Recuperação de fluorescência zigóticos após o clareamento foto análise por frouxidão de cromatina que permite o desenvolvimento do termo

Summary

Frouxidão de cromatina parece estar envolvido no desenvolvimento potencial dos blastómeros. No entanto, não se sabe se a frouxidão de cromatina pode ser usado como um índice confiável para o potencial do desenvolvimento de embriões. Aqui, tem sido descrito um sistema experimental no qual zigotos de frouxidão-avaliada de cromatina podem desenvolver à gestação completa.

Abstract

Imagem ao vivo é uma ferramenta poderosa que permite a análise dos eventos moleculares durante a ontogênese. Recentemente, frouxidão de cromatina ou abertura tem demonstrada ser envolvido no potencial de diferenciação celular de células-tronco embrionárias pluripotentes. Anteriormente foi relatado que em comparação com células-tronco embrionárias, zigotos abrigam uma estrutura extremamente afrouxada cromatina, sugerindo sua associação com sua totipotência. No entanto, até agora, isso não foi resolvido se essa estrutura extremamente solta/abrir cromatina é importante para o potencial do desenvolvimento embrionário. No presente estudo, para examinar esta hipótese, foi desenvolvido um sistema experimental no quais zigotos que foram analisados por fluorescência recuperação após o clareamento foto pode desenvolver a termo sem qualquer dano significativo. Importante, este sistema experimental precisa de apenas um aquecedor térmico-placa além de um laser confocal microscópio. As conclusões deste estudo sugerem que recuperação de fluorescência após análise de análise (FRAP) foto-branqueamento pode ser usado para investigar se os eventos moleculares na cromatina zigóticos são importantes para o desenvolvimento do termo.

Introduction

Após a fertilização, a estrutura da cromatina é alterada dinamicamente, e estrutura da cromatina zigóticos é então eventualmente estabelecido^1,2. Durante este período, em pró-núcleos paternos, proteínas da cromatina dominante é mudada de protamina na histona. A cromatina resultante é extremamente diferente dos espermatozoides e ovócitos femininos em vários pontos (por exemplo, composição variante de histona, modificação de histona). Assim, a cromatina foi formada é pensada para ser importante para o posterior desenvolvimento embrionário. No entanto, apesar dos esforços para revelar os detalhes da estr....

Protocol

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório da Universidade de Yamanashi. O protocolo foi aprovado pelo Comité sobre a ética de experimentos Animal da Universidade de Yamanashi (número de licença: A24-50). Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia tribromoetanol, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Uma visão geral ilustrada dos procedimentos e horário são mostrados na Figura 1 e tabela 1, respectivamente.

1. preparação do RNA mensageiro (In Vitro e transcrição de mRNA eGF....

Results

análise de zFRAP com eGFP-H2B

Devidamente produzida mRNA codificação eGFP-H2B, que é visto como uma banda deslocou causada por poli um rejeito (Figura 2A), foi injetado no citoplasma de zigotos com um corpo polar 2 em 1-3 h após a inseminação (Figura 2B). 8 a 12 h após a inseminação, zigotos com 2 pró-núcleos mostrando a expressão de eGFP-H2B foram coletadas e submetidas a.......

Discussion

Como revelado neste estudo, a análise zFRAP não causa danos críticos para o desenvolvimento do termo, sugerindo que este método é uma ferramenta muito útil para revelar a associação entre eventos moleculares e o potencial do desenvolvimento embrionário. Durante a reprogramação, para as duas câmaras como estado de pilhas do ES, pelo qual o potencial diferencial dessas células torna-se tão elevado como aquele do estágio de duas células, frouxidão de cromatina de mudanças em que comparável com embriões de duas células estág.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
O microscópio confocal de varredura a laser	Olympus	FV1200	FV1000 também pode ser usado para análise FRAP (referência #7)
Placa térmica	Tokai Hit	TP-110RH26
Microscópio invertido	Olympus	IX71
Micro manupilador	Narishige	MMO-202ND
Micro Micromanipulador Pieze	Prime tech	PMAS-CT150
Placa de cultura de 35 mm	Falcom	351008	estilo 35 x 100 mm; para FIV
placa de cultura de 60 mm	Falcom	351007	estilo 60 x 15 mm; para cultura de embriões
Placa de cultura de 50 mm	Falcom	351006	estilo 50 x 9 mm; para manipulação no palco
Placa de fundo de vidro de 50 mm	Matsunami	D910400	placa de 50 mm, tamanho do orifício de 27 mm e phi; para análise FRAP
Óleo mineral	Produtos químicos de espicialidade orgânica	625071	Para análise FRAP nas placas de fundo de vidro
Óleo mineral	Sigma	M8410-1L	Para fertilização in vitro e capilar de vidro de cultura de embriões
	Drummond	1-000-1000	Para manuseio de zigotos de camundongo
Vidro de borosilicato	Prime tech	B100-75-10-PT	Para microinjeção de mRNA
Extrator de micropipett	Instrumento Sutter	P-97/IVF	Para a preparação da injeção ou retenção de neadle (diâmetro externo: 80 µ m, diâmetro interno: 10 µ m)
Microforja	Narishige	MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Kit de transcrição	Thermo Fisher scientific	AM1340
Poly (A) kit de rejeito	Thermo Fisher scientific	AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF)	IrvineSceientific	99311	HEPES bufferizado HTF contendo 10%
PVP Sodium HEPES	Sigma	H3784
pTOPO eGFP-H2B			para mRNA eGFP-H2B (referência #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye	Thermo Fisher scientific	AM8551	Para eletroforese de mRNA transcrito in vitro
Fenol clorofórmio álcool isamílico	nacalai tesque	25970-14
Clorofórmio	nacalai tesque	08401-65
Não I	TOYOBO	NOT-111X
Ethachinmate	WAKO	318-01793
3664 Medidor de potência ótica	Hioki	3664	Medidor de potência para potência do laser
Microscópio estereomico	Olympus	SZX16