Artigo de método

Multiplexado amplificação isotérmica com base em plataforma de diagnóstica para detectar Dengue 1, Chikungunya e Zika

DOI:

10.3791/57051

⸱

13 de março de 2018

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1Foundation for Applied Molecular Evolution (FfAME), 2Florida Medical Entomology Laboratory, University of Florida, 3Firebird Biomolecular Sciences LLC

Neste artigo

Resumo

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Corrente multiplexado diagnósticos para detectar Zika, chikungunya, vírus da dengue exigem a preparação de amostras complexas e instrumentação cara e são difíceis de usar em ambientes de recursos baixos. Mostramos um diagnóstico que utiliza amplificação isotérmica com sondas displaceable vertente destino específico para detectar e diferenciar estes vírus com alta sensibilidade e especificidade.

Resumo

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Zika, da dengue e o vírus chikungunya é transmitido por mosquitos, causando doenças com sintomas semelhantes do pacientes. No entanto, eles têm potenciais diferentes a jusante transmissão de paciente para paciente e requerem tratamentos muito diferentes pacientes. Assim, surtos recentes Zika torná-lo urgente para desenvolver ferramentas que rapidamente discriminam estes vírus em pacientes e presos os mosquitos, para selecionar o correto tratamento do paciente e para compreender e gerenciar sua epidemiologia em tempo real.

Infelizmente, testes de diagnóstico atual, incluindo aqueles emergência 2016 recebimento usar autorizações e acelerado estado, detectar o RNA viral por transcrição reversa cadeia da polimerase (RT-PCR), que requer instrumentação, treinou os usuários, e preparação da amostra considerável. Assim, devem ser enviadas para laboratórios de referência "aprovado", que requer tempo. Com efeito, em agosto de 2016, o Center for Disease Control (CDC) estava perguntando as mulheres grávidas, que tinha sido mordido por um mosquito e com sarna Zika-indicando que esperar uma inaceitável de 2 a 4 semanas antes de aprendizagem se eles foram infectados. Precisamos muito de testes que podem ser feitos no local, com poucos recursos e por pessoal treinado, mas não necessariamente licenciado.

Este vídeo demonstra um ensaio que atenda a estas especificações, trabalhando com urina ou soro (para pacientes) ou carcaças de mosquito esmagado (para vigilância ambiental), tudo sem muita preparação da amostra. Carcaças de mosquito são capturadas no papel carregando de amônio quaternário grupos (Q-papel) seguidos de um tratamento de amônia para gerenciar riscos biológicos. Estes são então diretamente, sem isolamento de RNA, colocados em tubos de ensaio contendo reagentes liofilizados que precisam sem cadeia de refrigeração. Uma forma modificada de amplificação isotérmica mediada por laço transcrição reversa com destino específico fluorescente etiquetadas sondas displaceable produz a leitura, em 30 min, como um sinal de fluorescência de três cores. Isto é visualizado com um dispositivo portátil, bateria com um filtro laranja. Contaminação direta é impedida com tubos selados e o uso de termolábil uracil DNA glycosylase (UDG) na presença de dUTP a mistura de amplificação.

Introdução

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Infecções por vírus transmitidas por mosquitos, inclusive da dengue e chikungunya Zika vírus são sobre as estratégias de gestão imediata de ascensão e a demanda. Vírus da dengue e chikungunya já são endêmicas em muitas das regiões tropicais onde Zika está se espalhando no hemisfério ocidental1. Zika vírus, como a dengue, é um membro da família Flaviviridae e é nativa da África com um asiático e duas linhagens genéticas africanas2. Mesmo que a identificação do vírus Zika remonta a 1947, Zika infecção em humanos permaneceu esporádica há meio século antes de emergir no Pacífico e nas Américas. O primeiro surto relatado de Zika febre ocorreu na ilha de Yap, nos Estados Federados da Micronésia, em 2007, seguido de Polinésia francesa em 2013 e 2014. O primeiro grande foco nas Américas ocorreu em 2015 no Brasil.

