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Artigo de método

Avaliação da função de vesículas extracelulares durante a infecção da malária

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DOI:

10.3791/57067

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14 de fevereiro de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Fribourg

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Neste trabalho, descrevemos os protocolos para investigar o papel das vesículas extracelulares (EVs), lançado pelo Plasmodium falciparum infectado hemácias. Em particular, enfocamos as interações de EVs com células endoteliais.

Resumo

A malária é uma doença fatal causada por parasitas Plasmodium , por p. falciparum sendo a mais prevalente no continente africano e responsável pela maioria das mortes relacionadas com a malária globalmente. Vários fatores, incluindo a fixação do parasita em tecidos, disfunção vascular e respostas inflamatórias influenciam a evolução da doença em pessoas infectadas por malária. Por p. falciparum-glóbulos vermelhos infectados (iRBCs) liberar pequenas vesículas extracelulares (EVs) contendo diferentes tipos de moléculas de carga que medeiam a comunicação celular e patogênese entre parasita e hospedeiro. SVE eficientemente é ocupados por células na qual eles modulam sua função. Aqui vamos discutir estratégias para abordar o papel do EVs em interações parasita-hospedeiro. Primeiro, nós descrevemos um método simples para a rotulagem e rastreamento EV internalização pelas células endoteliais, usando um corante de vinculador de célula verde. Em segundo lugar, nós relatamos uma maneira simples de medir a permeabilidade através de uma monocamada de células endoteliais usando um fluorescente etiquetado dextrano. Finalmente, mostramos como investigar o papel de pequenas moléculas de RNA não-codificante em função da célula endotelial.

Introdução

De acordo com a Organização Mundial de saúde, havia 212 milhões de novos casos de malária em todo o mundo em 2015 e aproximadamente 429.000 pessoas morreram, principalmente de crianças menores de cinco anos de idade1. Os mecanismos, levando a doença grave, que é frequentemente associada com disfunção vascular, permanecem mal-definidas2. Plasmodium- iRBCs secretam esferas pequenas membrana bi-lipídica conhecidas como vesículas extracelulares (EVs). Sabe-se que esses EVs são potencialmente relevantes para o processo de infecção e a resposta imune do hospedeiro à infecção; no entanto, pouco se sabe sobre a função exata destas pequenas vesículas durante a infecção de malária3. É possível que eles desempenham duas funções importantes: por um lado, eles possam contribuir para a patogênese ativando os macrófagos4,5; e, por outro lado, eles podem mediar a comunicação celular entre parasitas e entre parasitas e anfitrião6,7. Na verdade, parasitas podem transferir proteínas ou ácidos nucleicos entre si através de EVs. Por exemplo, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs pode transferir factor de virulência Serum Resistance-Associated (SRA) e pode ter como alvo outros T. brucei e o host de eritrócitos8. Além disso, por p. falciparum- iRBCs se comunicar entre si através da transferência de ácidos nucleicos dentro EVs. Isso permite que os parasitas otimizar e sincronizar o seu crescimento. Na verdade, EVs podem ser o grande regulador da conversão de Gametócito e, portanto, contribuir para o Regulamento da transmissão etapa7.

Não só fazem EVs regulam os parasitas, eles também mediam interações parasita-hospedeiro. Recentemente, descobri que EVs de iRBCs contenham derivados de anfitrião microRNAs (miRNAs; pequenas espécies de RNA no intervalo de 21-25 nucleotides9) que foram retomadas por células endoteliais humanas. Os miRNAs em EVs formam complexos com Ago2 um estábulo (membro o silenciamento de RNA-induced complex), que uma vez entregue para as células de destinatário, é capaz de especificamente silenciar a expressão de gene e que afetam as propriedades de barreira dos10células. Protocolos padrão foram desenvolvidos para investigar a função do EVs. Aqui, primeiro descrevemos um protocolo que permite que a rotulagem fluorescente do EVs para investigar sua absorção pelas células do destinatários. Além disso, usando um microscópio confocal, é possível rastrear o destino o EV no interior da célula. Vários corantes fluorescentes podem ser usados para rastrear EVs. O corante reativo-amina, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein diacetato succinimidil éster (CFSE) e fluorescentes de calceína-AM se tornar uma vez dentro de vesículas. Nós preferimos usar o rótulo anfifílica, PKH, porque dá um sinal mais brilhante e mais uniforme. Essa abordagem fornece informações importantes para compreender as interações entre células destinatários e EVs. Enquanto em alguns casos EVs se ligam à superfície das células, algumas vesículas rapidamente são retomadas. Após absorção, EVs entregam suas cargas para as células, em que exercem suas funções reguladoras.

