora de palco-top e soprador secundário é essencial para manter um ambiente estável de cultivo. A maioria dos controladores de câmara de célula viva dar feedback em tempo real da temperatura, CO2e umidade para avaliar a prontidão do sistema. Antes de continuar, verifique se há o acúmulo de umidade no slide e secagem excessiva do reservatório como preenchido 4.1.5. Umidade pode precisar ser ajustada se houver excesso de secagem ou condensação na câmara. Para aumentar a umidade, adicione toalhetes humedecidos com água destilada. Para diminuir a condensação, diminuir o ajuste da umidade ajustada em 4.1.1, ou como condensação pode ser um sinal de baixa temperatura, verifique as configurações de temperatura de câmara e o posicionamento do soprador secundário.
  2. Configure definições de aquisição de imagem básica durante a equilibração.
    Aquisição de nota: a imagem é configurada através do software que controla o palco, obturador e câmera. Uma ferramenta de configuração multidimensional é a maneira mais fácil de configurar o software. Além disso, o software precisa ter autofocus rotinas para garantir o controle de foco ao longo da duração do experimento.
    1. Use o software para definir várias posições de estágio para cada poço. Para este protocolo, selecione o centro dos poços.
    2. Configure a aquisição de imagem tal que em cada posição do palco, todo o bem é fotografada. Por exemplo, use um tilescan com 10-20% de sobreposição de imagem e campos de aproximadamente 5 x 5, dependendo da câmera e ampliação final.
    3. Configure o lapso de tempo para a imagem a cada 15 min.
      Nota: Usando a configuração descrita no presente protocolo, todos os 15 poços do slide são fotografados dentro de um intervalo de 15 min.
  3. Carregar o slide experimental
    1. Sequência de equilibrio da câmara incubadora, substitua o slide em branco com o slide experimental.
      Nota: uma câmara equilibrada terá temperatura estável, CO2e umidade pelo menos 20 min. Uma vez que o slide experimental está pronto, é imperativo que etapas sejam concluídas rapidamente para minimizar o "tempo morto" entre o chapeamento e o ponto inicial do tempo capturado pelo microscópio. Além disso, para facilitar a comparação entre as experiências de imagens, desta vez deve ser coerente. Nesses experimentos, todos os passos descritos no protocolo 3 seção 4.3 necessários cerca de 30 min para completar.
    2. Remova a tampa do slide e adicionar água para o reservatório em torno dos poços no slide.
      Nota: A tampa é removida para a duração da experiência de imagem.
  4. Configurar definições de aquisição de imagem final
    1. Coloque o objetivo do plano TPI Fluor DL 10 X na posição e selecione o Ph1 anel de fase no condensador. Com o primeiro poço em foco, ajustar o trajeto da luz para a iluminação de Köhler diascópica e configurar óptica de fase, verificando o alinhamento do anel de fase no condensador com a máscara de fase objetiva.
    2. Configurar o tempo de exposição e ajustar a intensidade da lâmpada para contraste de fase, que geralmente é menos de 500 ms.
    3. Percorrer cada conjunto de posição de palco em 4.2.1 e confirmar que o centro do poço é selecionado e ajustá-lo, se necessário.
    4. Em cada posição de fase, concentrar-se nas células chapeado no poço e definir a posição de z a posição palco usada para tratamento de imagens no software.
    5. Teste o mecanismo de foco automático para o microscópio. Se o foco automático é hardware com base, certifique-se posicionado corretamente para todas as posições de estágio e está em.
      Nota: como o espécime e o palco podem derrapar verticalmente durante o experimento, é importante que o software Verifique a focagem automática em cada posição de fase e cada ponto de tempo para garantir a imagem confiável durante o curso de tempo. Se possível, uma posição de autofocus determinada no ponto anterior de tempo deve ser usada como ponto de partida para a rotina de autofocus subsequentes. Desta forma, deriva em curso pode ser ajustada para facilmente.
    6. Reduzir ou extinguir as luzes na sala de microscópio e iniciar a experiência de imagem.