Vírus da dengue, chikungunya e Zika são transmitidos principalmente pelo Aedes aegypti e Aedes albopictus. No entanto, Zika tem possibilidades adicionais a jusante transmissão de humano para humano, provavelmente sendo espalhadas através do contato sexual, interação mãe-para-feto e através do aleitamento materno3,4,5. Zika febre primeiro foi acreditado para causar doença apenas suave. No entanto, mais tarde foi associado com a síndrome de Guillain-Barré em adultos, microcefalia em recém-nascidos e crônicas doenças músculo-esqueléticas que podem últimos meses a anos. Diagnóstico de doença Zika pode ser um desafio, uma vez que os sintomas de uma infecção Zika são semelhantes de outros vírus de propagação do mosquito6. Co-infecções comuns destes vírus fazem diagnóstico diferencial ainda mais desafiador7,8. Portanto, deteção rápida e confiável dos ácidos nucleicos de Zika e outros vírus é necessária para compreender a epidemiologia em tempo real, para iniciar o controle e medidas preventivas e para gerenciar o atendimento ao paciente9.

Testes de diagnóstico atual para estes vírus incluem testes serológicos, isolamento do vírus, sequenciamento do vírus e PCR transcrição reversa (RT-PCR). Abordagens serológicas padrão muitas vezes sofrem de sensibilidade inadequada e resultados podem ser complicados por reatividade cruzada em pacientes que anteriormente foram infectados por outros flavivírus.

Portanto, o teste de ácido nucleico continua a ser a maneira mais confiável para detectar e diferenciar estes vírus. Deteção de Zika e outros vírus transmitidas por mosquitos é geralmente realizada usando RT-PCR ou RT-PCR em tempo real em uma variedade de fluidos biológicos, tais como soro, urina, saliva, sêmen, leite materno e fluido cerebral10,11. Amostras de urina e saliva são geralmente preferidas sobre sangue, uma vez que eles apresentam menos PCR-inibição, cargas virais, presença de vírus por longos períodos de tempo e maior facilidade de coleta e tratamento de12,13. Testes de diagnóstico baseados em RT-PCR, no entanto, compreendem as etapas de preparação de amostra extensa e caro equipamento de ciclismo térmico, tornando-se menos ideal para o local de tratamento.

Transcrição reversa mediada por loop de amplificação isotérmica (RT-lâmpada) surgiu como uma poderosa alternativa de RT-PCR, devido à sua alta sensibilidade e especificidade14,15, amostras de sua tolerância para substâncias inibidoras no biológico e operação em temperatura única, que significativamente reduz do ensaio de complexidade e custos associados, tornando-o adequado para ambientes de baixo recurso. RT-lâmpada, como classicamente é implementada, compreende seis primeiras demão que ligam a oito regiões distintas dentro da meta do RNA. Ele é executado em temperaturas constantes entre 60 ° C e 70 ° C e usa um transcriptase reversa e uma DNA polimerase com forte vertente deslocando atividade.

Durante os estágios iniciais do RT-lâmpada, avançar e retroceder internas Cartilhas (FIP e BIP, figura 1A) juntamente com o exterior para a frente e para trás as primeiras demão (F3 e B3) formam uma estrutura de haltere, a estrutura de sementes de amplificação exponencial de lâmpada. Amplificação é ainda mais acelerada por laço frente e para trás primers (LF e LB), que são projetados para ligar as regiões encalhadas única do haltere, e resulta na formação de concatemers com repetindo vários loops16. Ensaios de lâmpada clássica baseada na turbidez ou leitura por DNA intercalante corantes não é inteiramente adequada para deteção de point-of-care de Zika, onde algum nível de multiplexação é desejado17,18,19. Multiplexação não é facilmente obtida nestes sistemas, como eles são propensos a gerar falsos positivos devido amplificações fora do alvo.

Para gerenciar essas questões, a literatura adiciona um componente adicional sob a forma de uma "fio-deslocando sonda" para a arquitetura RT-lâmpada clássica20,21,22. Cada teste possui uma sequência específica dobro-costa e uma região de single-stranded escorva. A sonda com a região de single-stranded é marcada com um fluoróforo 5', e a sonda complementar é modificada com um quencher 3'-extremidade. Na ausência de um alvo, sem fluorescência é observada devido a hibridação das vertentes complementares sonda, que traz o fluoróforo e quencher em estreita proximidade. Na presença de um alvo, a parte single-stranded da sonda fluorescente vincula seu complemento no alvo e então é estendida por um fio, deslocando a polimerase. Nova prorrogação de polimerase por primers reversos provoca a separação da strand quencher de sua cadeia complementar fluorescente etiquetada, permitindo a emissão de fluorescência (figura 1B). Com este projeto, o sinal é gerado após a formação do haltere, reduzindo as chances de sinais falso-positivos.