Aqui, descrevemos um protocolo para medir a função de barreira de células endoteliais em vitro quantificando a transferência de uma fluorescente dextran através de uma monocamada celular. Marcadores mais sensíveis podem ser usados como marcadores radiolabeled. No entanto, eles exigem precauções especiais de segurança para uso. Outros ensaios existem para medir a função de barreira em vitro como resistência elétrica transendothelial (TEER), que mede a integridade da junção apertada. Finalmente, Visualizar ZO-1, uma proteína da junção apertada, por imunofluorescência permite a avaliação da integridade da junção apertada como bem10. Desde EVs são entidades complexas e heterogêneas, contendo várias cargas com característica potencial de regulamentação, é útil para overexpress um RNA específico para estudar seu efeito sobre a célula de destinatário. Portanto, nós também definir um protocolo que visa gerar linhas de células estáveis expressando a miRNA de juros10.

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Protocolo

Hemácias humanas foram obtidas a partir do sangue de doadores saudáveis, em conformidade com as diretrizes da Swissethics (swissethics.ch).

Nota: Culturas de parasita por p. falciparum (3 7) EV produção foram anteriormente descritas em Mbagwu, et al. 11 porque por p. falciparum é um patógeno humano, consulte os regulamentos locais para manipulação. As culturas devem ser mantidas estéril todo o tempo.

1. a fluorescência rotulagem de EVs

Nota: O procedimento a seguir aproveita a tecnologia de rotulagem estàvel incorporar uma tintura fluorescente verde (PKH67) com grandes caudas de alifáticas na região lipídica da membrana EV. A reação é realizada em um final de coloração volume contendo uma concentração final de 20 µM de PKH67 200 µ l. Executar todas as etapas, à temperatura ambiente (20-25 ° C)

  1. Lugar de 100 µ g de EVs em 1 mL de PBS em um tubo de microcentrifugadora.
  2. Centrifugue o EVs em um tubo de microcentrifugadora na velocidade máxima (20.000 x g) durante 7 min a pelota.
    Nota: Desde que o hemozoin está presente no EVs, uma pelota de vermelho-escuro acastanhada deve ser observada. Se o sobrenadante é avermelhado, então tenho lysed o SVE.
  3. Após a centrifugação, Aspire o sobrenadante cuidadosamente, para evitar a remoção de qualquer EVs.
    Nota: Minimize a quantidade de buffer restante presente antes resuspending EVs em diluente C a fim de aumentar a reprodutibilidade e a eficiência da coloração.
  4. Resuspenda o pellet EV em 100 µ l de diluente C (2 X suspensão EV) e pipeta suavemente para segurar a dispersão completa.
  5. Prepare um novo tubo de microcentrifugadora e adicionar 4 µ l da solução etanólica de tintura PKH67 a 100 µ l de diluente C. Vortex bem para misturar. Prepare esta solução de tintura de 2x (40 µM) imediatamente antes da coloração.
    Nota: Para evitar coloração heterogênea, não adicione a solução etanólica de tintura de PKH67 diretamente para a pelota de EV.
  6. Rapidamente, combine a 100 µ l de 2 X suspensão EV (etapa 1.4) com a 100 µ l de 2 X solução corante (passo 1.5). Em seguida, misture a amostra pipetando acima e para baixo 10 vezes.
  7. Incube a suspensão de EV/corante da etapa 1.6 por 5 min, protegida da luz e a mistura vortexing 3 - 4 vezes durante a incubação de 5 min.
    Nota: Incubando a suspensão EV/corante para tempos mais longos não fornece nenhuma vantagem, pois a coloração é tão rápida.
  8. Parar a reação de coloração pela adição de um volume igual (200 µ l) de soro e incubar durante 1 min permitir a ligação de corante em excesso.
    Nota: Antes de parar a coloração, empobrecem o soro de EVs por centrifugação a 20.000 x g por 20 min.
  9. Lavar 3 vezes com PBS e spin-down a 20.000 x g durante 5 min. Ressuspender o SVE em 100 µ l de PBS para atingir uma concentração final de 1 µ g / µ l.

