Multiplexado amplificação isotérmica com base em plataforma de diagnóstica para detectar Dengue 1, Chikungunya e Zika

Summary

Corrente multiplexado diagnósticos para detectar Zika, chikungunya, vírus da dengue exigem a preparação de amostras complexas e instrumentação cara e são difíceis de usar em ambientes de recursos baixos. Mostramos um diagnóstico que utiliza amplificação isotérmica com sondas displaceable vertente destino específico para detectar e diferenciar estes vírus com alta sensibilidade e especificidade.

Abstract

Zika, da dengue e o vírus chikungunya é transmitido por mosquitos, causando doenças com sintomas semelhantes do pacientes. No entanto, eles têm potenciais diferentes a jusante transmissão de paciente para paciente e requerem tratamentos muito diferentes pacientes. Assim, surtos recentes Zika torná-lo urgente para desenvolver ferramentas que rapidamente discriminam estes vírus em pacientes e presos os mosquitos, para selecionar o correto tratamento do paciente e para compreender e gerenciar sua epidemiologia em tempo real.

Infelizmente, testes de diagnóstico atual, incluindo aqueles emergência 2016 recebimento usar autorizações e acelerado estado, detectar o RNA viral por transcrição reversa cadeia da polimerase (RT-PCR), que requer instrumentação, treinou os usuários, e preparação da amostra considerável. Assim, devem ser enviadas para laboratórios de referência "aprovado", que requer tempo. Com efeito, em agosto de 2016, o Center for Disease Control (CDC) estava perguntando as mulheres grávidas, que tinha sido mordido por um mosquito e com sarna Zika-indicando que esperar uma inaceitável de 2 a 4 semanas antes de aprendizagem se eles foram infectados. Precisamos muito de testes que podem ser feitos no local, com poucos recursos e por pessoal treinado, mas não necessariamente licenciado.

Este vídeo demonstra um ensaio que atenda a estas especificações, trabalhando com urina ou soro (para pacientes) ou carcaças de mosquito esmagado (para vigilância ambiental), tudo sem muita preparação da amostra. Carcaças de mosquito são capturadas no papel carregando de amônio quaternário grupos (Q-papel) seguidos de um tratamento de amônia para gerenciar riscos biológicos. Estes são então diretamente, sem isolamento de RNA, colocados em tubos de ensaio contendo reagentes liofilizados que precisam sem cadeia de refrigeração. Uma forma modificada de amplificação isotérmica mediada por laço transcrição reversa com destino específico fluorescente etiquetadas sondas displaceable produz a leitura, em 30 min, como um sinal de fluorescência de três cores. Isto é visualizado com um dispositivo portátil, bateria com um filtro laranja. Contaminação direta é impedida com tubos selados e o uso de termolábil uracil DNA glycosylase (UDG) na presença de dUTP a mistura de amplificação.

Introduction

Infecções por vírus transmitidas por mosquitos, inclusive da dengue e chikungunya Zika vírus são sobre as estratégias de gestão imediata de ascensão e a demanda. Vírus da dengue e chikungunya já são endêmicas em muitas das regiões tropicais onde Zika está se espalhando no hemisfério ocidental¹. Zika vírus, como a dengue, é um membro da família Flaviviridae e é nativa da África com um asiático e duas linhagens genéticas africanas². Mesmo que a identificação do vírus Zika remonta a 1947, Zika infecção em humanos permaneceu esporádica há meio século antes de emergir no Pacífico e nas Américas. O primeiro surto rela....

Protocol

Nota: Os mosquitos foram os únicos animais diretamente utilizados neste estudo. Os procedimentos para gerenciar as galinhas, cujo sangue foi usado para alimentar os mosquitos infectados, foram aprovados como IACUC protocolo #201507682 pela propagação cuidados animais institucionais da Universidade da Flórida e Committee.Virus de uso e estudos de infecção do mosquito foram realizado nas instalações da BSL-3 do laboratório de Entomologia Médica de Florida em Vero Beach, FL. RT-lâmpada experimentos foram realizados em laboratório BSL-2 compartilhado por FfAME e LLC de Ciências biomoleculares Firebird em Alachua, FL.

1. projeto de Primers e Stran....

Results

Inicialmente, as performances de cada primer RT-lâmpada (tabela 1) , com sua correspondente substrato de RNA viral, bem como controles negativos foram avaliadas por eletroforese em gel. As primeiras demão RT-lâmpada foram projetadas para alvo NS5 região (RNA-dependente do RNA polimerase) para Zika e Dengue 1 e região nsP2 (proteínas não estruturais P2) para Chikungunya. Modelos foram RNA total extraído de estoques virais cultivadas em células de rim (Vero) do macaco verde.......

Discussion

Vírus transmitidas por mosquitos, incluindo Zika, chikungunya e dengue ameaçam a saúde pública e destaque de surtos recente Zika a necessidade de alternativas de baixo custo deteção de point-of-care para diagnóstico do paciente, bem como para vigilância de mosquito. Métodos de amplificação isotérmica foram desenvolvidos como alternativas acessíveis para sistemas baseados em PCR. Particularmente, RT-lâmpada-based plataformas foram aplicadas para detectar uma grande variedade de agentes patogénicos. No entanto, o uso de pl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iluminador/Sistema de Eletroforese SafeBlue, MBE-150-PLUS	Major Science	MBE-150	Eletroforese em gel
G:BOX F3	Syngene	G:BOX F3	Imagem em gel
LightCycler 480 Instrumento II, 96 poços	Roche Applied Science	05 015 278 001	PCR em tempo real
Amicon Ultra-0.5 Unidade de filtro centrífugo com membrana Ultracel-10	Millipore Sigma	UFC501096	membrana ultrafiltraton para diálise
Eppendorf 5417C Centrífuga	Marshall Scientific	EP-5417C	Centrífuga
Myblock Mini Drybath	Benchmark Scientific	BSH200	drybath
FreeZone Plus 6 litros Cascade Console Freeze Dry System	Labconco	7934020	liofilizador
todos os priers e sondas	IDT	personalizado	RT-LAMP primers e sondas
conjunto dNTP	Bioline	BIO-39049
Trifosfato de Desoxiuridina (dUTP)	Promega	U1191
Bst  2.0 WarmStart  DNA Polimerase	New England Biolabs	M0538L	enzima
WarmStart RTx Transcriptase Reversa	New England Biolabs	M0380L	enzima
RNase Inibidor, Murine	New England Biolabs	M0314L	enzima
Antártica Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372L	enzima
50bp DNA Escada de Degraus	Promega	G4521	marcador
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, branco	Roche Applied Science	4729692001	análise RT-LAMP em tempo real