Artigo de método

Extração de hemócitos de larvas de Drosophila melanogaster para infecção microbiana e análise

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DOI:

10.3791/57077

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24 de maio de 2018

 ,  , 
1School of Molecular Biosciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Integrative Physiology and Neuroscience, College of Veterinary Medicine, Washington State University

Neste artigo

Resumo

Este método demonstra como visualizar a invasão do patógeno em células de inseto com modelos tridimensionais (3D). Hemócitos de larvas de Drosophila foram infectados com patógenos virais ou bacterianos, ou ex vivo ou no vivo. Hemócitos infectados foram, em seguida, fixa e manchados para a imagem latente com um microscópio confocal e subsequente reconstrução celular 3D.

Resumo

Durante a infecção patogênica de Drosophila melanogaster, hemócitos desempenham um papel importante na resposta imune durante a infecção. Assim, o objetivo do presente protocolo é desenvolver um método para visualizar a invasão do patógeno em um compartimento específico imune de moscas, nomeadamente hemócitos. Usando o método apresentado aqui, até de 3 × 106 hemócitos ao vivo podem ser obtidos 200 drosófila 3rd ínstar larvas em 30 min para infecção ex vivo . Como alternativa, hemócitos podem ser infectado na vivo através da injeção de 3rd ínstar larvas acompanhados por extração hematócito a pós-infecção 24 h. Estas células primárias infectadas foram fixadas, manchado e fotografada usando microscopia confocal. Em seguida, representações 3D foram geradas a partir das imagens para mostrar definitivamente a invasão do patógeno. Além disso, o RNA de alta qualidade para qRT-PCR pode ser obtido para a deteção do seguinte de mRNA do patógeno infecção e proteína suficiente podem ser extraídas destas células para análise ocidental do borrão. Tomados em conjunto, apresentamos um método para a reconciliação definitiva de invasão do patógeno e confirmação de infecção usando tipos de patógenos bacterianos e virais e um método eficiente para extração hematócito para obter suficiente ao vivo hemócitos de Drosophila larvas para experimentos de infecção ex vivo e na vivo .

Introdução

Drosophila melanogaster é um organismo modelo bem estabelecida para o estudo da imunidade inata1. Durante a resposta imune inata, hemócitos desempenham um papel importante na resposta ao desafio do patógeno. Hemócitos são críticos para encapsular parasitas, bem como tendo uma função importante na luta contra o patógeno através de ação fagocitária durante infecção fúngica, bacteriana e viral,2,3.

A fim de melhor compreender a resposta imune inata do hospedeiro à infecção microbiana patogénica, é importante Visualizar como o patógeno invade células hospedeiras durante a infecção. Esta visualização contribui para uma compreensão do mecanismo de invasão. Juntamente com detalhes de localização intracelular de patógeno e a resposta celular, esses dados podem fornecer pistas sobre a resposta do hospedeiro à infecção e as organelas celulares com os quais interage o micróbio. Assim, a reconstrução 3D modelo após a geração de imagens por microscopia pode ser útil para determinar a localização precisa de patógenos em células hospedeiras. Neste estudo, nós visualizado a invasão da Coxiella burnetii (c. burnetii), o agente causador da febre Q, uma zoonose que representa uma séria ameaça à saúde humana e animal, em primários hemócitos de Drosophila . Recentemente, foi demonstrado que a drosófila são suscetíveis ao nível de biossegurança 2 fase de nove milhas II (NMII) clone 4 tensão de c. burnetii e que esta cepa é capaz de replicar em Drosophila4, indicando que Drosófila pode ser usado como um organismo modelo para estudar a patogênese de c. burnetii .