A porção de dupla-hélice da vertente-deslocando sonda pode ser qualquer sequência, e quando a multiplexação é aplicada, a mesma sequência pode ser utilizada com pares diferentes fluoróforo-quencher. Com esta arquitetura, urina contaminada por vírus, soro ou mosquito esmagadas no papel de amostras foram introduzidas diretamente o ensaio sem preparação da amostra. Leituras de três cores fluorescência visíveis ao olho humano foram geradas dentro de 30-45 min, e os sinais foram visualizados por uma caixa de observação 3D-impresso que utiliza um LED azul e um filtro laranja. Os reagentes de RT-lâmpada de liofilização habilitado a implantação deste kit para diminuir as configurações de recursos sem a necessidade de refrigeração.

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Protocolo

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Nota: Os mosquitos foram os únicos animais diretamente utilizados neste estudo. Os procedimentos para gerenciar as galinhas, cujo sangue foi usado para alimentar os mosquitos infectados, foram aprovados como IACUC protocolo #201507682 pela propagação cuidados animais institucionais da Universidade da Flórida e Committee.Virus de uso e estudos de infecção do mosquito foram realizado nas instalações da BSL-3 do laboratório de Entomologia Médica de Florida em Vero Beach, FL. RT-lâmpada experimentos foram realizados em laboratório BSL-2 compartilhado por FfAME e LLC de Ciências biomoleculares Firebird em Alachua, FL.

1. projeto de Primers e Strand deslocando sondas

  1. Extrair sequências virais para Dengue 1 do banco de dados Instituto Broad23; sequências para Zika e chikungunya do NIAID vírus patógeno de banco de dados e recursos de análise de24.
    1. Crie alinhamentos múltiplos da sequência (MSAs) para sequências de interesse usando software músculo v3.8.3125. Use MSAs gerados para procurar conjuntos de primers lâmpada dentro de uma região conservada do alvo e evitar alvos não relevantes ou não intencionais, como distinções entre subtipos de um alvo.
  2. Siga as regras de design para as primeiras demão lâmpada como descrito on-line (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/) e permitir a utilização de bases misturadas em primers para cobrir o vírus divergência26. Para evitar a reactividade cruzada dos conjuntos da primeira demão, compare primers de lâmpada gerados para o banco de dados do NCBI RNA vírus usando NCBI BLAST27. Comparar cada conjunto para eliminar as primeiras demão que teriam dimerizam em um ensaio multiplexado usando NCBI BLAST também.
  3. A porção de dupla-hélice da vertente-deslocando sonda contra qualquer sequência do genoma viral e sequência genômica de mosquito da tela. Modifica o 5'-extremidades da ligação destino sonda com fluoresceína amidite (FAM), tintura HEX e 5-tetrametilrodamina (TAMRA) tintura para Zika, chikungunya e Dengue 1, respectivamente.
    1. Incluem uma cartilha de controle positivo para amostras de urina. Projetar primers de lâmpada para direcionar o DNA mitocondrial humano. Sonda de vertente-deslocando do rótulo com TET na extremidade 5'. Sondas de quencher de etiqueta que são parcialmente complementares a cada fluorescente etiquetado sonda com quencher (por exemplo, Iowa preto-FQ) em 3'-extremidade (tabela 1).

2. vírus isolados e infectado o Mosquito amostras

  1. Uso isolados de vírus Zika (estirpe de Porto Rico), vírus Chikungunya (estirpe de La Réunion ou Ilhas Virgens Britânicas) e vírus de Dengue sorotipo-1 (estirpe de Key West). Determine a concentração viral usando a placa de ensaio28 ou de RT-PCR quantitativo29. Extraia o RNAs virais usando comercialmente disponíveis kits de extração de RNA.
    Nota: A tabela 2 representa os títulos virais de cada isolado de vírus usada neste estudo.
  2. Siga o artigo publicado por Yaren et al . para um protocolo detalhado sobre a infecção de fêmeas Ae. aegypti com Zika e chikungunya vírus20. Consulte a tabela 2 para o título viral da amostra mosquito infectado com vírus Zika.

