Este artigo fornece uma abordagem atualizada para o sistema de Quimera de codorna-galinha clássica para estudar a formação do órgão, combinando procedimentos experimentais in vitro e in ovo romance.
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Artigo de método
Abordagem em duas fases para explorar e tarde-estágios iniciais de formação do órgão no modelo aviária: O Timo e glândulas paratireoides organogênese paradigma
Neste artigo
Resumo
Resumo
O embrião aviária, como modelo experimental, tem sido de extrema importância para descobertas seminais em biologia do desenvolvimento. Entre várias abordagens, a formação de codorna-frango quimeras e a utilização da membrana corioalantoicas (CAM) para sustentar o desenvolvimento de tecidos ectópicos datam do século passado. Hoje em dia, a combinação dessas técnicas clássicas com recentes em vitro metodologias oferece novas perspectivas para explorar ainda mais a formação de órgãos.
Aqui nós descrevemos uma abordagem em duas fases para estudar cedo e tarde-estágios da organogênese. Brevemente, região embrionária que contém o território presuntivo do órgão é isolada da codorna embriões e crescido em vitro em um sistema de organotypic (até 48 h). Tecidos cultivados são posteriormente enxertados o CAM de um embrião de galinha. Após 10 dias de desenvolvimento no ovo , completamente formada de órgãos são obtidos de tecidos transplantados. Este método também permite que a modulação de vias de sinalização pela regular Administração de agentes farmacológicos e manipulação genética de tecido ao longo de etapas no desenvolvimento in vitro e no ovo . Além disso, o desenvolvimento de tecidos pode ser coletado em qualquer janela de tempo para analisar o seu perfil de expressão gênica (usando microarrays, PCR quantitativo (qPCR), etc.) e morfologia (avaliados com imunoquímica e histologia convencional).
O procedimento experimental descrito pode ser usado como uma ferramenta para acompanhar a formação de órgãos fora do embrião aviária, desde as fases iniciais da organogênese totalmente formado e órgãos funcionais.
Introdução
Embriões aviários têm sido amplamente utilizados em estudos de biologia do desenvolvimento seminal. As principais vantagens do modelo aviária incluem a possibilidade de abrir o ovo, o acesso relativamente fácil para o embrião e a capacidade de executar micromanipulação. Alguns exemplos incluem o sistema clássico de codorna-galinha de Quimera para estudar a célula destino1, aplicação específicas de fatores de crescimento para o embrião2e o crescimento das estruturas celulares ectópica no CAM1,3, 4.
Para obter novos insights sobre estágios distintos de formação do órgão, recentemente desenvolvemos um método que combina técnicas de enxertia com manipulação em vitro de tecidos embrionários5. A abordagem em duas fases permite a discriminação e a exploração de ambos - e tarde-fases iniciais da organogênese, que muitas vezes são limitados devido ao tecido altamente dinâmico e complexas interações2. Além disso, a falta de marcadores de tecido-específica adequados frequentemente limita o uso de geneticamente modificados animal modelos6. Este novo método da abordagem em duas fases supera largamente tais limitações.
Para estudar estágios iniciais de formação do órgão, na primeira etapa, o território de codorna embrionárias compreendendo o rudimento do órgão em perspectiva é isolado e crescido em um sistema de organotypic em vitro por 48 h. Durante este período, modulação farmacológica das vias de sinalização específicas pode ser executada com a adição de drogas para o meio de cultura5,7. Além disso, tecidos cultivados podem ser coletados em qualquer fase de crescimento em vitro e vasculhados a procura de expressão gênica (usando métodos como qPCR, microarrays, etc.).
Na segunda etapa, 48 h-cultivadas tecidos são então enxertados o CAM de um embrião de galinha (c) no dia embrionário (E) 8 (cE8) (Hamburger e Hamilton (HH)-estágios 33-35)8. O CAM comporta-se como um fornecedor vascular de nutrientes e permite que o gás troca1,3,4 aos tecidos enxertados, permitindo seu desenvolvimento no ovo por longos períodos de tempo. Nesta etapa experimental é especialmente adequada para estudar os estágios finais da organogênese, como órgãos completamente formados podem ser obtidos após 10 dias no ovo desenvolvimento5,9,10,11 . Análise morfológica é facilmente realizada por histologia convencional para confirmar a formação adequada do órgão e a origem do doador das células pode ser identificada por imuno-histoquímica utilizando anticorpos espécie-específicos (ou seja, MAb codorna PeriNuclear (QCPN)). Durante o período de incubação de CAM, enxertos também podem ser cultivados na presença de agentes farmacológicos e coletados em qualquer fase de desenvolvimento para avaliar a progressão da organogênese.
