Artigo de método

Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) de Modificações de Histonas de Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/57080

⸱

29 de dezembro de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Maryland

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação da cromatina de histonas modificadas de brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA é usado posteriormente para PCR quantitativo para interrogar a abundância e a localização de modificações borne-translational do histone durante todo o genoma.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modificações do histone pós-traducional (PTMs), tais como a acetilação, metilação e fosforilação, dinamicamente são reguladas por uma série de enzimas que adicionar ou remover estas marcas em resposta a sinais recebidos pela célula. Estes PTMS são principais contribuintes para a regulamentação dos processos, tais como controle de expressão de gene e reparo do DNA. Imunoprecipitação da cromatina (chIP) tem sido uma abordagem instrumental para dissecar a abundância e a localização de muitos PTMs de histona por todo o genoma em resposta a diversas perturbações para a célula. Aqui, um método versátil para a realização de microplaqueta das histonas post-translationally modificadas de brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) é descrito. Este método baseia-se na reticulação de proteínas e DNA usando formol tratamento de culturas de leveduras, geração de levedura lisados por grânulo batendo, solubilização de fragmentos de cromatina por nuclease micrococcal e imunoprecipitação de histona-DNA complexos. DNA associado com a marca do histone de interesse é purificado e submetido a análise PCR quantitativo para avaliar seu enriquecimento em múltiplos loci durante todo o genoma. Experiências representativas sondando a localização das marcas de histona H3K4me2 e H4K16ac em sua e levedura mutante são discutidas para demonstrar a interpretação e análise de dados. Este método é adequado para uma variedade de histona PTMs e pode ser realizado com diferentes cepas mutantes ou na presença de diversos estresses ambientais, tornando-se uma excelente ferramenta para investigar as alterações na dinâmica da cromatina em condições diferentes.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A modificação pós-traducional dinâmica (PTM) de histonas é um mecanismo regulatório essencial para muitos processos de DNA-modelo, incluindo a transcrição, replicação e reparo de DNA1,2. A capacidade de determinar a abundância e a localização exacta das histonas modificadas concomitantes com esses processos, portanto, é fundamental para compreender seu regulamento sob condições diferentes na célula. O desenvolvimento da imunoprecipitação da cromatina (chIP) como um método largamente resultado de estudos bioquímicos das interações de proteínas com DNA, particularmente em vitro métodos usando química crosslinkers, juntamente com a necessidade de avaliar o natureza dinâmica do proteína-ADN interações em vivo e em regiões específicas do genoma,4,3,5. O avanço das tecnologias de sequenciamento e PCR quantitativo (qPCR) também ampliou a capacidade de realizar experimentos de microplaqueta com comparações quantitativas e através de genomas toda, tornando-se uma poderosa ferramenta para dissecar interações DNA-proteína no vários níveis.

Atualmente, o chIP é um método necessário para qualquer grupo de pesquisa interessado em regulamento mediada por cromatina do genoma como existem sem métodos comparáveis para interrogar diretamente a ligação física entre uma histona modificada e um locus específico de genômico em vivo. Apesar de variações deste método usando a próxima geração de sequenciamento para mapear modificações do histone em todo o genoma de6,7 estão disponíveis, essas abordagens podem abordar diferentes questões científicas e sua escala, o custo e recursos técnicos podem ser um fator limitante para alguns grupos de pesquisa. Além disso, a microplaqueta-qPCR alvo é necessário complementar estas abordagens, fornecendo métodos para ambos otimizar o protocolo chIP antes de sequenciamento e validar resultados de conjuntos de dados epigenomic. Espectrometria de massa com base em abordagens para identificar o conjunto completo de histona marcas associadas com regiões genômicas tem também emergiu8,9,10,11, no entanto, estas abordagens têm algumas limitações sobre quais regiões do genoma podem ser sondadas e exigem perícia técnica e instrumentação que não estará disponível para todos os grupos de pesquisa. Portanto, o chIP permanece um método fundamental para analisar a abundância e distribuição de modificações do histone sob diversas condições para todos os grupos de pesquisa interessados em epigenética, da cromatina e a regulação de funções genômicas.