Estudos anteriores usaram hemócitos para examinar a resposta imune inata do host. Hemócitos têm sido utilizados para observações morfológicas5,6,7, de2,de Análise morfométrica8, fagocitose análise2,3, qRT-PCR2 , 9, imunoprecipitação10,11, imunofluorescência análise10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 e imuno-histoquímica de9,14. Embora a drosófila S2 células também estão disponíveis para várias em vitro experiências, immortalization e potencial de infecção viral pré-existente alterar seu comportamento15,16. O uso de células primárias em oposição a uma linhagem de células imortalizado, tais como células de S2, permite o estudo da função imune inata em um sistema mais representativo de todo o organismo. Além disso, a infecção de hemócitos na vivo, antes da extracção, permite que as células interagir com outras proteínas do hospedeiro e o tecido, uma vantagem sobre extração de hemócitos antes da infecção ex vivo . Um número de diferentes métodos têm sido utilizado para obter um número suficiente de hemócitos em um curto período de tempo para manter os hemócitos vivo8,17,18,19.

Neste estudo, apresentamos um método para extrair hemócitos de Drosophila 3rd ínstar larvas para infecção microbiana patogénica com c. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) ou invertebrado iridescente vírus 6 (IIV6). Descrevemos os métodos para infecções de hematócito in vivo e ex vivo . In vivo- e ex vivo-hemócitos infectados foram visualizadas com microscopia confocal e usados para construir modelos 3D de invasão de c. burnetii . Além disso, usando o protocolo de extração, ex vivo-hemócitos infectados foram usados para a expressão de gene e proteína ensaios. Especificamente, para examinar a extensão da infecção com IIV6 e Listeria, total RNA ou proteína foi isolada das células por qRT-PCR ou análise ocidental do borrão. Tomados em conjunto, o protocolo fornece métodos para coletar rapidamente números elevados de hemócitos de 3rd ínstar larvas e provas que primário hemócitos, infectados in vivo ou ex vivo, são uma plataforma adequada para microbiana estudos de infecção do patógeno e aplicável a jusante análises como microscopia, transcriptomics e proteômica.

