Fracionamento para resolução das espécies de Huntingtin solúvel e insolúvel

Resumo

Um método é descrito por fracionamento de espécie mutante solúvel e insolúvel da cultura de cérebro e cela de rato. O método descrito é útil para a caracterização e quantificação de fluxo de proteína huntingtina e auxilia na análise de homeostase de proteína na patogênese da doença e na presença de perturbações

Resumo

O acúmulo de misfolded proteínas é central para a patologia na doença de Huntington (HD) e muitas outras doenças neurodegenerativas. Especificamente, uma chave característica patológica de HD é o acúmulo aberrante de proteína mutante HTT (mHTT) em complexos de alto peso molecular e corpos de inclusão intracelulares é composto por fragmentos e outras proteínas. Métodos convencionais para mensurar e compreender que as contribuições de várias formas de agregados contendo mHTT incluem microscopia de fluorescência, análise ocidental do Borrão e filtro armadilha de ensaios.

No entanto, a maioria desses métodos é conformação específica e portanto não pode resolver o estado completo de fluxo de proteína mHTT devido à natureza complexa da solubilidade agregada e resolução.

Para a identificação dos agregados do mHTT e várias formas modificadas e complexos, separação e solubilização dos agregados celulares e fragmentos é obrigatória. Aqui nós descrevemos um método para isolar e Visualizar mHTT solúvel, monômeros, oligômeros, fragmentos, e um insolúvel alto peso molecular (HMW) acumulado mHTT espécies. HMW mHTT faixas com a progressão da doença, corresponde-se com leituras de comportamento do rato e tem sido beneficamente modulada por determinadas intervenções terapêuticas¹. Esta abordagem pode ser usada com cérebro de rato, cultura de células e tecidos periféricos, mas pode ser adaptada para outros sistemas modelo ou contextos de doença.

Introdução

O rompimento das redes de controle de qualidade de proteína que certifique-se de dobramento adequado e degradação de proteínas celulares são provável central para a patologia da doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD) e outros "enrolamento de proteínas" distúrbios de^2,3. Uma compreensão detalhada dos componentes de rede de proteostasis e suas contribuições para a patologia são, portanto, crucial para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas melhoradas. HD é causada pelo aumento anormal de uma repetição CAG no gene HD, resultando em um estiramento expandido de pol....

Protocolo

Declaração de ética animal - experimentos foram realizados em estrita conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório de institutos nacionais de saúde e um protocolo de pesquisa animal aprovado pelo (Comité de uso e cuidado institucional do Animal IACUC) da Universidade da Califórnia, Irvine, um AAALAC credenciada instituição. Foram envidados todos os esforços para minimizar o sofrimento dos animais.

1. preparação de Buffers de Lise

1. Prepare-se "Solúvel" lise (pH de Tris 10 mM 7.4, 1% Triton X 100, 150 mM NaCl, 10% de glicerol) e filtro estéril através de filtro de 0,22 µm.
   1. Para um trabalho "Solúvel....

Resultados

Resolução de lisado celular solúvel e insolúvel após fracionamento pode ser detectada usando ocidentais ensaios retardo análise e filtro (Figura 2). Como exemplo, HEK293T células foram transfectadas usando o reagente de transfeccao (por exemplo, lipofectamine 2000), com o exon HTT 1 codificação cDNA contendo glutamina 97 repete¹⁵ , seguido pela região rica poli prolina e essas células foram autorizadas a expresso por células d.......

Discussão

Algumas precauções são necessárias para os protocolos acima garantir resultados consistentes e quantitativos. Primeiro, mHTT em ambas as fracções espontaneamente irá formar agregados ao longo do tempo, após vários ciclos de descongelamento de congelamento, particularmente quando em alta concentração. Assim, é fundamental para congelar alíquotas das preparações de proteína e descongelar somente o volume necessário antes de executar o ensaio conforme descrito no protocolo acima. Além disso, se fração insolúvel produz desse.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtro estéril	Millipore	SCGP505RE	Tampa de rosca, filtro de vácuo estéril
1 mL Moedor de tecidos, Dounce	Wheaton	357538
Sonicator	Qsonica	Modelo Q125
DC Protein Assay	Biorad	5000111	Comparável ao ensaio
Lowry Tris 1M tampão solução	Alfa Aesar	J60636
Triton X-100	Fisher	BP151-100
NaCl 5M solução	Teknova	S0251
Glicerol		Fisher BP229-1
20% SDS solução	Teknova	S0295
N-etilmaleimida	Sigma	E1271
Fluoreto de fenilmetilsulfona	Sigma	P7626	criar solução de estoque de 100mM em 100% EtOH, loja em 4° C
Ortovanadato de sódio	Sigma	S6508	Criar solução estoque de 0,5M em água
Leupeptina	Sigma	L2884	Criar solução estoque de 10mg / ml em água
Aprotinina	Sigma	A1153	Criar solução estoque de 10mg / ml em água
Fluoreto de sódio	Sigma	S4504	Criar solução estoque de 500mM em água
Anti-HTT	Millipore	MAB5492	Use 1:1000 para western blot, 1:500 para ensaio de retardo de filtro
Anti-GAPDH	Novus Biologicals	NB100-56875	Use 1:1000 para western blot solúvel