O objetivo geral desta metodologia é dar as condições experimentais ideais de preparação da amostra para aquisição de imagem e reconstrução para realizar imagens de dSTORM 2D cor dupla de microtúbulos e filamentos intermediários em células fixas
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Artigo de método
Filamentos intermediários e microtúbulos com microscopia 2-dimensional direta estocástico reconstrução óptico de imagem
Neste artigo
Resumo
Resumo
O citoesqueleto, composto de microfilamentos de actina, microtúbulos e filamentos intermediários (se), desempenha um papel fundamental no controle da forma da célula, polaridade e motilidade. A organização das redes de actina e microtúbulos tem sido extensivamente estudada, mas da IFs não é ainda totalmente caracterizada. O iFs tem um diâmetro médio de 10 nm e forma uma rede estendendo-se por todo o citoplasma da célula. Eles estão fisicamente associados com actina e microtúbulos através de motores moleculares e linkers do citoesqueleto. Esta associação apertada é o cerne dos mecanismos de regulação que asseguram o Regulamento coordenado das três redes cytoskeletal requeridas para a maioria das funções celulares. É, portanto, crucial Visualizar IFs sozinho e, também, juntamente com cada uma das outras redes do citoesqueleto. No entanto, as redes se são extremamente densas na maioria dos tipos de células, especialmente nas células gliais, que faz com que sua resolução muito difícil de conseguir com microscopia de fluorescência padrão (lateral resolução de ~ 250 nm). Direto estocástico microscopia óptica de reconstrução (dSTORM) é uma técnica que permite um ganho na resolução lateral de uma ordem de magnitude. Aqui, nós mostramos que a resolução lateral dSTORM é suficiente para resolver a densa organização das redes se e, em particular, dos feixes se cercam os microtúbulos. Tal associação apertada é provável que participam na regulação coordenada dessas duas redes e maio, explicar como modelo de IFs vimentina e estabilizar a organização microtubule também poderia influenciar microtubule dependente tráfico vesicular. Mais geralmente, mostramos como a observação de dois componentes do citoesqueleto, com técnica de duplo-cor dSTORM traz a introspecção nova sua interação mútua.
Introdução
Filamentos intermediários citoplasmáticos (IFs) são 10 nm de diâmetro, homo ou heteropolímeros de um subconjunto específico de tipo de célula de proteínas se. O iFs participam em uma grande variedade de funções celulares, tais como respostas de estresse, a proliferação e a motilidade celular. Seu papel-chave é realçado pelo fato de que mais de 90 doenças humanas são diretamente causadas por mutações em proteínas se; por exemplo, alterações na composição se acompanha o crescimento do tumor e espalhar1,2,3. Existe uma crescente evidência de que os três sistemas de citoesqueleto....
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Protocolo
1. preparação lamelas (1 dia, 30 min)
- Coloque as nº1.5H 18mm (170 µm + /-5µm) as lamelas de vidro em uma cremalheira de plástico.
- Colocar o cesto cheio de acetona e molho por 5 min num copo de 100 mL.
- Transferi o rack para um copo de 100 mL com etanol absoluto e molho por 5 min.
- O rack de transferência para um novo copo de 100 mL cheio de etanol absoluto e colocar o copo em um dispositivo de limpeza ultra-sônico (ver tabela de materiais) à temperatura ambiente. Pressione "na" e aguarde 10 min.
- Coloque a grelha sob uma capa de fluxo laminar e deixe as lamelas secar ou secar as lamelas com fluxo de ar filtrado.
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Resultados
Um microscópio equipado com 50 mW 405 nm e 100 mW, 488, 561 e 642 nm Solid-State lasers, um EMCCD câmera de 512 x 512, um alfa Apo plano 100 X / 1,46 objectivo e banda passam 570-650 / 655 emissões de filtros passam-tempo foi usado para os resultados representativos apresentados abaixo.
Figura 1A dá um exemplo de molécula densidade e sinal à relação de ruído que deve ser usada durante a aquisição de.......
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Discussão
Passos críticos no protocolo
Apresentamos aqui um protocolo que minimiza artefatos nas imagens dSTORM de microtúbulos e IFs em células gliais. Artefatos podem ser criados em cada etapa da preparação da amostra e imagem latente: fixação, bloqueando, immunolabeling, deriva durante a aquisição, não ideal piscando condições23. Listamos abaixo os passos mais críticos.
As lamelas de limpeza é um passo importante para limitar a liga.......
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Divulgações
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Agradecimentos
Agradecemos Mickael Lelek, Orestis Faklaris e Nicolas Bourg para discussão proveitosa, Andrey Aristov e Elena Rensen para ajuda com a técnica de super-resolução e Shailaja Seetharaman para leitura cuidadosa do manuscrito. Reconhecemos, com gratidão, a Citech UtechS fotônico BioImaging (Imagopole) do Instituto Pasteur (Paris, França), bem como a rede de infra-estruturas de França-BioImaging suportados pela agência francesa de investigação nacional (ANR-10-INSB-04; Investimentos para o futuro) e a modernização de Région (programa Domaine d'Intérêt Majeur-Malinf) para o uso do microscópio Elyra. Este trabalho foi apoiado pela a Ligue Contre le Cancer e a agência francesa....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Mídia Essencial Mínima (MEM) | Gibco | 41090-028 | cultura de células |
| aminoácido não essencial | Gibco | 1140-050 | cultura de células 1/100e |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | cultura de células 1/100e |
| Fœ tal Soro Bovino | Gibco | 10270-106 | cultura de células 1/10e |
| 0,05 % Tripsina-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | cultura de células |
| PBS 10x | fischer scientific | 11540486 | |
| lamínula de cultura de células 18 mm n° 1,5H | Marienfield/Dominic dutsher | 900556 | |
| solução de paraformaldeído (PFA) | Sigma | F8775 | fixação celular |
| glutaraldeído | Sigma | G5882 | fixação celular |
| triton X100 | Sigma | T9284 | surfactante não iônico. Usado para fixação celular |
| borohidreto de sódio (NaBH4) | Sigma | 452904-25ML | fixação |
| BSA | Sigma | A7906 | passivação de amostra 3% em PBS |
| Anticorpo monoclonal anti-vimentina (V9) produzido em camundongo | Sigma | V6630 | anticorpos primários |
| primários | |||
| anti-alfa tubulina Biorad MCA77G de ratoAnticorpo secundário anti-rato IgG (H+L) de cabra, Alexa Fluor 555 | Fisher scientific | 10635923 | anticorpos secundários |
| Anticorpo secundário Ionkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Fisher scientific | 10226162 | anticorpos secundários |
| Microesferas TetraSpeck, 0.1 µ m, azul fluorescente / verde / laranja / vermelho escuro | Fisher scientific | T7279 | contas fluorescentes |
| Câmara magnética Chamlide | Instrumento de célula viva | CM-B18-1 | suporte de amostra magnética, volume máximo 1,2 mL |
| Cisteamina (MEA) | Sigma | 30070 | para o tampão piscante |
| glicose oxidase de Aspergillus niger | Sigma | G0543 | para o tampão |
| glicose | sigma | para o tampão piscante | |
| catalase de fígado bovino | Sigma | C9322 | para o tampão piscante |
| Tris (trizma) | Sigma | T1503 | para o tampão piscante |
| Wash-N-Dry porta-lamínulas | Sigma | Z688568 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | de filme de parafina |
| Limpador de plasma Fisher scientific | 15-335-6 | ||
| Harrick plasma | PDC-32G-2 |
Referências
- Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
- Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. <....
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Reimpressões e permissões