Aqui, descrevemos um método para o modelo de chIP usando o fermento budding Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) para investigar a distribuição de PTMs de histonas na cromatina. Esta abordagem se baseia em um número de componentes principais da microplaqueta protocolos desenvolvidos no fermento e também aplicado ao modelo diversos sistemas12,13. Interações entre modificados histonas e DNA na célula são preservadas por reticulação com formaldeído. Após preparação lisada, fragmentos de cromatina são solubilizados em fragmentos de tamanho uniformemente por digestão com nuclease micrococcal. Imunoprecipitação das histonas modificadas é realizada com anticorpos comerciais ou gerados pelo laboratório e qualquer associado DNA é isolado e analisado para enriquecimento em determinadas regiões genômicas usando qPCR (Figura 1). Para muitas modificações do histone, a quantidade de DNA obtido a partir deste protocolo é suficiente para o ensaio de mais de 25 diferentes loci genômicos por qPCR.

Este método de microplaqueta é altamente versátil para monitorar a distribuição de uma modificação do histone único em vários cepas mutantes ou condições ambientais, ou para testar várias modificações do histone em sua células em um número de loci genômicos. Além disso, vários componentes do protocolo são facilmente ajustáveis para otimizar a deteção de qualquer marcas altamente ou humilde-abundante de histona. Finalmente, realizando a microplaqueta das histonas modificadas em leveduras brotamento fornece a oportunidade de usar controles chaves para a especificidade do anticorpo que não estão amplamente disponíveis em outros sistemas. Ou seja, cepas de leveduras podem ser geradas que carregam mutações pontuais em resíduos de histona que são direcionados para a modificação, e, em alguns casos, há apenas uma única enzima que cataliza modificação em um resíduo de histona particular (ex. lisina de histona metiltransferases). Portanto, microplaqueta pode ser executada em qualquer as histona mutante ou enzima exclusão cepas a ensaiar a medida em que a ligação não-específica do anticorpo pode ser ocorrendo e gerando resultados falso-positivos. Este controle é particularmente valioso para anticorpos recém-desenvolvidos e pode mesmo ser usado para validar a especificidade do anticorpo para modificações do histone conservado antes da sua utilização em outros sistemas. Essa abordagem complementa outros métodos para testar a especificidade do anticorpo que distinguem entre Estados-Membros diferentes de modificação (tais como mono-, di - e tri-metilação), incluindo matrizes de peptídeos modificados de sondagem e realizando borrões ocidentais das histonas ou nucleossomas com modificações definidas. Globalmente, o chIP em leveduras brotamento é um poderoso método para avaliar a dinâmica da histona PTMs durante todo o genoma e dissecando os mecanismos que regem a sua regulação.

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Protocolo

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1. pré-vincular o anticorpo para grânulos magnéticos

  1. Misture os grânulos magnético A/G de proteína bem e transfira a 20 µ l de grânulos magnéticos por uma imunoprecipitação (IP) de amostra para um tubo de 1,5 mL.
    Nota: Quando pipetagem grânulos, use todo o furo, baixa retenção de dicas.
  2. Coloque o tubo com grânulos em um carrinho magnético e permitir grânulos recolher no lado do tubo. Remova o sobrenadante.
  3. Lave os grânulos 3 vezes com 1 mL de frio salino Tris (TBS) (pH 7,5, 150 mM NaCl de 50 mM Tris-HCl).
  4. Adicione 200 µ l de TBS de grânulos e a quantidade adequada de anticorpos. Girar a 8 rpm durante a noite a 4 ° C.
    Nota: Para muitos anticorpos anti histona PTM, 1-3 µ g de anticorpo por IP é suficiente. No entanto, experimentos de titulação são recomendados para determinar concentrações adequadas. Concentrações recomendadas para anticorpos de histona bem caracterizadas, comercial PTM frequentemente são precisas e podem ser encontradas em relatórios publicados ou literatura do produto.
  5. Coloque as contas em um carrinho magnético e remover o sobrenadante. Lave-os com 1 mL de TBS.
  6. Resuspenda as contas em 20 µ l de TBS por exemplo IP mais um adicional 5 µ l (em caso de erro de pipetagem) de TBS.
    Nota: Os grânulos podem ser armazenados a curto prazo a 4 ° C até o uso.