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Protocolo

1. infecção ex vivo

  1. Médio e equipamentos
    1. Sob condições estéreis, preparar fresco Drosophila hematócito isolando médio (DHIM) contendo 75% Schneider Drosophila médio com 25% de soro Fetal bovino (FBS) e filtro sterilize.
    2. Camada 2-3 pedaços de película de parafina de 10 x 10 cm sob um estereomicroscópio.
    3. Prepare o capilar de vidro. Defina o aquecedor extrator capilar a 55% do máximo. Puxe o tubo capilar para um ponto afiado de aproximadamente 10 µm.
    4. Aterramento do capilar com óleo mineral.
    5. Montar o tubo capilar cheio para o nanoinjector (Figura 1A) e abrir a ponta do tubo capilar fundido quebrando a ponta com pinça (Figura 1B). O diâmetro externo da ponta deve ser de 100 µm para fácil absorção dos hemócitos.
    6. Ejetar tanto petróleo quanto possível da ponta do tubo capilar e, em seguida, preencher com DHIM. Para fácil visualização da borda de hemolinfa tomadas de cima e o óleo, incluem uma bolha de ar entre o DHIM e o óleo (Figura 1B').
  2. Extração de hemolinfa
    1. Escolha 3rd ínstar larvas de Drosophila por dentro a parede da comida frascos suavemente usando fórceps e colocá-los em um coador de 100 µm (Figura 1C). 3rd ínstar larvas encontram-se 3 a 6 dias após a postura de uma fêmea adulta de ovos férteis.
      Nota: Estas experiências usado o genótipo, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ}, 2P {w+ mC= UAS-2xEGFP} AH2, desde hemócitos desses animais expressam a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) para auxiliar na identificação das células por microscopia.
    2. Despeje a 5 mL de água esterilizada sobre larvas e sacudir o filtro para 5 s. lugar o filtro para limpeza de tarefa remover o excesso de água (Figura 1C').
    3. Transferi as larvas em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Anestesia com gás de CO2 por 5 s (Figura 1D).
    4. Coloque as larvas em filme de parafina sob o microscópio estereoscópico, com dorsal-virados para cima(Figura 2).
    5. O vidro capilar levemente para a posterior do corpo larval para segurá-la no lugar e perturbar a cutícula posterior estão abertos usando bem aguçado fórceps (Figura 2B).
    6. Permita a hemolinfa a fluir para o filme de parafina (Figura 2C).
    7. Fazer uma piscina de hemolinfa incluindo hemócitos de 20-50 larvas em um momento no filme de parafina.
    8. Ocupam em pool hemolinfa usando o vidro capilar sobre o nanoinjector (Figura 2D).
      Nota: Deve haver aproximadamente 10-20 µ l de hemolinfa.
    9. Ejete a hemolinfa em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo 500 µ l de DHIM(Figura 2).
    10. Repita as etapas 1.2.4) - 1.2.9) para cada lote de larvas.
  3. Conte o número de hemócitos.
    1. Pipete 5 µ l de solução de azul de Tripan 0,4% em um tubo de microcentrifuga 0,6 mL para manchar as células mortas. Delicadamente misture o DHIM e hemócitos no tubo de 1,5 mL com uma pipeta e transferir 5 µ l de DHIM incluindo hemócitos ao tubo microcentrifuga 0,6 mL e misture delicadamente.
    2. Pipete 10 µ l de células da mistura 1:1 Trypan azul: hematócito para o hemocytometer.
    3. Conte o número de hemócitos ao vivo que não estão manchadas com Trypan azul em cada um dos campos de 4 canto a hemocytomter e calcular a concentração dos hemócitos por mililitro, usando a fórmula:
      figure-protocol-1
      onde X é a concentração de hemócitos ao vivo por mililitro; a, b, c e d são o número de células vivas (conforme determinado pela exclusão Trypan azul) em cada 4 dos campos contado na hemocytometer. Divisão por 2 do número total de células contadas é devido a diluição de 1:1 das células com Trypan azul. Células coradas com Trypan azuis são consideradas mortas.
  4. Ex vivo Infecções
    1. Determine o número de poços para ser semeado com células com base em momentos e biológicas Replica necessários para cada experimento. 5,0 × 104 hemócitos são desejáveis para a purificação de RNA e proteína após a infecção.
    2. Calcule o volume de estoque de patógeno para ser diluído com DHIM para infecção usando a seguinte fórmula:
      figure-protocol-2
      onde a multiplicidade de infecção (MOI) é o número de vírus ou bactérias desejado por célula.
      Nota: MOI utilizado depende da experiência individual e ensaios realizados. Aqui, 10 equivalentes de genoma (GE) / célula de c. burnetii, 10 CFU/célula de Listeriaou 1 TCID50/cell de IIV6 foi usada.
    3. Prepare 500 µ l de meio do patógeno para cada poço de uma placa de 24, acrescentando o volume adequado de DHIM para o volume, viral ou bacteriano em um tubo.
    4. Lugar de 12mm redondo tampa de vidro (espessura do n º 1) em um poço de uma placa de 24.
    5. Dividi o DHIM incluindo os hemócitos nos poços de uma placa de 24.
    6. Adicione 500 µ l de meio de patógeno de hemócitos em um poço.
    7. Centrifugue a placa a 1.000 x g por 5 min.
    8. Incubar a placa por 1h a 28 ° C. Cada 15 min, inclinar suavemente a placa de trás para frente, depois à esquerda para a direita para 5 s pela mão.
    9. Após a 1h de passo invasão/acessório 1.4.8), delicadamente Pipetar fora do meio do patógeno lavar os hemócitos com fresco DHIM e enchê-lo com 500 µ l de DHIM fresco.
    10. Incube os hemócitos infectados durante o tempo desejado. Nesses experimentos, a c. burnetii- ou hemócitos IIV6 infectados são incubados durante 24 h e Listeria-hemócitos infectados são incubadas durante 1, 2 ou 4 h.

