O efeito da aplicação do óleo essencial de tomilho na carga microbiana durante a secagem da carne

Resumo

Microorganismos tais como Escherichia coli que contaminam produtos à base de causam doenças transmitidas por alimentos. O uso de óleos essenciais no processo de secagem de carne não tem sido estudado profundamente. Aqui, apresentamos um novo método de aplicar o óleo essencial de tomilho a carne durante a secagem para reduzir a carga microbiana em carne seca.

Resumo

Carne é uma refeição rica em proteínas que é usada na preparação de carne seca, um lanche de alimento popular, onde a preservação e segurança são importantes. Para garantir a segurança alimentar e para prolongar a vida de prateleira da carne e produtos cárneos, o uso de conservantes sintéticos ou naturais têm sido aplicados para controle e eliminar as bactérias transmitidas por alimentos. Um crescente interesse na aplicação dos aditivos de alimento natural para carne aumentou. Microorganismos, tais como Escherichia coli, contaminam a carne e produtos cárneos, causando doenças transmitidas por alimentos. Portanto, é necessário melhorar o processo de conservação de carne. No entanto, o uso de óleos essenciais, quando a carne está sendo secada não foi profundamente estudado. A este respeito, há uma oportunidade para aumentar o valor de carne seca e reduzir o risco de doenças transmitidas por alimentos, através da aplicação de óleos essenciais durante o processo de secagem. Neste protocolo, apresentamos um novo método de aplicação de óleo essencial de tomilho (TEO) durante a secagem, especificamente na forma de vapor diretamente em uma câmara de secagem de carne. Para avaliação, usamos a concentração inibitória mínima (CIM) para detectar o número de bactérias nocivas nas amostras tratadas em comparação com amostras raw. Os resultados preliminares mostram que este método é uma opção viável e alternativa para conservantes sintéticos e que reduz significativamente a carga microbiana em carne seca.

Introdução

Secagem como um método tradicional para preservar alimentos tem sido usada desde tempos antigos. Hoje em dia, há um interesse crescente na secagem como um método eficaz para preservação de alimentos a^1,2,3. Ele é usado para fazer uma variedade de carnes processadas especialmente. Dentre os mais well-known é irregular.

Carne seca, um dos mais antigos métodos de preservação de carne, baseia-se na cura e secagem à baixa atividade de água e, portanto, para estender sua vida útil de⁴. Hoje em dia, seca como uma carne curada preservada ainda é muito popular, onde segurança alimentar, sabor e textura são essenciais. Preparação de carne seca pode ser usada para praticamente qualquer tipo de carne, incluindo carne bovina, carne de porco, aves de capoeira ou jogo⁵, e requer a cortar a carne em tiras de magras e secá-lo. Geralmente, marinar a carne em uma solução de cura ou fumar são usados juntamente com secagem para dar a carne seu sabor característico⁶.

Apesar do grande interesse de secagem para verdadeiramente preservar alimentos, o risco de surtos de intoxicação alimentar por e. coli através da carne mal seca é crítico e precisa ser controlada. Existem alguns estudos relatando a surtos de gastroenterite transmitidas por alimentos particularmente com Escherichia coli O157: H7, atribuída ao calor inadequado processamento durante a secagem de casa. Casos semelhantes ocorreram mesmo no preparado comercialmente seca^7,8,9. Levine et al. ¹⁰ propostas que microorganismos de origem alimentar podem sobreviver a condições de secagem moderadas (cerca de 60 ° C) usadas pelos produtores de charque comerciais. Escherichia coli O157: H7 surtos de doenças transmitidas por alimentos no meio da década de 1990 foram atribuídos a terra secada carne produtos^6,11. Curiosamente, em todos os casos anteriores, o principal risco é causado por patógenos bacterianos reconhecidos como viável mas não-viáveis (VBNC). Sob várias tensões como mudanças de temperatura ou a fome, as células de e. coli poderiam entrar em um estado particular conhecido como o VBNC estado^12,13. As células VBNC podem ser ressuscitadas volta para células viáveis por exposição a condições adequadas e em seguida, apresentar uma ameaça para a saúde humana devido à contaminação de origem alimentar^14,15. Isto significa que se a carne é consumida imediatamente após a secagem do produto é seguro. No entanto, no caso de armazenamento inadequado, tais como aumento de umidade, há um alto risco de reativação de patógenos e crescimento microbiano.