3. RT-lâmpada juntamente com termolábil Uracil DNA Glycosylase

  1. 10 x preparação de mistura da primeira demão.
    1. Preparar a solução estoque de 100 µM de cada primer e sonda (Veja passo 1) adicionando-se água livre de nuclease. Vórtice bem e loja a-20 ° C até o uso.
    2. Para mistura de Primer X 10 para cada Zika, Dengue 1 ou alvo de DNA mitocondrial, que mistura 16 µ l da FIP, 16 µ l BIP, 2 µ l de F3, 2 µ l de B3, 5 µ l de se, 2 µ l de LB, 3 µ l de LB-fluorescente etiquetado sonda, 4 µ l de sonda quencher e 50 µ l de água nuclease livre para dar um total de volume de 100 µ l.
    3. Para mistura de Primer X 10 para Chikungunya, misture 16 µ l da FIP, 16 µ l BIP, 2 µ l de F3, 2 µ l de B3, 5 µ l de LB, 2 µ l de se, 3 µ l de se-fluorescente etiquetado sonda, 4 µ l de sonda quencher e 50 µ l de água nuclease livre para dar um total de volume de 100 µ l.
      Nota: A sonda concentração descrita acima usa 300 nM de sonda fluorescente final e 400 nM de sonda quencher. Como alternativa, uso 80 nM de sonda fluorescente etiquetada e 200 nM de sua sonda quencher para análise em tempo real.
  2. Adicionar 5 µ l de mistura da primeira demão de 10x (para 3-plex, adicionar 5 µ l de cada 10 X mistura primeira demão), 5 µ l de tampão de amplificação isotérmica de 10x (1 X composição de buffer: 20 mM Tris-HCl tampão pH 8.8, 50 mM KCl, 10mm (NH4)2SO4, 8mm MgSO4 0.1% Tween-20, 1 milímetro DTT), 7 µ l da mistura do dNTP (10 mM de dATP, dCTP e dGTP; 5 mM dTTP e dUTP), 16 unidades da DNA polimerase, 15 unidades de Transcriptase reversa, 80 unidades de inibidor do ribonuclease recombinantes, 2 unidades de termolábil UDG, 1-2 µ l de quantidades variáveis de vi RAL RNAs e água para trazer o volume total até 50 µ l em um 0,25 mL do PCR do tubo (ver Tabela de materiais).
  3. Inclua ensaios de controlo negativo, nesta fase, substituindo o volume de RNA viral com água. Incubar as amostras entre 65 e 68 ° C por 45 min a 1 h e, em seguida, analisar executando 5 µ l de cada amostra em gel de agarose de 2,5% em 1 tampão de X TBE contendo brometo de etídio (0,4 µ g/mL). Use um 25 bp ou escada de DNA 50 bp como marcador no gel.
    Nota: A adição de um modelo específico não-alvo é opcional.
  4. Para detectar a presença de RNA patogénico, testar cada conjunto da primeira demão e seu controle de não-modelo variando a concentração de temperatura e/ou magnésio, uma vez que cada conjunto de cartilha RT-lâmpada foi projetado para funcionar em diferentes temperaturas (65 ° C a 68 ° C) ou magnésio concentrações (final de 6 a 10 mM). Prepare as experiências à temperatura ambiente.

