Artigo de método

Fracionamento para resolução das espécies de Huntingtin solúvel e insolúvel

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DOI:

10.3791/57082

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27 de fevereiro de 2018

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1Department of Psychiatry and Human Behavior, University of California Irvine, 2UCI MIND, University of California Irvine, 3Department of Neurobiology and Behavior, University of California Irvine, 4Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

Neste artigo

Resumo

Um método é descrito por fracionamento de espécie mutante solúvel e insolúvel da cultura de cérebro e cela de rato. O método descrito é útil para a caracterização e quantificação de fluxo de proteína huntingtina e auxilia na análise de homeostase de proteína na patogênese da doença e na presença de perturbações

Resumo

O acúmulo de misfolded proteínas é central para a patologia na doença de Huntington (HD) e muitas outras doenças neurodegenerativas. Especificamente, uma chave característica patológica de HD é o acúmulo aberrante de proteína mutante HTT (mHTT) em complexos de alto peso molecular e corpos de inclusão intracelulares é composto por fragmentos e outras proteínas. Métodos convencionais para mensurar e compreender que as contribuições de várias formas de agregados contendo mHTT incluem microscopia de fluorescência, análise ocidental do Borrão e filtro armadilha de ensaios.

No entanto, a maioria desses métodos é conformação específica e portanto não pode resolver o estado completo de fluxo de proteína mHTT devido à natureza complexa da solubilidade agregada e resolução.

Para a identificação dos agregados do mHTT e várias formas modificadas e complexos, separação e solubilização dos agregados celulares e fragmentos é obrigatória. Aqui nós descrevemos um método para isolar e Visualizar mHTT solúvel, monômeros, oligômeros, fragmentos, e um insolúvel alto peso molecular (HMW) acumulado mHTT espécies. HMW mHTT faixas com a progressão da doença, corresponde-se com leituras de comportamento do rato e tem sido beneficamente modulada por determinadas intervenções terapêuticas1. Esta abordagem pode ser usada com cérebro de rato, cultura de células e tecidos periféricos, mas pode ser adaptada para outros sistemas modelo ou contextos de doença.

Introdução

O rompimento das redes de controle de qualidade de proteína que certifique-se de dobramento adequado e degradação de proteínas celulares são provável central para a patologia da doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD) e outros "enrolamento de proteínas" distúrbios de2,3. Uma compreensão detalhada dos componentes de rede de proteostasis e suas contribuições para a patologia são, portanto, crucial para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas melhoradas. HD é causada pelo aumento anormal de uma repetição CAG no gene HD, resultando em um estiramento expandido de polyglutamines (polyQ) na proteína de huntingtin (HTT)4. Uma característica patológica constante de patogênese de HD é o enrolamento resultante, acumulação e agregação de HTT em regiões do cérebro e em tecidos periféricos, que tem sido mostrado para interferir de várias maneiras com a função e a homeostase celular normal 5 , 6. enquanto HTT é expressado ubiquitously, médios neurônios espinhosos o striatum são seletivamente vulneráveis e mais abertamente afetada com notável atrofia cortical também associada à patogênese de HD.

A formação de agregados de HTT no cérebro de doentes de Huntington e modelos animais normalmente tem servido como um marcador de proxy para progressão da doença e ganho negativo dominante da função para o mHTT7. Embora os mecanismos precisos pelos quais proteínas enrolamento e agregação podem contribuir para toxicidade induzida pelo mHTT permanecem pouco claras, a formação destas inclusões no cérebro de doentes de Huntington e vários modelos animais é uma característica invariável e inevitável. Inclusões de aparecem ser composto em grande parte acumulada HTT fragmentos contendo o N-terminal expandido polyQ, indicando que a proteólise e processamento de longa-metragem HTT bem como alternativa de emenda8,9 pode desempenhar um importante papel na patogênese da HD. N-terminal HTT fragmentos pode constituir uma forma patológica de HTT que pode agregar rapidamente, nucleada e acelerar ou propagar a agregação processo10.

No entanto, a presença destas inclusões não necessariamente se correlaciona com toxicidade induzida por HTT ou célula morte11. HTT tem sido proposto para se submeter a um processo de agregação de um monômero solúvel através da espécie oligoméricas solúvel e fibrilas de β-folha para agregados insolúveis e inclusões12. Resolver essas várias espécies de proteína através de ensaios bioquímicos padrão tem sido um desafio no campo, devido a sua estabilidade em baixo-detergente do lysis e dificuldade em Visualizar usando padrão ensaios bioquímicos. Assim, considerações metodológicas são fundamentais para detectar o grau e o padrão do mHTT acumulada e agregado.

O protocolo apresentado aqui fornece um método para visualizar vários intermediários de HTT, especificamente a formação de uma espécie de HMW HTT insolúvel que aparece acompanhar de perto com HD patogênese e doença progressão1,13 ,14. Ser capaz de resolver e controlar múltiplas espécies de mHTT fornece pesquisadores uma ferramenta bioquímica para estudar a patogênese da doença e avaliar intervenções terapêuticas potenciais através da sua modulação e impacto na patogênese da doença.