5. protocolo 4: Imagem análise cinética e processamento de Vasculogenesis (KAV)

  1. Salvar imagens de pontos de tempo individuais como uma pilha de imagem para cada poço
    Nota: a maioria dos softwares para captura de imagem pode exportar multi-páginas TIFF (stacks) da série de tempo. KAV é projetado para trabalhar em conjuntos de dados que podem incluir vários pontos de tempo. Assim, a análise ocorre na pilha de imagem inteira para uma posição determinada fase. Se necessário, o software de processamento de imagem pode importar imagens isoladas de cada ponto de tempo para reconstruir uma pilha de imagem.
  2. Abra a software do computador de processamento de imagem
  3. Adicionar o KAV para a software de processamento de imagem
    1. Arraste o arquivo KAV de uma pasta para a barra cinza na parte inferior da janela do software. Clique em 'Salvar' para adicionar o software à lista.
  4. Abrir a pilha de imagem para ser analisado
    1. Clique em 'arquivo' e depois 'Open' através do menu dropdown no software de processamento de imagem, ou arrastar o arquivo de imagem para a barra cinza como na etapa 5.3.1.
    2. Converta as imagens de 8 bits, clicando em 'Imagem', 'Tipo', '8 bits'.
  5. Criar uma região de interesse (ROI)
    1. Abra o Gerenciador de ROI, clicando em 'Analisar' na barra de ferramentas. Em seguida, selecione 'Ferramentas', seguidas por ' ROI Manager'.
    2. Crie um novo ROI clicando sobre os círculo ou retângulo ferramentas de seleção na barra de ferramentas e desenho da área de seleção desejada na imagem. Clique em 'Adicionar' na janela de Gerenciador de ROI para salvar essa forma.
      Nota: Um ROI criado anteriormente pode ser aberto, arrastando salvou ROIs (pasta zipada) na barra de 'Arrastar e soltar' para abrir no Gerenciador.
    3. Clique na etiqueta do ROI listada no Gerenciador de ROI para visualizá-lo na imagem.
      Nota: Se o ROI não aparece na imagem, criar um segundo ROI (qualquer tamanho/forma) e adicioná-lo ao gerente. Uma vez que ambos ROIs aparecem na lista, clique em e para trás entre os dois e o ROI desejado aparecerá na imagem.
    4. Se necessário, alinhe o ROI. Uma vez que o ROI está no lugar da imagem no local desejado, vá ao Menu e clique em 'Editar' então 'Clara lá fora'. Isto irá apagar os dados da imagem fora o ROI (útil para as formas não-retangulares) para cada imagem na pilha.
      Nota: Você também pode clicar em 'Imagem' e 'Cultura' se você estiver usando um rectangularly em forma de ROI.
  6. Executar o software do KAV
    1. Clique em 'Plug-ins' na barra de menus.
    2. Selecione a rede 'analisar' plug-in. Isto abrirá uma janela com opções para alterar as configurações do plug-in.
    3. Altere o método de limiarização usando o drop-down seta.
    4. Uma vez que todas as configurações apropriadas são selecionadas, clique em 'Okey' para iniciar o processamento de software.
      Nota: As configurações apropriadas são determinadas através da visualização de representações esqueleto e máscara gerada pelo KAV, que indicam o accurary do software para identificar e distinguir células e redes de fundo da imagem de contraste de fase.
  7. Salvar os dados gerados pelo KAV
    1. Uma vez o plug-in terminou a análise, duas janelas irão surgir na tela, incluindo uma tabela de dados com valores numéricos e uma pilha de imagens fundidas, retratando representações de esqueleto e máscara.
    2. Salvar os valores numéricos, navegando para o canto superior esquerdo da tabela de dados e clicando em 'Editar' então 'copiar' ou 'Cortar' para colar valores em uma planilha do excel.
    3. Clique sobre a imagem fundida de esqueleto e máscara. Salve a pilha de imagem fundida esqueleto/máscara como um arquivo de Tagged Image File Format (TIFF), clicando em 'Arquivo,' 'Salvar como',' 'TIFF'.
    4. Salvar o contraste de fase recortada da imagem pilha (criado usando ROI) clicando em 'Arquivo.,' 'Salvar como',' 'TIFF.'
    5. Clique na janela do ROI Manager e selecione o ROI usado para recortar as imagens. Clique em 'Mais' seguido de 'Salvar' para salvar o ROI para uso futuro.
      Nota: Usando o mesmo ROI ajudará a manter a coerência entre as análises.

Results

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KAV produz representações visuais de estrutura de rede
O contraste entre as ECFCs e ao fundo a matriz nas imagens de contraste de fase permite KAV identificar estruturas de células específicas. Redes ECFC identificadas por KAV são representadas pictoricamente como representações de esqueleto e máscara para ilustrar as estruturas usadas pelo software para quantificação(Figura 2). Importante, avaliação qualitativa das representações esqueleto e máscara permite a identificação rápida de KAV sensibilidade e precisão, que pode ser útil para determinar as configurações de limite ideal e interpretar os resultados da análise. Quando a qualidade das imagens de contraste de fase é alta e contraste suficiente é alcançado, KAV identifica com precisão as redes ECFC, conforme indicado pela semelhança entre a imagem de contraste de fase e os KAV gerado pelo esqueleto e máscara representações (Figura 2 A e vídeo 1).