4. RT-lâmpada usando urina cravado de RNA Viral

  1. Teste as primeiras demão RT-lâmpada em diferentes concentrações finais de urina (0%, 10%, 20% e 50%) em 50 µ l de volume total de reação. Para 10% de concentração de urina final, adicione 1 µ l de RNA viral a 5 µ l de urina. Para 20% de concentração de urina final, adicione 1 µ l de RNA viral de 10 µ l de urina. Para 50% de concentração de urina final, adicione 1 µ l de RNA viral de 25 µ l de urina.
  2. Para monitoramento em tempo real de RT-lâmpada em 10% da urina, utilize um instrumento PCR em tempo real (ver Tabela de materiais) com fluoróforo diferentes filtros.
    1. Para ler os sinais de fluorescência de amplicons FAM-etiquetados para Zika, usar um filtro que variam de 483 a 533 nm; para amplicons HEX-etiquetados para chikungunya, use um filtro variando de 523 a 568 nm; para amplicons TAMRA-etiquetados para Dengue 1, use um filtro variando de 558 610 nm; e para TET-rotulado amplicons de DNA mitocondrial, use um filtro variando de 523 a 568 nm.
      Nota: FAM tem maxima de excitação e emissão de 495 nm e 520 nm, respectivamente. HEX tem maxima de excitação e emissão de 538 nm e 555 nm, respectivamente. TAMRA tem maxima de excitação e emissão de 559 nm e 583 nm, respectivamente. TET tem maxima de excitação e emissão de 522 nm e 539 nm, respectivamente.
  3. Placas de uso 96 poços selo o prato com uma folha de plástico transparente, incubar as amostras a 65-68 ° C por 60-90 min e gravar a fluorescência cada 30 s usando o reciclador de luz. Inicialmente, use 80 nM de sondas fluorescente etiquetadas e então teste a 300 nM de sondas fluorescente etiquetadas.
    1. Determine o limite de detecção para cada destino adicionando serialmente diluída RNAs virais na concentração de urina final de 10%.
      Nota: Use RT-lâmpada em tempo real para determinar a temperatura óptima, concentração de magnésio, concentração de sonda fluorescente etiquetadas e tempo de reação.
  4. Para visualizar a fluorescência gerada por sondas displaceable vertente pelo olho, use uma fonte de luz LED azul de um reciclador de luz com excitação a 470 nm (qualquer caixa de electroforese do gel com a fonte de luz azul irá trabalhar, consulte a tabela de materiais) e gravar a imagem com uma câmera de telefone celular a temperatura ambiente no escuro.
    Nota: Uso 300 nM de sondas fluorescente etiquetadas, quando é necessária a visualização de todas as três cores pelo olho usando LED azul.

5. RT-lâmpada na detecção de mosquitos infectados Zika usando a tecnologia Q-papel

  1. Prepare quaternários de amônio-modificado papel de filtro (Q-papel), de acordo com os métodos anteriormente publicados com pequenas modificações,30.
    1. Mergulhe 1 g de círculos de papel de filtro de celulose (ver Tabela de materiais) com diâmetros de 3,5 cm em 50 mL de 1,8% de solução aquosa de NaOH por 15 min para ativação.
    2. Recolher os círculos de papel ativado por filtração em vácuo e depois mergulhe-os em 40 mL de solução aquosa de cloreto de trimetilamónio (2,3-epoxipropílicos) (0,28 g) durante a noite à temperatura ambiente.
      Nota: Manter a proporção em massa de cloreto de trimetilamónio (2,3-epoxipropílicos) para o papel de filtro de 0,28 a 1.
    3. Recolher o papel catiônico resultante por filtração em vácuo e neutralizar com 50 mL de ácido acético a 1%.
    4. Lavar o papel três vezes com etanol e secar ao ar livre debaixo de um carro com fluxo de ar constante.
  2. Corte folhas de papel-Q em pequenos retângulos (3 x 4 mm) usando um perfurador de papel ou tesoura. Esmaga Ae. aegypti mosquitos fêmeas potencialmente infectados com Zika em cada papel com um pilão de micro.
  3. Adicionar a cada papel 20 µ l de solução de amônia aquosa de 1 M (pH ≈ 12) e espere 5 min. Em seguida, lave cada papel uma vez com 20 µ l de 50% EtOH e uma vez com 20 µ l de água livre de nuclease. Secar o papel em Biossegurança BSL-2 armário para cerca de 1 h.
    Nota: Neste momento, as amostras podem ser armazenadas a-20 ° C durante a noite até o uso.
  4. Usando uma pinça, coloque cada papel em 100 µ l da mistura de reação de RT-lâmpada e incubar a 65-68 ° C por 45 min. Certifique-se de submergir totalmente o papel na solução; Ele não deve ser flutuante. Ler e gravar a fluorescência decorrentes de vírus Zika usando a fonte de luz LED azul e filtro laranja ou amarelo.