Além de métodos de secagem e marinada, há uma alta demanda de consumidores para usar produtos naturais como uma alternativa aos aditivos para melhorar a qualidade de alimento^16,17. Tem havido um interesse particular na aplicação dos aditivos de alimento natural para carne em vez de conservantes sintéticos clássica^18,19,20,21. Mesmo que haja uma falta de evidência experimental suficiente no uso de óleos essenciais quando a secagem da carne, primeiras pesquisas neste campo já demonstra resultados positivos^22,23.

Desde a idade média, as pessoas reconheceram compostos do óleo essencial (EOCs) para seus chracteristics antimicrobiano, inseticida e antiparasitários^24,25,26. Hoje, EOCs fazem parte de um dos grupos mais importantes de compostos naturais bioativos. Entre os diferentes EOCs, timol é um do mais well-known. É composto por mais de 85% de TEO²³. Este fenol previne a deterioração microbiana e química quando adicionado à comida. Além disso, suas propriedades antibacterianas podem ser melhoradas em combinação com outros conservantes naturais^2,,^27,28,29,30. Hoje em dia, o tomilho (Thymus vulgaris), uma erva que pertence à família Lamiaceae , tem sido reconhecida como um agente flavoring, bem como um conservante de carne muito eficaz³¹. Um estudo realizado por García-Díez et al. ³⁰ em produtos cárneos encontrado que TEO demonstraram um padrão de inibição mais amplo contra agentes patogénicos de origem alimentar quando comparado com outros óleos essenciais. Portanto, há uma oportunidade para aumentar o valor de carne seca e reduzir o risco de doenças transmitidas por alimentos, através da aplicação de óleos essenciais durante o processo de secagem.

Neste protocolo, apresentamos um novo método de aplicação TEO durante a secagem de carne, especificamente, usá-lo em forma de vapor diretamente em uma secagem de câmara. Para avaliação, usamos o MIC para determinar a ausência de bactérias patogênicas em amostras tratadas em comparação com os brutos. Os resultados preliminares mostram que este método é uma alternativa altamente eficaz para conservantes sintéticos e que reduz significativamente a carga microbiana em carne seca.

Protocolo

1. preparação de carne

1. Obter um lombo curto de carne (carne fresca de bíceps femoris) de um talho local e transferi-lo para o laboratório.
   Nota: É recomendável para transportar o lombo de carne à temperatura ambiente (20-25 ° C), por um período não superior a 20 min em um saco hermético selado.
2. Para esterilizar a superfície externa do músculo bovino, um laminar de segurança, lave o músculo por pulverização com etanol a 70% (v/v) por 10 s usando uma garrafa de 500 mL. Aplica 0,025 g de etanol por 1 cm² de superfície muscular.
3. Remova assepticamente a superfície exterior da carne com uma faca para evitar etanol remanescente no interior do músculo. Remova cerca de 3 mm do interior muscular para manter a uniformidade de superfície do músculo.
4. O músculo em um saco plástico selado do pacote e transferi-lo para um freezer.
5. Armazene o músculo a-18 ° C para 1 dia. Em seguida, descongele o músculo congelado a 4 ° C, durante 6 h.
   Nota: Para descongelar, é recomendável mover o músculo do congelador para o frigorífico.
6. Em uma armário de segurança laminar, fatie cada músculo em 0,5 centímetro de espessura com um cortador de carne. Em seguida, com uma faca corte em pequeno 5 × 2,5 cm² amostras retangulares.
7. As amostras de carne retangular em sacos de plástico do pacote e armazená-los no freezer a-18 ° C para uso posterior.