Como alternativa, se imagens de contraste de fase não tem alto contraste e/ou artefatos de imagem tais como gridding ocorrem, precisão de deteção de rede é reduzido e os resultados se tornam ambíguas (Figura 2B). Além disso, a formação de bolhas de ar dentro da mídia de célula também pode obscurecer a precisão de deteção (Figura 2). No entanto, problemas com qualidade de imagem muitas vezes podem ser superados através da seleção dos métodos de limiarização diferentes incluídos no software KAV. Por exemplo, a imagem de contraste de fase em Figura 2B foi analisada usando as configurações de processamento de imagem idênticas exceto o método limiarização. As representações de esqueleto e máscara, é evidente que a limiarização de Otsu resultou em uma detecção mais precisa das redes ECFC mostrado na imagem de contraste de fase (Figura 2B). Portanto, a qualidade da imagem é fundamental para alcançar resultados precisos e significativos neste ensaio. No entanto, métodos diferentes de limiarização incluídos na interface de usuário do KAV permitam ajuste de análise de imagens baseado na qualidade das imagens entradas.

Microscopia de lapso de tempo identifica diferenças qualitativas e quantitativas em ECFC vasculogenesis após a exposição intra-uterina diabetes mellitus gestacional
Recentemente, a abordagem analítica KAV foi aplicada para avaliar a função ECFC fetal após a exposição a materna tipo 2 diabetes mellitus (T2DM) no utero16. Usando o KAV, cinética alterada de vasculogenesis foram identificados em ECFCs do feto expostos a T2DM. No entanto, além do T2DM exposição, que ocorre durante a gestação inteira, diabetes mellitus gestacional (GDM) ou o desenvolvimento de intolerância à glicose comumente no terceiro trimestre da gravidez, também prejudica ECFC função13. Portanto, KAV foi aplicado para determinar se ECFCs GDM-expostos também exibir alterada cinética de formação de rede ECFC. Fase 1 (0-5 h) e fase 2 (5 + h) foram avaliados usando tempo microscopia de lapso juntamente com análise KAV (Figura 3). Imagens de contraste de fase representativa adquiriram no início da aquisição de imagens (0,50 h) e ao longo do curso do tempo (5,00 e 10,00 h) retratam a formação de rede ECFC nas quatro amostras testado a partir de um único dia experimental (Figura 3 e Video 1 ). Apesar de célula equivalente a carregar, como observado nas imagens de contraste de fase em 0,50 horas, diferenças qualitativas na estrutura de rede são evidentes nos pontos de tempo de 5,00 e 10,00 horas. ECFCs de gravidez sem complicações (UC) formam uma rede intrincada e complexa 5 horas pós-chapeamento, semelhante ao nosso dados previamente publicados16. Por outro lado, ECFCs do GDM amostra 1 formulário (GDM1), que muito poucos rede de estruturas que não estão interligadas. No entanto, esse padrão não é refletido em todas as amostras ECFC obtidas de gravidezes GDM, indicativos de heterogeneidade entre amostras. Amostras GDM2 e GDM3 exibem maior formação de rede, em comparação com GDM1, embora os padrões de conectividade aparecem alterados em comparação com a amostra UC. Importante, KAV mede vários componentes estruturais das redes ECFC para identificar fenótipos óbvios e sutis.

Além de gerar representações de esqueleto e uma máscara de estrutura de rede, KAV dosa dez métricas de estrutura de rede, incluindo o número de estruturas de rede individual, nós, nós de triplo-ramificado, nós quádruplo-ramificado, ramos, totais comprimento do ramo, comprimento médio da filial, filial à relação de nó, total fechado redes e rede área16. KAV compila os dados para cada amostra em uma única tabela de valores para todas as imagens do curso de tempo. A tabela 1 inclui dados brutos representativos de um estudo da imagem para uma amostra ECFC. Parâmetros de estrutura de rede, medido pelo KAV são organizados em colunas, e os dados para imagens sequenciais que adquiriu ao longo do tempo são organizados em linhas. Por exemplo, em nossos estudos, imagem 1 obteve-se 30 min pós-chapeamento com imagens subsequentes ser recolhidos todos os valores de 15 min. Raw gerados pelo KAV pode então ser graficamente ou mais analisados usar estatística mais complexo se aproxima de16.