2. crescer células de levedura

  1. Inocular 10 mL de YPD (extrato de levedura de 10%, 20% de peptona e 20% dextrose) com uma única colônia da estirpe apropriada e cultivá-lo a 30 ° C durante a noite em uma incubadora agitando a 220 rpm.
  2. Medir a densidade óptica em 600 nm (OD600) de cultura de levedura, utilizando um espectrofotômetro. Diluir a cultura para uma OD600 = 0,2 em 100 mL YPD num balão de novo.
  3. Crescem as células a 30 ° C, uma incubadora de agitação a 220 rpm até atingirem a fase de log de mid (OD600 = 0,6-0,8).

3. in Vivo de reticulação de proteínas para o DNA

  1. Quando culturas alcançam a fase log de mid, adicione 2,7 mL de formol 37% diretamente para o meio, para uma concentração final de 1% de formaldeído. Transferir o balão para um agitador a 25 ° C (ou temperatura) e sacode a 50 rpm por 15 min.
  2. Adicionar 5 mL de glicina de 2,5 M para o médio e continuar apertando a 50 rpm em temperatura ambiente por 5 min saciar o formaldeído.
  3. Transferir as células para centrifugar garrafas e girar as células a 5800 x g por 5 min a 4 ° C. Decante o sobrenadante.
    1. Lavar as células por resuspending-los em 45 mL de TBS frio e transferir a suspensão em um tubo cónico de 50 mL. Girar o tubo a 2800 x g, durante 3 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante.
    2. Lavagem que das células em 10 mL de frio chIP do lysis (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1% nonidet octil phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), armazenado a 4 ° C).
    3. Girar as células a 2800 x g, durante 3 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante.
      Nota: As células podem ser congeladas com nitrogênio líquido e armazenadas a-80 ° C até o processamento adicional.

4. faça Lysates do fermento

  1. Ressuspender as células em 1 mL de tampão de Lise ChIP frio com fluoreto de phenylmethylsulfonyl de 1 mM (PMSF) e diluição de 1:1,000 do inibidor de protease de levedura cocktail. Transfira a suspensão para um tubo de tampa de rosca de 2,0 mL contendo 200 µ l de esferas de vidro.
  2. Transferir as células para um grânulo batendo o aparelho para a agitação de alta velocidade a 4 ° C e grânulo venceu 6 vezes por 30 s cada. Manter as células no gelo pelo menos 1 min entre cada grânulo batendo.
  3. Transfira o lisado para um tubo de 1,5 mL usando gel dicas de carregamento. Centrifugue o lisado a 15.500 x g por 20 min a 4 ° C.
  4. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 250 µ l de tampão de digestão MNase (pH 10 mM Tris-HCl 7,5, 10 mM de NaCl, 3 mM MgCl2, 21 mM CaCl2, 1% NP-40, armazenadas a 4 ° C) suavemente pipetando acima e para baixo.
  5. Adicione 2,5 µ l de MNase para as reações. Misturá-los gentilmente por inversão 4 - 6 vezes e imediatamente ele incubar em banho-maria 37 ° C por 20 min.
    Nota: Condições de digerir devem ser otimizadas quando um novo estoque de MNase é usado. Consulte a etapa 10 para o protocolo.
  6. Imediatamente, coloque os tubos no gelo para parar a reação e adicionar 5 µ l de EDTA 0,5 M para uma concentração final de 10 mM de EDTA. Misturá-los gentilmente por inversão.
  7. Centrifugue a reação a 15.500 x g, durante 15 min a 4 ° C e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.
    Nota: Solúvel (digerida) cromatina será no sobrenadante. O sedimento contém restos de celular qualquer coisa não digerido e insolúvel.

