Este método demonstra como visualizar a invasão do patógeno em células de inseto com modelos tridimensionais (3D). Hemócitos de larvas de Drosophila foram infectados com patógenos virais ou bacterianos, ou ex vivo ou no vivo. Hemócitos infectados foram, em seguida, fixa e manchados para a imagem latente com um microscópio confocal e subsequente reconstrução celular 3D.
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Artigo de método
Extração de hemócitos de larvas de Drosophila melanogaster para infecção microbiana e análise
Neste artigo
Resumo
Resumo
Durante a infecção patogênica de Drosophila melanogaster, hemócitos desempenham um papel importante na resposta imune durante a infecção. Assim, o objetivo do presente protocolo é desenvolver um método para visualizar a invasão do patógeno em um compartimento específico imune de moscas, nomeadamente hemócitos. Usando o método apresentado aqui, até de 3 × 106 hemócitos ao vivo podem ser obtidos 200 drosófila 3rd ínstar larvas em 30 min para infecção ex vivo . Como alternativa, hemócitos podem ser infectado na vivo através da injeção de 3rd ínstar larvas acompanhados por extração hematócito a pós-infecção 24 h. Estas células primárias infectadas foram fixadas, manchado e fotografada usando microscopia confocal. Em seguida, representações 3D foram geradas a partir das imagens para mostrar definitivamente a invasão do patógeno. Além disso, o RNA de alta qualidade para qRT-PCR pode ser obtido para a deteção do seguinte de mRNA do patógeno infecção e proteína suficiente podem ser extraídas destas células para análise ocidental do borrão. Tomados em conjunto, apresentamos um método para a reconciliação definitiva de invasão do patógeno e confirmação de infecção usando tipos de patógenos bacterianos e virais e um método eficiente para extração hematócito para obter suficiente ao vivo hemócitos de Drosophila larvas para experimentos de infecção ex vivo e na vivo .
Introdução
Drosophila melanogaster é um organismo modelo bem estabelecida para o estudo da imunidade inata1. Durante a resposta imune inata, hemócitos desempenham um papel importante na resposta ao desafio do patógeno. Hemócitos são críticos para encapsular parasitas, bem como tendo uma função importante na luta contra o patógeno através de ação fagocitária durante infecção fúngica, bacteriana e viral,2,3.
A fim de melhor compreender a resposta imune inata do hospedeiro à infecção microbiana patogénica, é importante Visualizar como o patógeno invade células hos....
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Protocolo
1. infecção ex vivo
- Médio e equipamentos
- Sob condições estéreis, preparar fresco Drosophila hematócito isolando médio (DHIM) contendo 75% Schneider Drosophila médio com 25% de soro Fetal bovino (FBS) e filtro sterilize.
- Camada 2-3 pedaços de película de parafina de 10 x 10 cm sob um estereomicroscópio.
- Prepare o capilar de vidro. Defina o aquecedor extrator capilar a 55% do máximo. Puxe o tubo capilar para um ponto afiado de aproximadamente 10 µm.
- Aterramento do capilar com óleo mineral.
- Montar o tubo capilar cheio para o nanoinjector (Figura 1
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Resultados
Para recolher jus hemócitos para infecção ex vivo , a 3 × 106 hemócitos foram extraídos de 200 drosófila 3rd ínstar larvas. Para desenvolver o nosso método, um número de diferentes técnicas foram tentado. Dissecação de larva individual levaria até 1,5 h, e uma média de ~ 8000 células foram obtidos usando este método18, a maioria dos quais não estava viva até o final da coleção. Em seguida, nós tentamos extrair a hemolinfa, qu.......
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Discussão
Para entender melhor como células hospedeiras tornar-se infectado, é importante esclarecer a localização do patógeno nas células, especialmente quando a fazer experiências com o patógeno previamente testado e de combinações de tipo de célula4. Enquanto estuda a cascata de resposta celular após infecção pode indicar invasão do patógeno produtiva, a combinação dos dados de resposta celular e imagem é essencial para demonstrar a infecção e invasão do patógeno. Enquanto relatórios mostrando imagens 2D.......
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Nós estamos gratos ao Dr. Robert Heinzen para fornecimento de estoques de mCherry-expressando Coxiella burnetii. Agradecemos o Dr. Luis Teixeira para fornecer invertebrados iridescente vírus 6 e o centro de estoque de Bloomington para fornecer estoques voar. Este projeto foi financiado em parte pelo NIH grant R00 AI106963 (para A.G.G.) e Universidade de estado de Washington.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Drosophila Medium da Schneider | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Soro Fetal Bovino | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filtro (0.22 µ L) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Filtro (100 µ m) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Microscópio estéreo | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Capilar de vidro | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Extrator capilar | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Óleo mineral | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjetor | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Fórceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery aparelho | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocitômetro | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| Placa de 24 poços | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii - mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila< / em> placas de suco de frutas | Cold Spring Harbor | 2.1) | |
| Biorreagentes | Agar | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Metil parabeno | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Etanol absoluto | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Concentrado congelado de suco de uva 100% Welch's, 340 mL | de Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Placas de Petri, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Vidro de cobertura do microscópio | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Fermento, padeiros secos MP Biomedicals ativos | 0210140001 | 2.1) Adicione 2 partes de água a 1 parte de levedura (v/v) | |
| Agulha de tungstênio | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Pinça de retenção | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldeído | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Albumina de soro bovino | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Meio de montagem antidesvanecimento | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Microsope confocal | Leica | TCS SP8-X Microscópio de varredura a laser confocal de luz branca | 3.2) |
| Software de reconstrução de imagens 3D | Leica | LASX com módulo | de visualização 3D3.3) |
| Lâminas de microscópio | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Vírus iridescente de invertebrados 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | cepa: 10403S | 4) Listeria monocytogenes cepa 10403S (Bishop e Hinrichs, 1987) foi cultivada em caldo de infusão cérebro-coração (BHI) Difco (BD Biosciences) contendo 50 µ g/ml de estreptomicina a 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | |
| kit de síntese de cDNA | Bio-Rad | 1708891 | síntese de cDNA |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R | |
| IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd | ||
| SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | ||
| SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | ||
| SYBR Reagente qRT-PCR verde | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Sistema de PCR em tempo real | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anticorpo anti-Listeria monocytogenes | abcam | ab35132 | Anticorpo anti-actina Western blot |
| produzido em coelho | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H + L), HRP Conjugado | Promega | W4011 | Western blot |
Referências
- Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
- Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (....
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Reimpressões e permissões