Cinco gráficos retratando valores médios de estrutura de rede de três experimentos separados são mostrados para uma única amostra sem complicações (UC) e as três amostras do GDM (Figura 4). A amostra UC nestas experiências realizadas da mesma forma que anteriormente analisado UC amostras16. Anteriormente, foi identificado que ECFC vasculogenesis em vitro é bi-fásicos, consistindo de fase 1 (0 - 5 h) e fase 2 (5-10 h)16. Este padrão é consistente nos estudos atuais, como evidenciado pelo gráfico representando dados rede fechada (Figura 4). A amostra UC formado um número maior de redes fechadas em comparação com as três amostras do GDM. Curiosamente, três das quatro amostras parecem ter um tempo similar para o número máximo de redes fechadas, que ocorre entre 2,5 e 3 horas. No entanto, a amostra de GDM2 era mais lenta atingir a máximas redes fechadas, que ocorreu 5 horas pós-chapeamento. E, apesar da amostra GDM2 formando redes de máximas menos em comparação com a amostra UC, as redes de forma foram mantidas da mesma forma para a amostra UC ao longo do tempo. Por outro lado, GDM1 e GDM3, que formaram redes menos em comparação com a amostra UC, também exibiram uma redução geral no número de rede ao longo do tempo. No geral, o gráfico representando o número de rede fechada, é evidente que todas as amostras ECFC demonstraram um padrão bi-fásicos de formação de rede, no entanto, a taxa de formação e o número máximo de redes alcançado variam entre amostras.

Área de rede representa a área média dentro das redes fechadas formadas pelos ECFCs. Portanto, quanto maior for a rede fechada número, menor as áreas de rede. Esse padrão se reflete nos gráficos de área a rede onde a amostra UC, que formou um número maior de redes fechadas, tinha áreas de rede menores ao longo do tempo, em comparação com as três amostras do GDM (Figura 4). GDM2, que atingiu a máxima de redes fechadas mais lentamente, exibido área alta rede inicialmente, no entanto a área estabilizado ao longo do tempo e isso era mais semelhante da amostra UC às 15 horas. Ao longo do tempo, a área de rede média em todas as amostras aumentou devido à estabilização da rede. No entanto, algumas amostras, como GDM1 e GDM3, exibiram um aumento mais rápido na área de rede, que é provavelmente indicativo da diminuição da estabilidade, em comparação com outras amostras, exibindo um aumento mais gradual.

GDM-expostos ECFCs apresentam estabilidade de rede reduzida
A relação de filiais para nós é um fenótipo novo calculada por KAV e identificado em nossos estudos anteriores, e isto é indicativo de conectividade de rede16. No estudo atual, a amostra UC tinha uma relação baixa, o que representava um alto nível de conectividade de rede que foi mantida ao longo do tempo (Figura 4). Por outro lado, as três amostras GDM tinham uma proporção maior de ramos para nós, especialmente na fase 2 da formação de rede. Esta observação demonstra a estabilização das estruturas de rede e conectividade reduzida.

Em geral, GDM1 formado menos nós e ramos em comparação com as outras amostras, com a redução mantida ao longo do experimento. GDM2 e GDM3 formaram e mantiveram um maior número de ramos em comparação com a amostra UC, especialmente entre 5-15 h. O número de nós detectados nas redes GDM2 e GDM3 foram mais parecido com o número de nós no exemplo de UC, especialmente entre 10-15 h. Um maior número de ramos, mas um número semelhante de nós, pode explicar o ramo aumentou a proporção de nó evidente nos pontos de tempo mais tarde, nas amostras de GDM. Importante, alterações simultâneas no ramo e nó número podem ser difíceis de interpretar em gráficos separados. No entanto, a filial romance à relação de nó oferece uma forma de avaliar como as alterações, incluindo pequenas mudanças difíceis de detectar nos gráficos individuais, em número tanto o ramo e o nó, resultam na conectividade da rede alterado.