6. liofilização dos reagentes RT-lâmpada para 100 µ l de Volume de reação

  1. Prepare 10 X lâmpada primeira demão mistura de acordo com a seção 3.1 e preparar a mistura do dNTP contendo dUTP de acordo com a seção 3.2. Loja da primeira demão mistura e dNTPs a-20 º C até o uso.
  2. Prepare-se 10 mL de tampão de diálise de enzima para remover o glicerol, misturando-se 100 µ l de 1 M Tris-HCl pH 7,5, 500 µ l de 1 M de KCl, 2 µ l de EDTA 0,5 M, 100 µ l de 10% Triton X-100, 100 µ l de 0,1 M DTT e 9,198 mL de água livre de nuclease. Armazenar o buffer de diálise a 4 ° C.
    Nota: Certifique-se de filtragem (filtros de 0.2 mícrons) todas as soluções de reagente tampão antes de usar e armazená-los em 4 ° C.
    1. Usar uma membrana de ultrafiltração com limite de corte 10 kDa (ver Tabela de materiais). Colocar 350 µ l de tampão de diálise, 4 µ l de 32 unidades da DNA polimerase, 2 µ l de 30 unidades de Transcriptase reversa e 2 µ l de 80 unidades de inibidor de RNase em membrana de ultrafiltração e centrifugação a 14.000 x g por 5 min a 4 ° C.
    2. Adicionar outro 350 μL de tampão de diálise para a membrana de ultrafiltração e centrifugue (14.000 x g) min. 5 outro vazio do tubo de coleta e repita este passo e, em seguida, centrifugar (14.000 x g) durante 3 min.
    3. Para a eluição, inverta a membrana e coloque em um novo tubo de coleta. Girar a 1.000 x g por 2 min. medida do volume de eluição; se a menos de 8 µ l, trazer o volume até 8 µ l pela adição de buffer de diálise. Armazenar a eluição a 4 ° C e imediatamente prosseguir para a próxima etapa.
      Nota: Este protocolo é para liofilização tubo único, mas preparar pelo menos 10 tubos de reação de cada vez usando a mesma membrana de ultrafiltração e usar a mesma quantidade de buffer de diálise.
  3. Misturar 10 µ l de 10 primer X lâmpada se singleplex (para 3-plex, adicionar 10 µ l de cada 10 X mistura primeira demão), 14 µ l da mistura do dNTP, 8 µ l de mistura de enzima dializados, 2 µ l de 2 unidades de UDG termolábeis e 66 µ l de nuclease livre de água (para 3-plex use 46 µ l) em um tubo de microcentrifugadora de 0,5 mL e deixe a tampa aberta. Em vez disso, adicione outra tampa perfurada com uma agulha para permitir que o vapor escapar.
  4. Imediatamente congelar os tubos a-80 ° C durante 2 h e lyophilize o tubo para 4 h. tampa da câmara de liofilização com folha de alumínio para a proteção da luz. Quando os reagentes são secas, retire as tampas perfuradas, feche a tampa original e armazenar os tubos com reagentes liofilizados a 4 ° C no escuro.
    Nota: Os reagentes podem ser liofilizados durante a noite, se necessário.

7. teste liofilizado RT-lâmpada reagentes na urina e Mosquito amostras contendo Zika

  1. Use os seguintes itens do kit (veja a Tabela de materiais) para Zika: uma caixa de observação 3D-impresso com filtro laranja (filtro de passa tempo, corte-em ~ 540 nm), 2 pilhas AAA para observar a caixa, liofilizado, tubos de reação rotulados ZV para a deteção de Zika, e 1.1 tubos de X reidratação Buffer na parte superior do parafuso de 1,5 mL.
  2. Preparar 50 mL de 1.1 X buffer de reidratação misturando 5,5 mL de 10x buffer de amplificação isotérmica que vem junto com o DNA polimerase (consulte a Tabela de materiais), 3,3 mL de MgSO4a 100 mM, 110 µ l de 0,5 M DTT e 41,09 mL de água livre de nuclease. Misture bem, alíquota 1 mL desta solução para tubos de 1,5 mL parte superior do parafuso e armazenar a 4 ° C até o uso.
  3. Adicione 90 µ l de tampão de reidratação X 1.1 para cada tubo de reação (0,5 mL). Certifique-se de que o líquido preenche o fundo do tubo contendo os reagentes liofilizados (dissolve-los com a mistura por agitação, então brevemente spin para baixo (x 1.000 g)). Adicione 10 µ l de amostra de urina cravada com RNA viral para os tubos de reação (ver seção 4.1 para obter detalhes).
    1. Se testando os mosquitos, adicionar um retângulo de papel Q segurar mosquito carcaças (como preparado nas etapas descritas nas seções 5.2 e 5.3), juntamente com 10 µ l purificado água em vez de amostras de urina.
      Nota: Como alternativa, adicione 10 µ l de amostras de saliva ou soro, em vez de urina. Se as amostras são extraído DNA ou RNA, adicione 2-5 µ l da amostra na mistura re-hidratada e completar com água livre de nuclease a 10 µ l de volume final da amostra.
  4. Feche a tampa do tubo de reação. Coloque-os num calor bloco/banho (ou incubadora) pré-ajuste a 65-68 ° C. Incube durante 30-45 min, mas não mais de 1 h. Após a incubação, retire o tubo do fogo. Para evitar a contaminação dos futuros ensaios, certifique-se de que esses tubos permanecem fechados.
  5. Coloque os tubos de reação na caixa observação; a temperatura vai cair para a temperatura ambiente (de preferência de 25 ° C). Ligue o interruptor na parte de trás da caixa de observação. Observar a amostra através do filtro laranja e capturar a imagem de uma câmera de telefone celular que é mantida a uma distância onde a imagem preenche 80% do campo de visão.
    Nota: A melhor visualização é alcançada em ambientes de luz baixas.
  6. Após visualização é concluída, desligue o interruptor. Armazene os tubos selados no escuro, de preferência com refrigeração, se houver necessidade de posterior visualização.