2. infecção in vivo

  1. Infecção
    1. Aquecer a placa de ágar de suco de fruta drosófila em temperatura ambiente por 15 min. placas são feitas como anteriormente descrito20.
      1. Adicionar 30 g de ágar-ágar para 700 mL de água e autoclave para 40 min.
      2. Dissolva 0,5 g de paraben metílico em 10 mL de etanol absoluto.
      3. Adicione a solução de paraben metílico para 300 mL de suco de fruta concentrado.
      4. Rapidamente, misture o suco concentrado para a solução de ágar autoclavados e dispense 5 mL em 10 × 35 mm placas de Petri.
      5. Depois que as chapas tenham esfriado por 15 min, armazená-los em 4 ° C.
    2. Preparar 3rd ínstar larvas seguindo passos 1.2.1) - 1.2.3).
    3. Coloque a massa de levedura sobre uma placa de ágar. Fazer um corte bem na placa de ágar, onde as larvas podem migrar para evitar a secagem(Figura 3). Monte uma agulha de tungstênio pontiagudo 0.001 mm com segurando fórceps usando a película de parafina (Figura 3B, C).
    4. Pipete 50 µ l de alta-título mCherry expressando -c. burnetii (5,95 × 109 GE/mL) para a parafina filme sob o microscópio estéreo e colocar as larvas para o pool de bactérias.
    5. Coloque as larvas para o pool de bactérias. Pique as larvas com uma agulha de tungstênio (Figura 3-D). Transferi as larvas em uma placa de ágar-ágar (Figura 3E).
    6. Transfira o restante meio de patógeno na placa de ágar e selar a placa com a película de parafina.
    7. Manter as larvas no prato no ar húmido até a pós-infecção tempo desejado (Figura 3-F). Neste experimento, a c. burnetii-são larvas infectadas na placa por 24 h.
  2. Extração de hemolinfa e chapeamento de hemócitos
    1. Prepare a médio e equipamentos seguindo passo 1.1).
    2. Lugar de 12mm redondo tampa de vidro (espessura do n º 1) em um poço de uma placa de 24. Pipete 500 µ l de DHIM dentro do poço.
    3. Extrair a hemolinfa de larvas infectadas seguindo passos 1.2.4) - 1.2.8).
    4. Ejete a hemolinfa para o bem seguindo passo 2.2.2).
    5. Repita 2.2.3) e 2.2.4) para vários lotes de larvas.
    6. Centrifugue a placa a 1.000 x g por 5 min.