2. preparação do inóculo padronizado e procedimento de inoculação em um armário de segurança Laminar

1. Prepare o inóculo padronizado (1,5 × 10⁸ UFC/mL) de e. coli ATCC 25922 para inocular as amostras de carne.
   1. Para a preparação do inóculo estoque, primeiro dispense a cultura bacteriana liofilizada (entregada pelo fornecedor) para um tubo esterilizado 15 mL pré-preenchido com 10 mL de esterilizado em buffer Mueller Hinton caldo (BMHB). Cultivar esta suspensão por 24 h a 37 ° C.
      1. Prepare a solução-mãe bacteriana da seguinte maneira: tomar aproximadamente 0,1 - 0,2 mL de suspensão bacteriana e diluir dentro de um frasco de 20 mL fechado com uma rolha de borracha com uma tampa de alumínio preenchida com 15 mL de BMHB esterilizado. Cultivar esta suspensão por 24 h a 37 ° C.
      2. Armazenar no frigorífico a 4 ° C, para a preparação do inóculo padronizado.
   2. A partir da solução estoque (consulte a etapa 2.1.1) de E coli toma aproximadamente 0,1 - 0,2 mL de suspensão bacteriana e diluir em um plástico de 15 mL esterilizado tubo preenchido com 10 mL de esterilizado em buffer Mueller Hinton caldo (BMHB). Incube o tubo a 37 ° C por 24 h.
   3. Para a preparação do inóculo padronizado (1,5 × 10⁸ UFC/mL), adicione pequenas quantidades desta suspensão em um tubo de 15 mL esterilizado previamente preenchido com 10 mL de BMHB esterilizado.
   4. Cuidadosamente a mistura de vórtice e medida da densidade óptica (OD) em 600 nm por um densitômetro³².
   5. Repita as etapas 2.1.3 - 2.1.4 até o OD expressado como o valor de McFarland é aumentado por 0,5 em comparação com o valor de BMHB limpo.
2. Para o procedimento de inoculação, coloca as amostras de carne retangular em duas folhas de alumínio diferentes (20 cm x 30 cm), um para as amostras de controle e o segundo para as amostras de carne inoculados.
   1. Sobre a segunda folha de alumínio, inocule as amostras de carne crua rectangular com 800 µ l de suspensão de bactérias da linhagem selecionada (isto corresponde a 1,2 × 10⁸ UFC por amostra de carne), distribuindo uniformemente o inóculo na superfície.
      1. Distribuir 400 µ l de um lado da amostra e espalhe suavemente usando um propagador da pilha de estéril na superfície. Deixe-os secar por 10 min. repetir o mesmo procedimento para o resto da suspensão do outro lado da amostra.

3. secagem e aplicação de TEO

1. Transferir as duas folhas de alumínio contendo as amostras de carne retangular da segurança laminar do armário ao secador: Cubra cada um com papel alumínio e coloque as amostras dentro do secador.
2. Realize a secagem em um secador padrão de laboratório.
   Nota: em primeiro lugar, pré-aqueça o forno a 55 ° C. Este procedimento pode durar por 20 min.
   1. Seca as amostras de controle para 6 h a 55 ° C, com valores de umidade relativa do ar variando entre 30-45% de secagem.
      Nota: Valores de umidade relativa do ar secagem variam no tempo, dependendo da taxa de evaporação do líquido da carne.
3. Calcular o volume de TEO aplicado e expressar a concentração de óleo essencial como um volume de TEO por volume secador (ar mL/L). Por exemplo, a dose de 1,5 mL de TEO em 53 L (volume do secador) resulta em uma concentração de ar 0,028 mL/L. Para determinar o MIC de TEO para Escherichia coli, use doses de 1,5 mL (ar de 0,028 mL/L), 1 mL (ar de 0,019 mL/L) e 0,75 mL (ar de 0,014 mL/L).
4. Antes da secagem, para a aplicação do TEO vapores (com timol como o principal composto 79%), mergulhar num filtro de papel (12 cm x 20 cm) com uma dose de 1,5 mL de TEO e coloque o secador na frente do ventilador.
5. Seca as amostras de carne TEO tratada usando o mesmo procedimento para as amostras de controle (medidas 3.1 e 3.2).
   Nota: Após a secagem processo termina e amostras são removidas, ligue o forno por 3 h a 80 ° C e definir a indicação de válvula de ar para 100% de ar para limpar os resíduos do óleo essencial do forno.