figure-results-1
Figura 1 : Esquema de estrutura de tópicos 10 parâmetros quantificados pela análise cinética de Vasculogenesis (KAV). KAV dosa dez parâmetros distintos de estrutura de rede. Todos os parâmetros são codificados por cores e descritos no esquema numericamente (1-10). Parâmetros incluem o número de redes de ramos (verde, 1), fechados (azul, 2), e nós (vermelho, 3), média de área de rede (laranja, 4), o número de estruturas de rede (preto, 5), nós de triplo-ramificado (amarelo, 6) e nós quad-ramificados (roxo, 7), bem como total (9) e comprimento médio do ramo (10) e a relação entre o número de ramos para o número de nós (10). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2 : Análise cinética de Vasculogenesis (KAV) dosa a estrutura de rede. (A) esqueleto e máscara representações de estruturas de rede identificadas por KAV utilizando imagens de contraste fornecem uma representação visual de estruturas de rede identificado e quantificado por KAV. Barra de escala = 500 µm. (B) uma imagem de contraste de fase representativa de ECFC redes 10 h pós-chapeamento com baixo contraste e grade marca de costura imagens individuais juntos. Métodos de limiarização diferentes, tais como média ou Otsu, podem ser selecionados no KAV plug-in para melhorar a precisão de quantificação, se imagens de contraste de fase tem baixo contraste ou se gridding ocorre. Esqueleto e máscara representações da imagem de contraste de fase são mostradas para métodos de limiarização tanto média e Otsu. Imagens de contraste de fase foram capturadas usando um objectivo X 10. Barra de escala = 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3 : Exposição intra-uterina GDM altera a formação da rede de ECFC. Imagens da formação de rede ECFC foram capturadas em intervalos de 15 min para 15 h por microscopia de contraste de fase. Imagens de contraste de fase representativa em incrementos de 5 h, começando no momento do chapeamento (0,5 h), são mostradas para a UC e três amostras do GDM. Imagens de contraste de fase foram capturadas usando um objectivo X 10. Barra de escala = 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4 : ECFCs expostos a cinética de formação de rede de exibição alterada intra-uterino GDM. ECFCs foram obtidos de uma gravidez sem complicações (UC, preto) e três gestações complicadas por diabetes mellitus gestacional (GDM 1-3, vermelha). Imagens de contraste de fase foram capturadas em redes de intervalos para 15 h. software de análise cinética de Vasculogenesis (KAV) quantificado fechados de 15 min, áreas de rede, ramos, nós e a relação dos ramos para nós. Os dados ilustrados representam média ± erro padrão da média (SEM) de três experimentos separados para cada amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Vídeo 1: Exposição intra-uterina GDM altera a cinética de formação de rede ECFC. Imagens da formação de rede ECFC foram capturadas em intervalos de 15 min para 15 h por microscopia de contraste de fase. Imagens de contraste de fase são mostradas para a UC e três amostras GDM mais 15 h Iniciando em 0,5 h. Barra de escala representa 500 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

ImagemFilial total redesNósTriplosQuádruplosRamosComprimento total Branch *Comprimento de ramificação AVG *Filial à relação de nóRedes fechadasÁrea de rede * *
138229027811943472101243,259480214
22843453378940506991792,7216264469
32053763669910557282722.4227150621
416242240715947596923682.244098713
513245444112967619234692.135372951
612243541914907625875132.096856948
78842941117852639837271.997451429
86845143713874639609411,947451780
99343741718905609016552,074982919
10126511487241075619814922.137116857
1149397384127376182312621,867948805
1281376364107515681770126364431
1398509482261028607996202.024498056
149344941631909582826272.024594081
* arredondado para mais próximo micron, * * arredondado para mais próximo micron ^ 2

Tabela 1: Representante dados brutos da imagem latente de um estudo para uma amostra ECFC.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KAV permite a avaliação de grandes conjuntos de dados com vários pontos de tempo
Tradicionalmente, a quantificação de vasculogenesis em vitro tem consistia de uma única ou algumas medições de ponto de tempo. Esta abordagem estática é simplesmente insuficiente para capturar e quantificar um processo dinâmico e complexo. Portanto, este novo método foi desenvolvido para permitir análises eficientes da cinética de formação de rede para ganhar a introspecção em potenciais mecanismos moleculares envolvidos no processo dinâmico de vasculogenesis. Eficiência e automação são componentes importantes no desenvolvimento de novas técnicas para gerar e analisar grandes quantidades de dados de imagem. KAV foi desenvolvido especificamente para analisar pilhas de imagem grande, composto por centenas de imagens para diminuir o tempo e o trabalho necessário para derivar conclusões biologicamente significativas de conjuntos de dados de lapso de tempo. Importante, KAV realiza processamento de imagem e geração de dados em questão de segundos para pequenas (menos de 100 imagens) imagem pilhas e minutos para maiores (mais de 100 imagens) pilhas, resultando em eficiência sem paralelo da imagem. Além disso, a organização de dados em planilhas por tempo e parâmetros medidos permite rápida geração de apresentação gráfica e análise estatística.