3. visualização

  1. Fixação e coloração
    1. Após permitir os hemócitos resolver sobre o vidro de tampa redondo no poço, remova cuidadosamente o meio de cada poço.
    2. Delicadamente adicione 200 µ l de paraformaldeído 4% (PFA) a cada poço de hemócitos liquidados. Incube os hemócitos por 20 min em temperatura ambiente.
    3. Remova os 4% PFA e suavemente adicionar 200 µ l de PBS contendo 0,1% Triton X-100 e 1% albumina de soro bovino (BSA) em cada poço. Incube os hemócitos durante 10 minutos à temperatura ambiente.
    4. Remover a PBS e suavemente adicionar 200 µ l de 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a cada poço. Incube os hemócitos durante 10 minutos no escuro à temperatura ambiente.
    5. Remover a solução DAPI e adicione delicadamente PBS a cada poço. Incube os hemócitos durante 5 min à temperatura ambiente.
    6. 10 µ l do meio de montagem antidesgaste uma gota em uma lâmina de vidro de microscópio.
    7. Depois de retirar a PBS de cada poço, remova o tampa de vidro da placa de 24-bem usando pinça fina-apontou. Coloque suavemente o vidro de cobertura para o meio de montagem antidesgaste sobre a lâmina de vidro, com os hemócitos virado para baixo.
    8. Permitir que o slide secar, colocando-o na noite escura.
  2. Imagem latente confocal
    1. Configure o microscópio confocal para três imagens de cor de DAPI, EGFP e mCherry. Usar a seguinte configuração: excitação de DAPI (ex) 405 nm, emissão (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
    2. Coloque a amostra no microscópio e foco na amostra usando um 63 X / 1.4 objetivo abertura numérica (NA). Localize hemócitos desejados no campo de visão para a imagem latente.
    3. Ajuste os ganhos de potência e detector laser para obter a exposição adequada da amostra. Verifique múltiplas z-aviões para garantir que o nível de exposição é apropriado para a espessura de toda a amostra.
    4. Encontre a posição superior e inferior do eixo z de um hematócito toda. Defina essas posições como as posições inicial e final para z-seccionamento.
    5. Somente utilize o zoom de varredura a imagem, a área que contém o hematócito. Fatores de zoom de 3x são usados frequentemente.
    6. Recolha a série de imagem em resolução apropriada como 1024 x 1024 pixels no plano x-y e espaçamento de 0,3 µm na dimensão z.
  3. Reconstrução do modelo 3D
    Nota: O software de fonte aberta existe que executa muitas das funções descritas para a reconstrução do modelo 3D.
    1. Importe o arquivo de série z-seccionado imagem para o software associado com o microscópio confocal para reconstrução do modelo 3D.
    2. Selecione uma célula mostrando co localização dos núcleos corados com DAPI e mCherry expressando a c. burnetii em um EGFP expressando hematócito. A série de imagem para conter apenas a única célula de colheita.
    3. Selecione a opção de visualizador 3D, que reconstrói o modelo 3D usando algoritmo pré-embalados do software. Escolha o tipo desejado de representação 3D entre mistura, superfície e opções de mistura. Neste método, hemócitos, núcleos e c. burnetii são mostrados usando modelos de superfície.
    4. Observe a célula reconstruída 3D de várias posições de visualização segurando o botão do mouse e arrastando o cursor ao redor da tela. Ajuste a célula orientação e posição da fonte de luz modelada para otimizar a imagem. Existem outras opções para opacidade, mínimo e limite máximo, especulares, Ambient, Shineness e gama para otimizar a imagem.
    5. Secções transversais através do modelo usando os comandos Recortar e corte para visualizar o conteúdo interior do hematócito de leve.

4. aplicação de análise genética e/ou proteína

  1. Após a infecção com IIV6 e Listeria, lyse pilhas para posterior qRT-PCR ou análise ocidental do borrão como descrito anteriormente21 e seguir indicações do fabricante.
    Nota: Consulte a Tabela de materiais para as primeiras demão para qRT-PCR e os anticorpos para o borrão ocidental.
  2. Analise os produtos de PCR por electroforese do gel do agarose, como descrito anteriormente,22, para garantir o comprimento correto do produto amplificado.

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Resultados

Para recolher jus hemócitos para infecção ex vivo , a 3 × 106 hemócitos foram extraídos de 200 drosófila 3rd ínstar larvas. Para desenvolver o nosso método, um número de diferentes técnicas foram tentado. Dissecação de larva individual levaria até 1,5 h, e uma média de ~ 8000 células foram obtidos usando este método18, a maioria dos quais não estava viva até o final da coleção. Em seguida, nós tentamos extrair a hemolinfa, qu...