2. visualize a absorção de EVs por microscopia Confocal

Nota: O seguinte protocolo descreve o rastreamento de EV internalização pelas células endoteliais, cultivadas em lamelas de vidro. As células endoteliais são semi imortalizadas células endoteliais da medula óssea humanas, conforme descrito em12.

  1. Trabalhando em um ambiente estéril, revesti as lamelas com um excesso de 0,01% poli-L-lisina, durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT).
  2. Aspirar a solução de poli-L-lisina e permitir as lamelas secar completamente.
  3. Realize uma contagem de células endoteliais viável usando Trypan azul exclusão e um hemocytometer.
  4. Transferi 1 x 105 células endoteliais em 1 mL de endotelial célula crescimento meio completo contendo a mistura de suplemento para as lamelas de poli-L-lisina-revestido e deixar que as células crescem a uma monocamada.
    Nota: O meio contém fatores de crescimento que permitem que as células para formar uma monocamada e para formar junções apertadas.
  5. Uma vez que as células formam uma monocamada, cuidadosamente Aspire o meio e adicione 1 mL de meio fresco para lavar as células. Repeti a lavagem mais uma vez. Adicionar 50 µ g de PKH67-rotulado EVs e incubar durante 4 h.
    Nota: Para localizar o ponto de tempo ideal para absorção, um curso de tempo pode ser executado.
  6. Após 4 h, Aspire o meio e lavar as células 3 vezes com PBS para remover o excesso e desacoplados EVs. Fixe as células com 3% de solução de paraformaldeído em PBS por 15 min.
    Nota: Metanol pode disrupt actina durante o processo de fixação; Portanto, é melhor evitar qualquer metanol contendo álcool ou outro fixador base solvente. É recomendável usar o formaldeído livre de metanol como um fixador.
  7. Lave as células 3 vezes com PBS. Adicionar cuidadosamente 250 µ l de 0,1% Triton X-100 em PBS para permeabilize as células. Incube a RT por 5 min.
  8. Lavar 3 vezes com PBS. Adicione 400 µ l de tampão de bloqueio (5% BSA em PBS) por 30 min em RT para bloquear a ligação não-específica.
  9. Lave as células uma vez com PBS. Prepare a solução de coloração por diluição 5 µ l de solução-mãe faloidina em 200 µ l PBS/1% BSA por cada lamela. Pipetar 200 µ l da solução de coloração na lamela e incube por 20 min no RT
  10. Lavar 3 vezes com PBS. Counterstain o DNA por 30 s com Hoechst 33342 em uma concentração final de 2 µ g/mL em 200 µ l de PBS.
  11. Lave 2 x lamela adicionando 400 µ l de PBS. Cuidadosamente pegue a lamela com fórceps e invertê-lo no topo de uma gota de media mídia de montagem sobre uma lâmina de vidro. Remover suavemente a mídia em excesso com um lenço e selar cada lado com as unhas pintadas.
  12. Armazenar os slides protegidos contra a luz a 4 ° C.
  13. Visualizar as células usando um microscópio confocal a laser excitações 543, 488 e 405 nm e um 63 X, objectivo de óleo at 1.3 com emissões fluorescentes em 450-470 nm (azul), 505-530 nm (verde) e 620 nm.
    Nota: Resultados de coloração típica F-Actina são mostrados na Figura 1.