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Protocolo

Declaração de ética animal - experimentos foram realizados em estrita conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório de institutos nacionais de saúde e um protocolo de pesquisa animal aprovado pelo (Comité de uso e cuidado institucional do Animal IACUC) da Universidade da Califórnia, Irvine, um AAALAC credenciada instituição. Foram envidados todos os esforços para minimizar o sofrimento dos animais.

1. preparação de Buffers de Lise

  1. Prepare-se "Solúvel" lise (pH de Tris 10 mM 7.4, 1% Triton X 100, 150 mM NaCl, 10% de glicerol) e filtro estéril através de filtro de 0,22 µm.
    1. Para um trabalho "Solúvel" do lysis, medir N-proteà (NEM) e dissolver completamente em 100mm phenylmethysulfonyl flúor (PMSF) dissolvido em 100% EtOH.
      Nota: Lysis Buffer inibidores: (i) 20 mM N-proteà (NEM); (ii) 0.2 mM PMSF; (iii) 1mm ortovanadato de sódio (at3vo +4); (iv) 1 leupeptin µ g/mL; (v) 1 aprotinina µ g/mL; (vi) 20mm fluoreto de sódio (NaF).
      Atenção: Use uma máscara quando se trabalha com NEM em todo o protocolo. Trabalhar lise deve ser feita fresco para garantir ativos inibidores.
    2. Para tampão de Lise solúvel com inibidores de protease, adicionar inibidores na seguinte ordem: fluoreto de sódio (NaF), volume com Lise fria, ortovanadato de sódio (at3vo +4), aprotinina e Leupeptin.
  2. Para "Insolúveis" tampão de Lise, suplemento 4% SDS adicionando 500 µ l de SDS 20% para 2 mL de tampão de lise "Solúvel". Deixe em temperatura ambiente.
    Nota: SDS vai precipitar-se quando mantidos a 4 ° C; manter em temperatura ambiente. Composição do lysis final: 10 mM Tris (pH 7,4); 1% Triton X-100; 150 mM NaCl; 10% de glicerol; 4% SDS (só insolúvel).

2. solúveis/insolúveis fracionamento protocolo

Nota: Consulte a Figura 1 para um esquema.

  1. Dois conjuntos de tubos para cada amostra de etiqueta: "Solúvel" e "Insolúveis".
  2. Adicione X-µ l de gelado trabalho solúvel lise suplementado com inibidores de protease (ver 1.1.1) ao tecido.
    Nota: X = Volume varia dependendo da quantidade de tecido; Consulte a tabela 1.
  3. Para o tecido de cérebro de rato (ou seja, corpo estriado), homogenizacao lentamente 30 vezes em vidro douncer de 1 mL e pipeta em "Insolúveis" rotulado tubo (manter no gelo).
    Nota: Tenha cuidado para não quebrar a superfície do líquido depois de começar a douncing, como bolhas irão formar e podem produzir a homogeneização incompleta.
  4. Para as células (ou seja, HeLa, HEK293T), enxague as células uma vez com o frio, 1X PBS. Remover PBS e aplicar o volume mínimo de lise de células e levantar com raspador de célula.
    Nota: Para acima da linha de celular, células foram banhadas em 5 x 105 células por 6 placa bem e crescidas para perto de confluência. Um bem é comparável aos volumes utilizados para striatum do rato.
  5. Transferir homogeneizado ou lisado em celular rotulado, "Insolúveis" tubos e lyse no gelo 1h (relógio de início após o processamento final tubo).
    Nota: Para lisados celulares, Triture várias vezes para quebrar aglomerados de células antes de começar a incubação. Evite a formação de bolhas. Brevemente o vórtice pulso cada amostra para 1 s lise no meio.
  6. Centrifugar as amostras a 4 ° C a 15.000 x g por 20 min.
  7. Recupere o sobrenadante como a fração de "Solúvel".
    1. Remover com pipeta, tenha cuidado para não perturbar a camada de sedimento/nublado como este vai contaminar a fração. Na fracção solúvel em "Solúvel" pipeta rotulada de tubo. Manter-se no gelo.
  8. Lave o pellet com 500 µ l de tampão de lise (x2) e centrifugar a 4 ° C a 15.000 x g por 5 min depois de cada lavagem; é okey se alguns da camada turva é pipetado fora.
  9. Após a lavagem final, remova todos os restantes tampão de lavagem, deixando apenas a pelota de tecido.
    Nota: A partir deste ponto, amostras insolúveis agora devem ser mantidas em temperatura ambiente.
  10. Ressuspender pelota com X-µ l tampão de Lise suplementado com SDS de 4% (Volume pode ser ajustado dependendo do tamanho da pelota; ver tabela 1).
  11. Proceda à sonicação cada amostra por 30 s em temperatura ambiente com um sonicador de sonda (125 Watts, 20kHz, pulso, Amplitude de 40%, consulte Tabela de materiais).
  12. Ferva amostras (rolamento ebulição) por 30 min; Centrifugue brevemente (15 s) a 6.000 x g, de não perder qualquer amostra.
  13. Realizar o ensaio da proteína de DC (detergente compatível) (ver Tabela de materiais) ou ensaio de proteínas Lowry para medir a concentração de proteína (recomendada começou diluições de 1/5 da amostra em tampão de Lise respectivos para cultura de células e 1/10 para lysates do tecido).
    Nota: As concentrações de proteína terá que ser lido usando um ensaio de DC ou Lowry devido à alta concentração de detergente.
  14. Alíquotas amostras em 50 lotes µ l para evitar problemas de congelamento e descongelamento.
    Nota: Protocolo pode ser pausado aqui antes da posterior análise bioquímica, armazenando as duas fracções a-20 ° C.