5. Immunoprecipitate (IP) modificado histonas

  1. Determine a concentração de proteína de cada fração de cromatina MNase-liberado usando um ensaio de Bradford. Adicione 1 mL do reagente de Bradford para cada um dos 8 cubetas descartáveis mais 1 cuvete adicional para cada amostra de proteína a ser testado.
    1. Prepare uma solução stock de 2 mg/mL albumina de soro bovino (BSA).
    2. Adicionar o volume apropriado para atingir as seguintes concentrações de BSA em 1 mL de reagente de Bradford: 0 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL e 10 μg/mL. Adicione 2 μL da fração cromatina MNase-liberado para as cubetas adicionais.
    3. Cubra a parte superior de cada cubeta com um pequeno pedaço de parafilm e inverter as cubetas de 4 - 6 vezes para misturar a solução bem. Incube as cubetas em temperatura ambiente por 15 min.
    4. Usando um Espectrofotômetro de luz visível, medir a absorvância a 595 nm para a curva de calibração e amostras experimentais.
      Nota: Utilize a cubeta sem BSA (0 μg/mL) para em branco o espectrofotômetro antes de tomar a primeira medição.
    5. Traça uma curva padrão usando os valores de absorvância para as diferentes concentrações de BSA na associado com o espectrofotômetro ou software de planilha eletrônica. Com base na curva padrão e o factor de diluição utilizada (1: 500), use os valores de absorvância para calcular a concentração de proteína para cada uma das amostras de fração de cromatina.
  2. Para cada IP, adicione 50 µ g de proteína total da fracção MNase-lançado cromatina de tampão de Lise ChIP para atingir um volume final de 1 mL.
    Nota: Se configurar mais de um IP por lisado, faça uma mistura de mestre do lisado e ChIP do lysis e alíquotas de 1ml para tubos individuais para o IP.
  3. Retire a mistura do IP para processar como o exemplo de entrada 100 µ l. Congele a-20 ° C, o exemplo de entrada até o passo 7.1.
    Nota: Qualquer amostra restante de cromatina também pode ser congelada a-20 ° C e usada para um IP subsequente, se desejado.
  4. Adicione 20 µ l de magnéticos grânulos de A/G de proteína pre-vinculado com anticorpo para cada amostra IP.
Girar a amostra a 8 rpm para 3h (padrão) ou durante a noite (se preferir), a 4 ° C.

6. Lave a IPs e eluir complexos histona-DNA

  1. Coloque os tubos em um carrinho magnético e deixa grânulos recolher na lateral do tubo. Remova o sobrenadante com uma pipeta. Lave os grânulos sucessivamente com 1 mL de cada um dos buffers abaixo.
    1. Realizar cada lavagem girando a 8 rpm por 5 min a 4 ° C, colocando grânulos em um carrinho magnético, remover o sobrenadante e adicionar próximo buffer: 2x - ChIP do lysis, 2x - alta sal tampão de lavagem (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM de NaCl, 1 mM EDTA 1% NP-40, armazenadas a 4 ° C), 1 x - LiCl/detergente de tampão de lavagem (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 250mm LiCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, Deoxycholate do sódio de 1%, armazenada a 4 ° C), 1 x - TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, armazenada a 4 ° C) e 1 x - TE.
    2. Com última lavagem TE, transferi contas para um novo tubo usando 0,5 mL de TE transferir a maioria dos grânulos, depois outro 0,5 mL de TE lavar o tubo e transferir o restante de grânulos.
  2. Adicione 250 µ l de tampão de eluição ChIP feito recentemente (1% SDS, NaHCO3de 1 mM). Vórtice a solução brevemente. Gire as amostras a 8 rpm durante 15 minutos à temperatura ambiente.
  3. Coloque o tubo em um suporte magnético e coletar os grânulos. Cuidadosamente, transferir o sobrenadante para um tubo novo e evitar os grânulos.
    Nota: O eluído contém proteínas de immunoprecipitated e DNA associado.
  4. Adicione outro 250 μL de tampão de eluição de ChIP de grânulos. Gire as amostras a 8 rpm durante 15 minutos à temperatura ambiente.
  5. Transferi com cuidado o sobrenadante no tubo que contém a primeira eluição. Se necessário, remova um volume menor (240 µ l) para todos os IPs evitar perturbar os grânulos.