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Discussão

Para entender melhor como células hospedeiras tornar-se infectado, é importante esclarecer a localização do patógeno nas células, especialmente quando a fazer experiências com o patógeno previamente testado e de combinações de tipo de célula4. Enquanto estuda a cascata de resposta celular após infecção pode indicar invasão do patógeno produtiva, a combinação dos dados de resposta celular e imagem é essencial para demonstrar a infecção e invasão do patógeno. Enquanto relatórios mostrando imagens 2D...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Nós estamos gratos ao Dr. Robert Heinzen para fornecimento de estoques de mCherry-expressando Coxiella burnetii. Agradecemos o Dr. Luis Teixeira para fornecer invertebrados iridescente vírus 6 e o centro de estoque de Bloomington para fornecer estoques voar. Este projeto foi financiado em parte pelo NIH grant R00 AI106963 (para A.G.G.) e Universidade de estado de Washington.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Drosophila Medium da Schneider Thermo Fisher Scientific (Gibco)217200241.1.1), 2.1.2)
Soro Fetal BovinoGE Healthcare Life Sciences  (HyClone)SH30070.03HI1.1.1), 2.1.2)
Filtro (0.22 µ L)RESTEK261581.1.1)
Filtro (100 µ m)Greiner bio-one5420001.2.1), 2)
Microscópio estéreoAmscopeSM-1BSZ-L6W1.2), 2)
Capilar de vidroFisher Scientific21-171-41.1), 1.2), 2)
Extrator capilarNarishige International USA, Inc.PC-101.1.3)
Óleo mineralSnow River Products1.1.4)
NanoinjetorDrummond Scientific Company3-000-2041.1), 1.2), 2.2)
FórcepsVWR82027-4021.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery aparelhoGenesee Scientific59-122BC1.2), 2)
Trypan BlueThermo Fisher Scientific (Gibco)152500611.3)
HemocitômetroHausser Scientific31001.3)
Placa de 24 poçosGreiner bio-one6621601.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherryDr. Heinzen, R.1.4), 2.2)
Drosophila< / em> placas de suco de frutasCold Spring Harbor2.1)
BiorreagentesAgarBP1423-5002.1.1.1)
Metil parabenoAmresco0572-500G2.1.1.2)
Etanol absolutoFisher BioreagentsBP2818-5002.1.1.2)
Concentrado congelado de suco de uva 100% Welch's, 340 mLde AmazonB0025UJVGM2.1.1.3)
Placas de Petri, 10 x 35 mmFisher Scientific08-757-100A2.1.1.4)
Vidro de cobertura do microscópioFisher Scientific12-545-801.4.4), 2.2.2)
Fermento, padeiros secos MP Biomedicals ativos02101400012.1) Adicione 2 partes de água a 1 parte de levedura (v/v)
Agulha de tungstênioFine Science Tools10130-202.1)
Pinça de retençãoVWRHS83132.1)
ParaformaldeídoFisher ScientificFLO4042-5003.1.3)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-5003.1.3)
Albumina de soro bovinoFisher ScientificBP9706-1003.1.3)
4',6-diamidino-2-fenilindolThermo Fisher Scientific622473.1.4)
Meio de montagem antidesvanecimentoThermo Fisher ScientificP369303.1.6)
Microsope confocalLeicaTCS SP8-X Microscópio de varredura a laser confocal de luz branca3.2)
Software de reconstrução de imagens 3DLeicaLASX com módulode visualização 3D3.3)
Lâminas de microscópioFisher Scientific12-552-33.1.6)
Vírus iridescente de invertebrados 6 (IIV6)Dr. Teixeria, L.4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenesATCCcepa: 10403S4) Listeria monocytogenes cepa 10403S (Bishop e Hinrichs, 1987) foi cultivada em caldo de infusão cérebro-coração (BHI) Difco (BD Biosciences) contendo 50 µ g/ml de estreptomicina a 30 °C.
DNase IThermo Fisher Scientific(Invitrogen)18068015
kit de síntese de cDNABio-Rad1708891síntese de cDNA
IIV6_193R_FIDTqRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R
IDTqRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd
SIGMA-ALDRICHqRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
SIGMA-ALDRICHqRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Reagente qRT-PCR verdeThermo Fisher ScientificK0251, K0252, K0253qRT-PCR
Sistema de PCR em tempo realThermo Fisher Scientific4351107, 7500 Software v2.0qRT-PCR
Anticorpo anti-Listeria monocytogenesabcamab35132Anticorpo anti-actina Western blot
produzido em coelhoSIGMA-ALDRICHA2066Western blot
Anti-Rabbit IgG (H + L), HRP ConjugadoPromegaW4011Western blot
Protocolos de http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full Fisher de degradação de gDNA RpII_qRTPCR_rev

Referências

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