3. endothelial da pilha permeabilidade

Nota: Permeabilidade da célula endotelial é avaliada medindo-se a transferência de rodamina B isotiocianato-dextrano (média MW 70.000) através da monocamada de células endoteliais. Dextrano fornece uma excelente ferramenta para estudar a permeabilidade vascular.

  1. Contagem células endoteliais viáveis usando exclusão de azul de Tripan 0,4% e um hemocytometer.
  2. Placa em uma densidade de 0,6 x 105 células de confluência no inserções 24-poço de cultura de tecidos (0,4 µm de tamanho de poro) e deixar intacta durante pelo menos 5 dias formar monocamadas diferenciadas, as células endoteliais. Atualize o meio cada segundo dia.
  3. Uma vez que as células de alcançar uma monocamada, carregar o EVs (50 µ g em 1 mL) na câmara alta. Adicione o dextran-rodamina para o poço de cima de uma concentração final de 20 mg/mL. Incube a 37 ° C com 5% CO2células.
  4. Monitore a transferência do dextran fluorescente ao fundo bem pela medição de emissão de fluorescência de alíquotas médias de 40 µ l. Configure o leitor de microplacas multi rótulo em 544 nm de excitação e emissão de 590 nm para medições.
    Nota: A quantidade de dextrano difusa pode ser quantificada usando as curvas de calibração estabelecidas com a solução-mãe. Além disso, experimentos cinéticos podem ser realizados através da remoção de pequenas amostras do meio exterior da câmara durante um curso de tempo (Figura 2). Mesmo sem qualquer tratamento, o dextran vai difundir através da monocamada de células.

4. determinar a sensibilidade de puromicina

Nota: Antes de transducing linhas celulares com lentivirus, é importante determinar a curva de matar de uma droga selecionada para essa linha de célula específica. Para determinar a quantidade mínima de concentração de fármaco necessária para matar todas as células, execute um experimento de resposta de dose usando doses incrementais da droga selecionada. Porque cada linha de células de mamíferos tem uma sensibilidade diferente, antes a experimentação, a concentração ideal do antibiótico deve ser determinada pelo desenvolvendo a titulação de curva de matar conforme detalhado abaixo.

  1. Conte as células usando o hemocytometer. Ressuspender as células endoteliais em uma concentração de 1 x 105 células/mL no meio que o crescimento endotelial completo célula contendo a mistura de suplemento.
  2. Placa 1 x 104 células em uma placa de 96 poços em um volume final de 100 µ l do meio de crescimento de célula endotelial.
  3. Adicione 100 µ l de meio contendo o antibiótico para obter uma concentração de 0,1-10 µ g/mL (ver Figura 3).
  4. Examine a viabilidade celular a cada 2 dias sob um microscópio de luz usando um objectivo X 20. Cultura das células por 10-14 dias e substituir a mídia contendo puromicina cada 2-3 dias dependendo do crescimento celular.
  5. Adicionar 10 µ l/poço MTS reagente em cada poço, mistura e incube por 4 h a 37 ° C em condições de cultura padrão.
  6. Agitar a placa brevemente num agitador e medir a absorvância de células tratadas e não tratadas usando um leitor de placas em 490 nm (Figura 3).

5. transdução de células endoteliais com vetor de Lentivirus

  1. Placa 1 x 105 células endoteliais em 1 mL de meio completo no dia anterior a transdução. Execute a transdução quando as células chegaram a confluência de 50-80%.
  2. Descongelar o lentivirus no gelo e fazer alíquotas dos estoques virais para evitar ciclos de congelamento e descongelamento. Spin para baixo o material a 200 x g por 30 s, em tubos antes de abrir para evitar derramamento.
  3. Adicione brometo de hexadimethrine para as células em uma concentração final de 8 µ g/mL.
    Nota: Brometo de Hexadimethrine ajuda a eficiência de transdução, no entanto em alguns casos, pode ser tóxico para as células. Portanto, a concentração ideal deve ser determinada através da realização de uma curva de matança antes da transdução.
  4. Agite a placa suavemente para misturar. Adicionar a quantidade apropriada de partículas virais (entre 0,5-2 x 106 partículas) em um multiplicity apropriado de infecção (MOI) e agite a placa suavemente durante 30 s para misturar.
  5. Centrifugue a mistura de partícula viral-célula na centrifugar RT por 45 min a 300 x g para aumentar a eficiência de transdução. Incube a mistura de partícula viral-célula a 37 ° C durante a noite.
  6. Retire cuidadosamente o meio contendo partículas viral e descartar adequadamente. Substituí-lo com meio de cultura completo fresco, previamente aquecido.
  7. Iniciar a seleção com puromicina no segundo dia: remover o meio e substituí-lo por meio fresco contendo a concentração correta de puromicina conforme determinado previamente na seção 4 (Figura 3).
  8. Colher células após puromicina e isolar o RNA usando um RNA isolando kit seguindo as instruções do fabricante.
  9. Realizar a síntese do cDNA com o selecionado miRNAs usando uma transcrição reversa kit (veja a Tabela de materiais).
  10. Configure a reação de qPCR de acordo com o citado protocolo13.