7. inverta as referências cruzadas proteína-ADN

  1. Descongelar as amostras de entrada e adicionar 400 µ l de tampão de eluição de ChIP a cada entrada.
  2. A entrada e amostras IP, adicione 20 µ l de NaCl 5m, 5 µ l de glicogênio de 20 mg/mL e 12,5 µ l de Proteinase K. Mix de 20 mg/mL bem invertendo ou sacudir os tubos. Incube as amostras em um banho de água de 65 ° C durante a noite.

8. purificar e concentrar-se DNA

  1. Adicione 10 µ l de RNase A 10mg/mL para a entrada e amostras IP. Incube as amostras em banho-maria 37 ° C por 30 min.
  2. Adicione 600 µ l de álcool fenol: chlorofrom:isoamyl (25:24:1 PCI) para a solução aquosa e misturá-los bem. Girá-los a 15.500 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
    1. Retire a camada aquosa para um novo tubo. Adicione 600 µ l de PCI e misturá-los bem. Gire o tubo a 15.500 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Transferi a fase aquosa para um tubo novo.
      Cuidado: Trabalho na coifa e usar equipamento de protecção adequado quando se trabalha com PCI. Descarte de resíduos líquidos e sólidos como instruído pelas diretrizes institucionais.
  3. Adicione 0,1 x volume de acetato de sódio 3M e 1 mL de álcool etílico frio de 100% para precipitar o DNA. Inverter o tubo 4 - 6 vezes para misturar a solução bem. Incube a-20 º C durante a noite.
    1. Girar o tubo a 15.500 x g por 20 min a 4 ° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta.
    2. Lave o pellet em 1 mL de álcool etílico frio de 70%. Gire a 15.500 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta.
    3. Secar ao ar livre as pelotas de capuz por aproximadamente 20 min (até completamente seco). Resuspenda as amostras IP em 50 µ l de água livre de nuclease e Resuspenda entradas amostras em 100 µ l de água livre de nuclease. Armazene as amostras a-20 º C até realizando qPCR.

9. quantitativo PCR (qPCR) para detectar regiões enriquecido Genomic

  1. Faça uma mistura de mestre de qPCR para cada conjunto de primers. Uma reação contém 0,25 µ l de primer reverso de 20 µM, 0,25 µ l de primer para a frente de 20 µM e 5 µ l do mix de x qPCR 2.
    Nota: Projeto apropriado da primeira demão e testes para qPCR experimentos são descrevem em outros lugares14,15,16.
  2. Fazer mixagens mestre de DNA para cada amostra de DNA. Uma reação contém 0,5 µ l de DNA e 4,0 µ l de água livre de nuclease.
  3. Adicione 5,5 µ l do mix mestre primário apropriado e 4,5 µ l do mix mestre DNA apropriado a cada poço em um prato de qPCR 384-bem.
    Nota: Começar com a adição de 5,5 µ l da mistura da primeira demão a cada poço. Gire a placa a 200 x g por 1 min à temperatura ambiente antes de adicionar 4,5 µ l da mistura do DNA.
  4. Aderir o selo para o prato e girar a 200 x g por 1 min à temperatura ambiente.
  5. Executar qPCR utilizando um sistema de qPCR em tempo real com as seguintes condições: 95 ° C por 3 min; 40 ciclos de 95 ° C por 10 s, 55 ° C por 30 s; curva de fusão 65 ° C e 95 ° C, com incrementos de 0,5 ° C, 5 s.
  6. Para cada par de primer, calcule a porcentagem de entrada da amostra em relação a amostra de 5% entrada usada no qPCR IP. Use a técnica do PCR triplica os meios para executar os cálculos.
    Nota: Se uma variação substancial é observada em triplica o PCR, recomenda-se repetir o qPCR com atenção a composição da mistura de mestre, erros de pipetagem e contaminação cruzada entre os poços da placa de 384-bem.
    1. Ajuste os valores de Cq para a entrada de 100% subtraindo-se o número de ciclos que representa o fator de diluição de valores brutos de Cq.
      Nota: A entrada de cinco por cento representa um factor de diluição de 20 vezes, que é igual a 4,32 ciclos (log2 20 = 4,32).
    2. Calcular a porcentagem de entrada como 2 ^ (Cq deentrada - CqIP) multiplicado por 100.