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Resultados

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Inicialmente, as performances de cada primer RT-lâmpada (tabela 1) , com sua correspondente substrato de RNA viral, bem como controles negativos foram avaliadas por eletroforese em gel. As primeiras demão RT-lâmpada foram projetadas para alvo NS5 região (RNA-dependente do RNA polimerase) para Zika e Dengue 1 e região nsP2 (proteínas não estruturais P2) para Chikungunya. Modelos foram RNA total extraído de estoques virais cultivadas em células de rim (Vero) do macaco verde...

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Discussão

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Vírus transmitidas por mosquitos, incluindo Zika, chikungunya e dengue ameaçam a saúde pública e destaque de surtos recente Zika a necessidade de alternativas de baixo custo deteção de point-of-care para diagnóstico do paciente, bem como para vigilância de mosquito. Métodos de amplificação isotérmica foram desenvolvidos como alternativas acessíveis para sistemas baseados em PCR. Particularmente, RT-lâmpada-based plataformas foram aplicadas para detectar uma grande variedade de agentes patogénicos. No entanto, o uso de pl...

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Divulgações

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Vários dos autores e suas instituições possuem propriedade intelectual associada com este ensaio.

Agradecimentos

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O trabalho foi financiado em parte por 1R21AI128188-01 FDOH-7ZK15 e NIAID. Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada em parte pelos institutos nacionais de alergia e doenças infecciosas e em parte pelo biomédico pesquisa programa de Florida Department of Health. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do NIH ou Florida Department of Health. LLC de química combinatória dinâmico é reconhecido por seu apoio e contribuição para este projeto.

Vírus dengue 1 (estirpe BOL-KW010) foi gentilmente fornecida pela Florida departamento de saúde Secretariado dos laboratórios. Vírus Zika e estirpe asiática do vírus chikungunya foram graciosamente fornecidos pelos centros de controle e prevenção de doenças. A Oceano Índico a linhagem do vírus chikungunya foi gentilmente cedida por Robert Tesh (centro de referência mundial para vírus emergentes e arbovírus, através da Universidade do Texas Medical Branch em Galveston, Texas) para o UF-FMEL. Agradecemos a S. Bellamy, B. Eiko, S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, r. ZimLer e Zirbel K. para obter assistência com os estudos de infecção. Agradecemos também o M. S. Kim para fornecer Q-papel.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Iluminador/Sistema de Eletroforese SafeBlue, MBE-150-PLUSMajor ScienceMBE-150Eletroforese em gel
G:BOX F3SyngeneG:BOX F3Imagem em gel
LightCycler 480 Instrumento II, 96 poçosRoche Applied Science05 015 278 001PCR em tempo real
Amicon Ultra-0.5 Unidade de filtro centrífugo com membrana Ultracel-10Millipore SigmaUFC501096membrana ultrafiltraton para diálise
Eppendorf 5417C CentrífugaMarshall ScientificEP-5417CCentrífuga
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FreeZone Plus 6 litros Cascade Console Freeze Dry SystemLabconco7934020liofilizador
todos os priers e sondasIDTpersonalizadoRT-LAMP primers e sondas
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Bst  2.0 WarmStart  DNA PolimeraseNew England BiolabsM0538Lenzima
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LightCycler 480 Multiwell Plate 96, brancoRoche Applied Science4729692001análise RT-LAMP em tempo real

Referências

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