Desafios na aplicação bem sucedida desta abordagem
Embora este ensaio inclui melhorias para aquisição de imagens e análise, alguns desafios podem impedir a implementação bem sucedida. Os quatro principais obstáculos incluem a estabilidade de umidade, precisão de cronometragem de chapeamento de aquisição de imagem e confiabilidade do hardware, software e gestão de grandes conjuntos de dados gerados para cada experimento. Imagem de célula viva estável durante várias horas pode ser um desafio. Especificamente, umidificação adequada e consistente é necessária para as câmaras de imagem. Slides de angiogênese são usados neste ensaio, que são projetados para paralelizar ensaios baseados na matriz de angiogênese. Seu baixo volume, aproximadamente 50 µ l, torna a evaporação e condensação considerações significativas para as condições de cultura estendida. Para combater esse problema experimental, é necessário utilizar uma incubadora que regula a umidade. No entanto, também pode ser necessário aumentar este regulamento se secagem excessiva da câmara de imagem ocorre ao longo do tempo. Nós achamos que a abordagem mais simples para aumentar a umidade é aumentar a área de superfície de água na câmara. Para atingir essa meta, o nosso protocolo sugere as seguintes três fontes de água: um segundo slide septado cheios de água, que é também onde a temperatura da incubadora é medida, água na zona em redor dos poços no slides e papel de filtro molhado ou toalhetes. Por outro lado, a condensação ocorre quando a temperatura do ar no quarto esfria o fundo do slide e a umidade dentro da câmara de condensa-se sobre as lâminas e os poços. Esta complicação pode levar a uma diluição dos meios de comunicação celular e um efeito de lente que interfere com o contraste de fase. Nestes estudos, condensação foi minimizada através da aplicação de ar aquecido (39-42 ° C) na parte inferior do slide.

Uma consideração chave para qualquer estudo de lapso de tempo é a coerência entre o início do experimento e a imagem latente. O timing de quando começa a imagem é fundamental para a interpretação dos acontecimentos a jusante. Para garantir a precisão da temporização deste teste, o tempo entre o chapeamento inicial e o primeiro ponto de imagem tempo deve ser rigidamente controlado. Na prática, esse "tempo morto" pode ser minimizado, mas mais importante, ele precisa ser consistente para permitir experiências em dias diferentes, para ser comparado. Por exemplo, neste protocolo, esperamos um tempo morto de cerca de 30 min. Isto pode ser facilitado pela proximidade de instalações de imagem e preparação experimental.

O que pode parecer detalhes mundanos, à primeira vista, são importantes para a estabilidade hardware, software e gerenciamento de dados. O software e drivers de hardware associado, ambiente de rede e software automatizado atualiza todas afetam a estabilidade do software. Vale a pena testar este protocolo em um "dry run" para identificar gargalos e potenciais fontes de problemas na aquisição da imagem; por exemplo, verificar para instalação confiável de células vivas, confiabilidade de palco, obturador e câmera e as políticas de tecnologia de informação institucional sobre o sistema operacional automatizado e atualizações de software.

Gerenciamento de dados é uma preocupação constante de qualquer experiência de imagem que gera centenas de milhares de imagens. Felizmente, muitas vezes software comercial verifica se há espaço disponível antes de iniciar uma experiência de imagem. No entanto, este ensaio também inclui imagem de pós-captura processamento e análise que pode adicionar para o fardo de espaço de disco rígido e interferir com a imagem de experimentos, se o espaço disponível é limitado. Além disso, a segurança e a estabilidade do computador não podem ser garantidas, mesmo com soluções de hardware, tais como uma matriz redundante de discos idênticos. Assim, uma estratégia de gerenciamento de dados para garantir espaço nos discos rígidos do computador para experiências em curso e um robusto remoto arquivamento, por exemplo, com um recurso de arquivamento institucional, é necessária.

Estratégias para maximizar a qualidade de imagem
Embora a capacidade do KAV discernir com precisão o ECFCs do fundo matriz é robusta, a sensibilidade do ensaio é dependente da qualidade da imagem. Por exemplo, se a imagem tem baixo contraste, o software irá detectar redes de celular com menos precisão (Figura 2B). A qualidade do contraste de fase é afetada por vários fatores, incluindo as configurações do microscópio usado para aquisição de imagem, carregamento do matrix e os meios de comunicação de suspensão de célula durante a preparação do ensaio e manutenção dos níveis de mídia dentro dos poços em toda a imagem. Para otimizar o contraste de fase para estes ensaios, pequenos ajustes para alinhamento de anel de fase no microscópio foram feitos para melhorar o contraste. Além disso, a preparação da amostra foi rigorosamente testada para assegurar o carregamento de mídia igual e consistente. Se a quantidade de matriz e/ou mídia carregada nos poços abaixo ou acima da faixa ótima, um menisco pode formar líderes para contraste de fase alterada. Finalmente, devido ao pequeno volume de líquido em poços, é fundamental para manter os níveis de mídia por minimizar a evaporação e condensação, como mencionado acima. Em geral, otimização de ensaio é fundamental para gerar imagens de contraste de alta qualidade para análise.