4. microbiana análise

1. Antes da inoculação de carne com bactérias, examine as amostras de carne para qualquer adulteração. O aparecimento de limo e a detecção de qualquer cheiro forte e pungente são indicativos de deterioração de carne. Se a textura parece nojenta, a bactéria pode ter começado a multiplicar-se sobre a superfície da carne.
2. Para avaliar a eficiência da inoculação, testar as amostras inoculadas crus para a presença de Escherichia coli ATCC 25922 e compará-los com amostras de controlo não-inoculadas antes do processo de secagem. Para essa finalidade:
   1. Lave cada amostra de carne (2 amostras de controle e 2 amostras inoculadas). Suspenda a cada amostra de carne em um frasco esterilizado com água peptona tamponada (8,5 g de NaCl, 1 g de peptona, 5 comprimidos de fosfato-salino e 1 g de Polissorbato 80 em 1 litro de água) em uma proporção de 01:10 (p/v) com uma faixa de pH de 7-7.3. Shake, utilizando um agitador a 140 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente.
      Nota: Lavagem imediatamente após o procedimento de inoculação.
   2. Avalie o número de bactérias por um procedimento ajustado de chapa gota 6 × 6 resumido por Chen, Nace e Irwin³³ na Plate Count Agar (PCA) e ágar MacConkey (MCA).
      Nota: O método de soltar 6 × 6 usa o método de micro diluição do caldo para preparar 10 vezes seriais diluições da amostra investigada com uma pipeta multicanal, que é menos intensivo e mais econômico em comparação com o método convencional^33, de trabalho ³⁴.
   3. Cultive as diluições de série amostra 10 vezes pelo procedimento de chapa gota 6 × 6, para a avaliação de e. coli.
      Nota: Particularmente para o método de queda de 6 × 6, para cultivo uso seis 5 µ l-gotas, de seis seleccionados diluições da amostra investigada com uma pipeta multicanal. Em placas de Petri devidamente secas, as gotas de absorvem rapidamente sobre o agar e o plantio por esse método é muito conveniente e gerenciável³⁴.
   4. Incube as placas de Petri a 37 ° C por 24 h. Após o período de cultivo, avalie o número de colônias de Escherichia coli sobre os pratos de Petri (CFU g^-1 de carne seca), conforme descrito na seção 5.
3. Após a secagem, pegue duas amostras secas inoculadas e compará-los com duas amostras de controle não-inoculadas secas para viável, Escherichia coli, respectivamente. Para determinar a presença ou ausência de Escherichia coli dessas quatro práticas de s, realizar o processo de pré-enriquecimento de cada amostra de carne como segue:
   1. Suspender a cada amostra de carne em um frasco esterilizado com água peptona tamponada (ver passo 4.2.1) e agitar utilizando um agitador a 140 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente. Então incube cada balão a 37 ° C durante 6 h para pré-enriquecimento.
   2. Para a avaliação e o cultivo das bactérias, siga o mesmo procedimento como descrito nos passos 4.2.2 - 4.2.4.

5. análise de resultados

1. Após a incubação estiver concluída, retire os pratos de Petri da incubadora e rever os resultados como segue:
   1. Para avaliar o número total de colônias, examinar as placas para a presença de bactérias aeróbias mesófilas na PCA (manchas brancas) e típico de e. coli colônias (vermelhas de rosa escuro) na MCA. Se o patógeno é ausente, os dois ágares não apresentam nenhum crescimento.
   2. Contar as colônias e determinar a quantidade de Escherichia coli (UFC/g^-1 de carne seca) presente.
      Nota: Conte o número de colônias (N) em duas diluições consecutivas contendo 30 ou menos colónias por gota (Figura 1). O número N de n^-1 UFC/g de carne seca é determinado como segue³⁵
      