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Resultados

Aqui, descrevemos os protocolos para investigar as interações de EVs com células hospedeiras. A absorção de fluorescente etiquetadas EVs é monitorada pela microscopia confocal (Figura 1). Células endoteliais eficientemente pegam EVs, porém o tempo de incubação com EVs pode ser otimizado para controlar a absorção. Para uma melhor localização de EVs no interior das células, mancha actina com faloidina. Em seguida, usamos um filtro de membrana no topo do qual cr...

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Discussão

Diversos parasitas, incluindo Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania e Trichomonas desencadear a liberação de EVs pela célula hospedeira infectada. Dependendo dos patógenos, os EVs lançados podem modular a resposta imune do hospedeiro ou mediar a comunicação celular entre os parasitas6. No entanto, há poucas evidências sugerindo como essas pequenas vesículas contribuam para a doença da malária. Aqui, descrevemos várias maneiras de investigar a função do EVs durante a infecção de Plasmodium ....

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Financeiramente, este estudo foi suportado em parte pela Fundação Novartis medical - pesquisa biológica (para PYM), o Gottfried e Julia Bangerter-Naraa-Stiftung (para MW e PYM) e a piscina de pesquisa da Universidade de Friburgo (para PYM). Subsídios adicionais incluem as bolsas de excelência de governo suíço para estrangeiros os estudiosos (KAB e SM). Agradecemos a Isabelle Fellay e Solange Kharoubi Hess para suporte técnico.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PKH67 verde fluorescente ligante celular mini kitsigma-aldrichmini67-1kt
diluente csigma-aldrichg8278
poli-l-lisinasigma-aldrichp8920
pbsthermofisher - gibco10010023
faloidina cf594biotium#00045
hoechst 33342ThermoFisherH3570
ProLong Gold Antifade MountantThermoFisherP36934
Isotiocianato de Rodamina B– DextranThermoFisherR9379-250MG
Insert com membrana PET transparente Falcon  para placa 24 poçosFalcon353095
Crescimento de Células Endoteliais  Médio MVPromocellC-22020
Dicloridrato de PuromicinaSigma-AldrichP9620-10ML
MTS Kit de Ensaio Colorimétrico de Proliferação CelularBiovisionK300-500
brometrato de hexadimetrinaSigma-Aldrich107689-10G
MISSÃO  MicroRNA Lenti, Humano tem-miR-451aSigma-AldrichHLMIR0583
MISSÃO Lenti microRNA, ath-miR416, Partículas de Transdução de Controle Negativo 1Sigma-AldrichNCLMIR001
MISSÃO  MicroRNA Lenti,NCLMIR0001Sigma-Aldrich
Leica TCS SP5Leica Microsystems
miRNeasy mini KitQiagen217004
TaqMan MicroRNA Kit de Transcrição Reversa 1000 reaçõesThermoFisher4366597
tem-mir-451a  RT/750 PCR rxnsThermoFisher001141
U6 snRNAThermoFisher001973
TaqMan Universal Master Mix II, com UNGThermoFisher4440038
StepOnePlus Sistema de PCR em Tempo RealThermoFisher4376600
Humano

Referências

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