Além da qualidade de contraste de fase, outros fatores também podem afetar os resultados de ensaio incluindo a contaminação de mídia, imperfeições na matriz e as partículas ou detritos na matriz ou mídia. Contaminação é um perigo deste teste, uma vez que envolve a célula viva de imagem ao longo de várias horas em uma câmara de microscopia. Para reduzir o risco de contaminação, as suspensões de matriz e células são carregadas para o slide em uma capa de estéril. Além disso, cada amostra é tipicamente chapeada em duplicado ou triplicado para um experimento para minimizar o risco de perda de dados devido a imprevistos como detritos ou confundir a análise de partículas.

Precisam de drives de heterogeneidade da amostra para sensibilidade aumentada do ensaio
Heterogeneidade foi observada e relatada em estudos anteriores de ECFCs expostos ao GDM13. Um elevado nível de heterogeneidade na função celular observada nestas amostras é especulado para ser explicado por vários fatores, incluindo a gravidade da doença materna, duração da doença e estilo de gestão usado para regular os níveis de glicose no sangue. Importante, esta abordagem analítica capta o intervalo dinâmico de ECFC vasculogenesis, tornando-o viável para identificar diferenças fenotípicas devido à heterogeneidade funcional em amostras de gravidezes GDM. No geral, o uso de amostras primárias, tais como aqueles usados nestes estudos, pode introduzir maior variabilidade em relação a uma linha celular. Como maior ênfase é colocada na translação estudos envolvendo múltiplas amostras primárias de animal ou humanas com variabilidade funcional, a sensibilidade do ensaio é essencial para a detecção e a derivação de medições biològica significativas e as conclusões. Portanto, desenvolvimento de abordagens como KAV irá melhorar a quantidade e a qualidade dos dados gerados pela angiogênese e vasculogenesis em vitro ensaios para habilitar as observações e conclusões mais robustas. Além disso, estes dados irão facilitar a futura investigação dos mecanismos moleculares subjacentes que contribuem para a vasculogenesis ECFC alterada após a exposição intra-uterina do GDM.