      onde, C é a soma das colônias em gotas todos contadas, v é o volume de diluição da amostra utilizada por gota (aqui, 0,05 mL), ₁ de n é o número de gotas utilizadas na primeira diluição, n₂ é o número de gotas usado na segunda diluição, e d representa a diluição do qual as primeiras contagens foram capturadas.
2. Para analisar os dados microbiológicos, converta o número de colônias para log UFC g^-1 e sujeitá-los à análise de variância (ANOVA) para os principais efeitos do tratamento³⁶.
   1. Realize o teste de Tukey diferença significativa honesto (Tukey HSD) para múltiplas comparações média³⁶ e determinar as diferenças significativas entre os tratamentos.

Resultados

Tínhamos primeiro anteriormente desenvolvido esse método usando o óleo essencial do orégano (OEO) para melhorar a segurança alimentar e aumentar o valor de carne seca. Em geral, as experiências anteriores mostraram que a e. coli entrará no estado VBNC durante a secagem como uma estratégia de sobrevivência. Isso é demonstrado pelo fato de que não havia nenhuma bactéria viáveis após a secagem terminou²². Portanto, o processo de pré-enriquecimento para 6 h fo...

Discussão

Pesquisa anterior mostrou que os microrganismos que causam doenças transmitidas por alimentos sobrevivem secagem¹⁰. Portanto, é necessário aplicar conservantes antes da secagem para garantir a segurança alimentar. Neste estudo, enfocamos usando TEO. A razão é dupla: primeiro, há uma alta demanda de consumidores para usar produtos naturais como aditivos alternativos para melhorar a qualidade de alimento¹⁶; Em segundo lugar, um estudo anterior demonstrou resultados positivos ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cortador de carne	Kalorik	KP 3530	de Miami Gardens, FL, EUA
Armário de segurança laminar	Faster s.r.l		da Itália
Garrafa squeeze de 500 mL	Merci	632 524 325 025	da CZ
Secador de laboratório padrão UFE 400	Memmert	DE 66812464	da Alemanha
Incubadora	BT 120	N/A	da CZ
Frigorífico e congelador	Bosch	KGN34VW20G	de DE
Densitometer	Biosan	220 000 050 122	Latvia; fornecedor Merci, CZ
em>Escherichia coli ATCC 25922	Oxoid	CL7050	de CZ
Vortex	Chromservis	22008013	de CZ
Tubos de plástico esterilizado 15 mL	Gama	331 000 020 115	de CZ, fornecedor
Merci 20 mL frasco de injeção	frasco saudável	hvft169	da China
20 mm rolha de borracha butílica estéril	Merci	22008013	da CZ
tampa de alumínio de 20 mm	Frasco saudável	N / A	da China
Óleo essencial de tomilho	Sigma Aldrich	W306509	de St Louis, MO, EUA
Mueller Hinton Caldo	Oxóide	CM0337	da CZ
NaCl	Penta	16610-31000	de CZ
Peptona	Oxóide	LP0034	de CZ
Solução salina tamponada com fosfato	Sigma Aldrich	P4417	de CZ
Polissorbato 80 (Tween 80)	Roth	T 13502	de DE, fornecedor P-lab
Shaker SHO-1D	Verkon	DH. WSR04020	de CZ,  10 - 300 rpm. 350 x 350 mm com uma plataforma para frascos
Etanol 70%	Bioferm	N/A	de CZ
MacConkey Agar	Oxoid	CM007	de CZ
Plate Count Agar	Oxoid	CM0325	de CZ
Papel de filtro	Merci	480 622 080 040	de CZ
Balões Erlenmeyer 250 mL	Simax	610 002 122 636	Fornecedor Merci CZ
Pipeta multicanal	Socorex	S852820	da Suíça; fornecedor P lab,
CZ Microtiter plate	Gamma	V400916	CZ
Microlitre pipeta 100-1000 μ L	Eppendorf	333 120 000 062	da Alemanha; fornecedor Merci, CZ