3. quantificação e ocidental do borrão

  1. Execute borrões ocidentais como relatado em outros lugares1,13 µ g de 30 diluição da amostra 1:1 em carregando buffer (1.6 x tintura, 1 x redução de carga).
    Nota: 30 µ g de proteína por fração é suficiente, mas pode ser ajustado para resolução ideal. 3 - géis de poli-acrilamida de Tris-Acetato de 8% devem ser usados para a fração insolúvel. 4 - géis de bis-Tris 12% são recomendadas para a fração solúvel.
  2. Ferva amostras (rolamento fervura) por 5 min. centrifugador brevemente (15 s) a 6.000 x g para coletar a amostra.
  3. Analise fracções por SDS-PAGE e borrão ocidental, de acordo com o protocolo do fabricante para amostras reduzidas.
    Nota: A fração insolúvel resolve melhor quando transferido para uma membrana de nitrocelulose 0,45 µM. nitrocelulose de 0.45 ou 0,2 µM pode ser usado para a fração solúvel, dependendo do tamanho da proteína de interesse. Alguma otimização pode ser necessária para melhor transferência de materiais HMW.
  4. Mancha de membrana com mancha toda proteína (por exemplo, MEMcode, veja a Tabela de materiais) para visualizar a proteína eficiência de carregamento.
    Nota: Borrões ocidentais podem ser analisados pela intensidade média de pixel. Frações solúveis podem ser normalizadas para uma proteína de domésticas melhor adequada para o sistema experimental. Fração insolúvel como abundância relativa de proteína foi verificada por proteína reversível coloração ou normalização de histona 3 no blot separado.

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Resultados

Resolução de lisado celular solúvel e insolúvel após fracionamento pode ser detectada usando ocidentais ensaios retardo análise e filtro (Figura 2). Como exemplo, HEK293T células foram transfectadas usando o reagente de transfeccao (por exemplo, lipofectamine 2000), com o exon HTT 1 codificação cDNA contendo glutamina 97 repete15 , seguido pela região rica poli prolina e essas células foram autorizadas a expresso por células d...

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Discussão

Algumas precauções são necessárias para os protocolos acima garantir resultados consistentes e quantitativos. Primeiro, mHTT em ambas as fracções espontaneamente irá formar agregados ao longo do tempo, após vários ciclos de descongelamento de congelamento, particularmente quando em alta concentração. Assim, é fundamental para congelar alíquotas das preparações de proteína e descongelar somente o volume necessário antes de executar o ensaio conforme descrito no protocolo acima. Além disso, se fração insolúvel produz desse...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo NIH (RO1-NS090390). Gostaríamos também de agradecer ao Dr. Joan Steffanfor assistência técnica e discussão durante o desenvolvimento deste teste.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Filtro estérilMilliporeSCGP505RETampa de rosca, filtro de vácuo estéril
1 mL Moedor de tecidos, DounceWheaton357538
SonicatorQsonicaModelo Q125
DC Protein AssayBiorad5000111Comparável ao ensaio
Lowry Tris 1M tampão soluçãoAlfa AesarJ60636
Triton X-100FisherBP151-100
NaCl 5M soluçãoTeknovaS0251
GlicerolFisher BP229-1
20% SDS soluçãoTeknovaS0295
N-etilmaleimidaSigmaE1271
Fluoreto de fenilmetilsulfonaSigmaP7626criar solução de estoque de 100mM em 100% EtOH, loja em 4° C
Ortovanadato de sódioSigmaS6508Criar solução estoque de 0,5M em água
LeupeptinaSigmaL2884Criar solução estoque de 10mg / ml em água
AprotininaSigmaA1153Criar solução estoque de 10mg / ml em água
Fluoreto de sódioSigmaS4504Criar solução estoque de 500mM em água
Anti-HTTMilliporeMAB5492Use 1:1000 para western blot, 1:500 para ensaio de retardo de filtro
Anti-GAPDHNovus BiologicalsNB100-56875Use 1:1000 para western blot solúvel

Referências

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