10. determine MNase Digest condições (recomendado antes da microplaqueta completa primeiro experimento)

  1. Siga os passos 2.1 através de 4.4 do protocolo anterior. Aumenta o protocolo para gerar suficiente lisado para amostras múltiplas de digestão MNase da pelota contendo cromatina. No passo 4.4, resuspenda as pelotas em 1,25 mL de tampão de digestão de MNase. Alíquota as amostras para 5 tubos de modo que cada contém 250 µ l da pelota de cromatina resuspended no Buffer de digestão MNase.
  2. Adicionar 0, 1.5, 2.5 ou 5 µ l de MNase para cada tubo. Misturá-los gentilmente por inversão 4 - 6 vezes e imediatamente incubar os tubos num banho de água de 37 ° C por 20 min.
  3. Pare de reações imediatamente, colocação de tubos no gelo e adicionando 5 µ l de EDTA 0,5 M para uma concentração final de 10 mM.
Misture a solução suavemente por inversão.
  • Centrifugar os tubos a 15.500 x g, durante 15 min a 4 ° C e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.
  • Adicione o SDS a concentração final de 1% (25 µ l de solução a 10% das ações) e NaHCO3 a concentração final de 0,1 M (25 µ l de solução 1 M) para as amostras em tubos de 1,5 mL.
  • Adicione 20 µ l de NaCl 5m, 5 µ l de glicogênio e 12,5 µ l de 20mg/mL da protease K para as amostras em tubos de 1,5 mL. Incube-os a 65 ° C durante a noite.
  • Adicione 10 µ l de RNaseA 10 mg/mL. Incube a 37 ° C por 30 min.
  • Adicionar 300 µ l de PCI para a solução aquosa e misturá-los bem. Girar a 15.500 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
    1. Retire a camada aquosa para um novo tubo. Adicione 300 µ l de PCI e misture bem. Girar a 15.500 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Transferi a fase aquosa para um novo tubo.
  • Adicione 0,1 x volume de acetato de sódio 3M (normalmente ~ 30 µ l) e 1 mL de álcool etílico frio de 100% para precipitar o DNA. Inverter o tubo 4 - 6 vezes para misturar bem. Incube o tubo a-80 ° C por 1h ou a-20 ° C durante a noite.
    1. Girar o tubo a 15.500 x g por 20 min a 4° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta.
    2. Lave as bolinhas em 1 mL de álcool etílico frio de 70%. Girar a 15.500 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
    3. Deixe que secar ao ar as pelotas no capô aproximadamente 20 min (ou até completamente seco). Resuspenda as pelotas em 30 µ l de água livre de nuclease.
  • Adicionar o DNA de corante a carregar e executar 20 µ l em um agarose 2% gel para visualizar digerido DNA.

