Neste trabalho, descrevemos os protocolos para investigar o papel das vesículas extracelulares (EVs), lançado pelo Plasmodium falciparum infectado hemácias. Em particular, enfocamos as interações de EVs com células endoteliais.
Artigo de método
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Neste trabalho, descrevemos os protocolos para investigar o papel das vesículas extracelulares (EVs), lançado pelo Plasmodium falciparum infectado hemácias. Em particular, enfocamos as interações de EVs com células endoteliais.
A malária é uma doença fatal causada por parasitas Plasmodium , por p. falciparum sendo a mais prevalente no continente africano e responsável pela maioria das mortes relacionadas com a malária globalmente. Vários fatores, incluindo a fixação do parasita em tecidos, disfunção vascular e respostas inflamatórias influenciam a evolução da doença em pessoas infectadas por malária. Por p. falciparum-glóbulos vermelhos infectados (iRBCs) liberar pequenas vesículas extracelulares (EVs) contendo diferentes tipos de moléculas de carga que medeiam a comunicação celular e patogênese entre parasita e hospedeiro. SVE eficientemente é ocupados por células na qual eles modulam sua função. Aqui vamos discutir estratégias para abordar o papel do EVs em interações parasita-hospedeiro. Primeiro, nós descrevemos um método simples para a rotulagem e rastreamento EV internalização pelas células endoteliais, usando um corante de vinculador de célula verde. Em segundo lugar, nós relatamos uma maneira simples de medir a permeabilidade através de uma monocamada de células endoteliais usando um fluorescente etiquetado dextrano. Finalmente, mostramos como investigar o papel de pequenas moléculas de RNA não-codificante em função da célula endotelial.
De acordo com a Organização Mundial de saúde, havia 212 milhões de novos casos de malária em todo o mundo em 2015 e aproximadamente 429.000 pessoas morreram, principalmente de crianças menores de cinco anos de idade1. Os mecanismos, levando a doença grave, que é frequentemente associada com disfunção vascular, permanecem mal-definidas2. Plasmodium- iRBCs secretam esferas pequenas membrana bi-lipídica conhecidas como vesículas extracelulares (EVs). Sabe-se que esses EVs são potencialmente relevantes para o processo de infecção e a resposta imune do hospedeiro à infecção; no entanto, pouco se sabe sobre a função e....
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Hemácias humanas foram obtidas a partir do sangue de doadores saudáveis, em conformidade com as diretrizes da Swissethics (swissethics.ch).
Nota: Culturas de parasita por p. falciparum (3 7) EV produção foram anteriormente descritas em Mbagwu, et al. 11 porque por p. falciparum é um patógeno humano, consulte os regulamentos locais para manipulação. As culturas devem ser mantidas estéril todo o tempo.
1. a fluorescência rotulagem de EVs
Nota: O procedimento a seguir aproveita a tecnologia de rotulagem estàvel incorporar uma tintura fluore....
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Aqui, descrevemos os protocolos para investigar as interações de EVs com células hospedeiras. A absorção de fluorescente etiquetadas EVs é monitorada pela microscopia confocal (Figura 1). Células endoteliais eficientemente pegam EVs, porém o tempo de incubação com EVs pode ser otimizado para controlar a absorção. Para uma melhor localização de EVs no interior das células, mancha actina com faloidina. Em seguida, usamos um filtro de membrana no topo do qual cr.......
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Diversos parasitas, incluindo Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania e Trichomonas desencadear a liberação de EVs pela célula hospedeira infectada. Dependendo dos patógenos, os EVs lançados podem modular a resposta imune do hospedeiro ou mediar a comunicação celular entre os parasitas6. No entanto, há poucas evidências sugerindo como essas pequenas vesículas contribuam para a doença da malária. Aqui, descrevemos várias maneiras de investigar a função do EVs durante a infecção de Plasmodium ........
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Os autores não têm nada para divulgar.
Financeiramente, este estudo foi suportado em parte pela Fundação Novartis medical - pesquisa biológica (para PYM), o Gottfried e Julia Bangerter-Naraa-Stiftung (para MW e PYM) e a piscina de pesquisa da Universidade de Friburgo (para PYM). Subsídios adicionais incluem as bolsas de excelência de governo suíço para estrangeiros os estudiosos (KAB e SM). Agradecemos a Isabelle Fellay e Solange Kharoubi Hess para suporte técnico.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| PKH67 verde fluorescente ligante celular mini kit | sigma-aldrich | mini67-1kt | |
| diluente c | sigma-aldrich | g8278 | |
| poli-l-lisina | sigma-aldrich | p8920 | |
| pbs | thermofisher - gibco | 10010023 | |
| faloidina cf594 | biotium | #00045 | |
| hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Isotiocianato de Rodamina B– Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert com membrana PET transparente Falcon para placa 24 poços | Falcon | 353095 | |
| Crescimento de Células Endoteliais Médio MV | Promocell | C-22020 | |
| Dicloridrato de Puromicina | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Kit de Ensaio Colorimétrico de Proliferação Celular | Biovision | K300-500 | |
| brometrato de hexadimetrina | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSÃO MicroRNA Lenti, Humano tem-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSÃO Lenti microRNA, ath-miR416, Partículas de Transdução de Controle Negativo 1 | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSÃO MicroRNA Lenti, | NCLMIR0001 | Sigma-Aldrich | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Kit de Transcrição Reversa 1000 reações | ThermoFisher | 4366597 | |
| tem-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, com UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Sistema de PCR em Tempo Real | ThermoFisher | 4376600 |
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