Aplicações futuras desta abordagem
Embora este método foi aplicado para avaliar fetal ECFC vasculogenesis em vitro nestes estudos, as aplicações potenciais desta abordagem são numerosas. Esta técnica pode ser facilmente implementada para estudar qualquer população celular que participa nos processos de vasculogenesis ou angiogênese. Especificamente, ele pode ser usado para estudar populações de células individuais, como foi demonstrado neste estudo, mas também poderia ser aplicada a sistemas de co-cultura. No futuro, seria benéfico expandir esta abordagem além bidimensional em vitro ensaio para avaliar modelos tridimensionais (3D). Embora a versão atual do KAV seria insuficiente para dosar imagem dados 3D, uma similarmente concebida abordagem analítica lapso de tempo, multi paramétrica especificamente para modelos 3D ou na vivo gostaria de informar se as observações feitas em duas dimensões em vitro são representativas da função da célula em uma configuração mais biologicamente relevante.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores reconhecem Lucy Miller, Leanne Hernandez, Dr. David Haas, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), Dr. Karen Pollok, Julie Mund, Matthew repasse e Emily Sims (Angio BioCore da Indiana University Simon Cancer Center) para excelente assistência técnica na derivação amostras ECFC. Os autores também reconhecem os Drs Maureen A. Harrington, Edward F. Srour, Richard N. Day, Mervin C. Yoder e Matthias A. Clauss (Indiana University School of Medicine) para discussão acadêmica, bem como paredes de Janice (Indiana University School of Medicine) para apoio administrativo. Todas as imagens foi realizada no centro de Indiana para microscopia biológica, Indiana University School of Medicine. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R01 HL094725, P30 CA82709 e HD063094 de U10) e Fundação de crianças Riley. Além disso, esta publicação foi viabilizada com apoio parcial do nacional do coração, pulmão e sangue Instituto dos institutos nacionais de saúde sob prêmio # T32 HL007910.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placas de Cultura de Tecidos de 100 mmFisher353003
tubos cônicos de 15 mLde Angiogênese Fisher
Ibidi81506
MatrigelFisher (Corning)354234
EGM2 MédioLonzaCC3162
Soro Fetal BovinoAtlanta BiologicalsS11550
PSA Antimiocítico, Antibiótico FisherMT30004C1Adicionado 5 mL por frasco de 500 mL de meio EGM2.
0,5% de tripsina / 0,53 nM EDTA em HBSSFisher (Corning)MT25052CI
colágeno tipo 1Fisher (Corning)354226100 mg de líquido, faixa de concentração de 3-4 mg/mL. Diluir em ácido acético 20 nM em ddH2O para utilizar numa concentração final de 0,05 mg/ml.
Ácido acético glacialFisherA38-212Usado em solução de colágeno tipo 1 a uma concentração final de 20 nM.
Kim WipesFisher06-666
Lâmina com câmaraIbidi80296Esta lâmina pode ser preenchida com água destilada para manter a umidade na câmara de imagem.
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Fisher (Gibco)200120271x solução, pH 7.2
MicroscópioNikon InstrumentsMEA53100 e MEF55030TiE motorizado incluindo anel de fase Ph1 para contraste de fase com objetiva
StagePrior InstrumentsProScan IIOutros OKOlab e Nikon Elements Estágio compatível com AR pode ser usado
ObjetivaNikon Instruments93178Câmera CFI Plan Fluor DL 10X
HamamatsuC11440-42UORCA Flash 4.0LT
Stage BlowerPrecision ControlsN/AEste item foi descontinuado, as alternativas incluem o Aquecedor de Ar Inteligente (AIRTHERM-SMT-1W) da World Precision Instruments
Incubadora de palco OKOLabsH301BoldLine incluindo um suporte deslizante de duas posições
ComputadorHewlett-PackardZ620 ou processador IntelXeon equivalente de 4 núcleos, >32 GB de RAM, >2 TB RAID 10, placa gráfica nVidia Quadro 
Software Nikon Elements NikonInstrumentsAR v 4.20ND Acquisition é uma ferramenta de configuração multidimensional usada para configurar o software Elements.
FIJI (ImageJ) SoftwareN/AN/ASoftware gratuito de código aberto baixado on-line no seguinte URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads
KAV Plug-InN/A N/ASoftware gratuito de código aberto baixado on-line no seguinte URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis
Microlâminas de 15 poços 81506

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. CSH Med. 2 (2), 006601(2012).
  3. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298(2011).
  4. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
  5. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
  6. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood. J Vis Exp. (62), (2012).
  7. Simons, M., et al. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularization: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. 116 (11), 99-132 (2015).
  8. Crabtree, B., Subramanian, V. Behavior of endothelial cells on Matrigel and development of a method for a rapid and reproducible in vitro angiogenesis assay. In Vitro Cell Dev-An. 43 (2), 87-94 (2007).
  9. Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Eng Part C-Me. 17 (9), 895-906 (2011).
  10. Allier, C. P., et al. Video lensfree microscopy of 2D and 3D culture of cells. SPIE BiOS. 8947, 89471(2014).
  11. Wang, Y., Chen, Q., Zhang, Z., Jiang, F., Meng, X., Yan, H. Interleukin-10 overexpression improves the function of endothelial progenitor cells stimulated with TNF-α through the activation of the STAT3 signaling pathway. Int J Mol Med. 35 (2), 471-477 (2015).
  12. Ingram, D. A., et al. In vitro hyperglycemia or a diabetic intrauterine environment reduces neonatal endothelial colony-forming cell numbers and function. Diabetes. 57 (3), 724-731 (2008).
  13. Blue, E. K., et al. Gestational diabetes induces alterations in the function of neonatal endothelial colony-forming cells. Pediatr Res. 75 (2), 266-272 (2014).
  14. Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. , (2012).
  15. WimTube. , Available from: https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube (2012).
  16. Varberg, K. M., et al. Kinetic analyses of vasculogenesis inform mechanistic studies. Am J Physiol-Cell Ph. , (2017).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Met. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Arganda-Carreras, I., Fernández-González, R., Muñoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Techniq. 73 (11), 1019-1029 (2010).
  19. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  20. Mead, L. E., Prater, D., Yoder, M. C., Ingram, D. A. Isolation and characterization of endothelial progenitor cells from human blood. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2C.1 (2008).
  21. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).

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