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    Resultados

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Um componente chave do presente protocolo é otimizar a concentração de nuclease micrococcal (MNase), usada para digerir a cromatina em fragmentos solúveis, como descrito no passo 10. Isto é crítico para a obtenção de dados de alta resolução sobre a distribuição das modificações do histone em regiões genômicas de interesse. Um MNase de titulação deve ser executado para determinar a concentração mais apropriada para alcançar principalmente mono-nucleosomes com uma quantidade menor de di-nuc...

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    Discussão

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    O procedimento descrito aqui permite a recuperação eficiente de DNA associado a histonas modificadas em células de levedura por imunoprecipitação. Isto é seguido por qPCR usando as primeiras demão que amplificam regiões de interesse para determinar o local enriquecimento ou esgotamento das modificações do histone específico. Apesar de ser desenvolvido como um método há quase 20 anos, microplaqueta permanece o ensaio decisivo para investigar o estatuto de modificação de histona a diferentes regiões genômicas e em diversas...

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    Divulgações

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Os autores não têm nada para divulgar.

    Agradecimentos

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Os autores gostaria de agradecer aos membros do laboratório verde para debates úteis. Este trabalho foi financiado em parte por subvenções de NIH R03AG052018 e R01GM124342 para E.M.G.

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    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    extrato de leveduraInternational (RPI)Y20025-1000.0
    PeptoneResearch Products International (RPI)P20250-1000.0
    DextroseThermoScientificBP350-1
    FormaldeídoSigma-AldrichF8775
    GlycineFisher ScientificAC12007-0050
    TrisAmresco0497-5KG
    EDTASigma-AldrichE6758-500G
    NaClThermoScientificBP358-10
    4-Nonilfenil-polietilenoglicolSigma-Aldrich74385Equivalente a NP-40
    MgClThermoScientificS25533
    CaCl2Sigma-Aldrich20899-25G-F
    LiClThermoScientificAC413271000
    Dodecil Sulfato de SódioAmrescoM107-1KG
    Desoxicolato de SódioSigma-Aldrich30970-100G
    Acetato de SódioSigma-AldrichS2889
    NaHCO3ThermoScientificS25533
    PMSFSigma-AldrichP7626-5G
    Coquetel inibidor de protease de leveduraVWR10190-076
    25 Fenol: 24 Clorofórmio: 1 Álcool isoamílicoVWR Life Science97064-824
    EtanolSigma-AldrichE7023
    Água sem nucleaseVWR100720-992
    NucleasemicrocócicaWorthington BiochemicalLS004797
    GlycogenThermoScientificR0561
    Proteinase KResearch Products International (RPI)P50220-0.1
    RNase A Sigma-AldrichR6513-50MG
    Reagente de Ensaio BradfordThermoScientific23238
      Padrão BSA 2 mg/mLThermoScientific23210
    α H4EMD Millipore04-858
    &alfa; H4K16acEMD MilliporeABE532
    &alfa; H3Abcamab1791
    &alfa; Motivo Ativo H3K4me239142
      Mix de qPCR de alta RoxAccuris qMax Verde, Mix de qPCR de baixa RoxACC-PR2000-L-1000
    Contas magnéticas de proteína A/GSuporte magnético ThermoScientific88803
    para tubos de 1,5mLFisher ScientificPI-21359
    Contas de Vidro Lavadas com ÁcidoSigma-AldrichG8772
      Homogeneizador de MicrotubosBenchmarkD1030
    Tubos de 2,0 mL com tampa de rosca com anéis de vedaçãoSigma-AldrichZ763837-1000EA
    Pontas de carregamento de gelFisher Scientific07-200-288
    CuvetesFisher Scientific50-476-476
    ParafilmFisher Scientific13-374-10
    Tubos cônicos de 50 mLPoços Fisher Scientific14-432-22
    Fisher ScientificAB-1384W
      Agitador de Piso NewBrunswick ScientificModelo G10
    EspectrofotômetroThermoScientificND-2000c
      Sistema de Detecção de PCR em Tempo RealBio-Rad1855485
    Produtos de pesquisa de Placa PCR de 384

    Referências

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