A abordagem em duas fases, aqui descrita em profundidade, já foi empregada em Figueiredo et al . 5 a explorar o desenvolvimento de Primórdio comuns aviária paratireoide/Timo. Por conseguinte, as particularidades inerentes dos territórios embrionárias e estágios de desenvolvimento envolvido na organogênese do Timo e glândulas paratireoides serão apresentados abaixo.
O Timo e glândulas paratireoides epitélios, embora funcionalmente distintos, derivam da endoderme das bolsas faríngeas (PP)12. Em aves, os epitélios destes órgãos originam o terceiro e quarto PP endoderme (3/4PP)12, enquanto nos mamíferos o epitélio tímico deriva o 3PP e o epitélio das glândulas paratireoides deriva do 3PP e 3/4PP no mouse e humano, respectivamente13,14.
Uma das primeiras etapas na formação destes órgãos é o surgimento de Timo discreto e paratireoides domínios no Primórdio comuns. Frango, estes domínios podem ser identificados por hibridação in situ , com marcadores moleculares específicos, e 4.515. Como o desenvolvimento prossegue, estes rudimentos de órgãos individualizar e separam-se da parede posterior da faringe, enquanto uma fina cápsula mesenquimal, formada por células da crista neural-derivado, os rodeia (em E5; HH-stage-27). Mais adiante, o epitélio tímico é colonizado por células progenitoras hematopoiéticas (no E6.5; HH-stage 30)12.
Como em estudos clássicos de codorna-frango1,12, a abordagem em duas fases é particularmente útil para estudar a formação de órgãos hematopoiéticos/linfoides, ou seja, o Timo5. Como a codorna explantes, com o rudimento do órgão, é enxertado no embrião frango antes da colonização de células progenitoras hematopoiéticas, um timo quimérico é formado com galinha pelo sangue progenitoras infiltrando uma contrapartida de epitélio tímico codorna. Este método é, portanto, uma ferramenta útil para explorar a contribuição das células hematopoiéticas no desenvolvimento do sistema hemato/linfoide aviária.
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Protocolo
Todas estas experiências sigam os cuidados com animais e diretrizes éticas do Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. incubação de fertilizado codornas e ovos de galinha
- Incube codornas japonesas (Coturnix japonica coturnix) e ovos de galinha (Gallus gallus) fertilizado dias 3 e 8, respectivamente.
- Coloque os ovos com câmara de ar (fim brusco do ovo) voltada para cima em uma incubadora umidificada a 38 ° C.
- Use ovos de codorna em torno de 20 e 40 ovos de galinha para realizar este experimento.
Nota: Estes números devem ser duplicados ao estabelecer este procedimento pela primeira vez.
2. isolamento de codorna embrionárias região contendo o território presuntivo de rudimentos das paratireoides e do Timo
Nota: Ovo de executar procedimentos de manipulação em condições estéreis, usando um capuz de fluxo laminar horizontal e instrumentos esterilizados e materiais.
- Prepare uma tigela grande de vidro de borosilicato sobre 3/4 preenchido com solução salina fria de tampão fosfato (PBS).
- Abra um ovo de codorna depois de 3 dias de incubação batendo a casca e corte uma abertura circular no lado oposto de seu fim brusco com uma tesoura curva. Cuidadosamente remova pedaços de casca e transferir o embrião para a tigela de vidro cheia de frio PBS.
- Segure o embrião de codorna (q) na E3 (qE3) (codorna fase correspondente à HH-fase 21 do frango) com a ajuda da pinça fina. Fazer um corte na membrana vitelínico, envolvendo a gema com uma tesoura curva. Continue a cortar ao redor e, externamente, para a circunferência de vasos extra embrionários.
- Transferência do embrião para uma pequena bacia cerca de 3/4 cheio de PBS frio com a ajuda da pinça fina. Lave cuidadosamente o embrião do restante gema anexado.
- Use uma escumadeira para transferir o embrião para um vidro de 100 mm placa de Petri com base preta (ver Tabela de materiais) contendo 10 mL de PBS frio.
- Coloque o prato de Petri sob um estereomicroscópio.
Nota: A partir daí, execute os procedimentos de microcirurgia sob um estereomicroscópio ampliação progressiva. Como uma fonte de iluminação, é aconselhável usar luzes LED incorporadas no estereomicroscópio ou nas fibras ópticas, considerando a carga de calor limitada. - Segure o embrião à parte inferior da placa com pinos finos de insetos. Coloque quatro pinos, formando um quadrado na região extra embrionária.
- Remova as membranas extra embrionárias da região cefálica, com a ajuda de uma pinça fina e coloque um alfinete quinto lá.
Nota: Se o embrião está posicionado corretamente, então a vesícula ótica, o tubo de coração e o 1st, 2nde 3rd arcos pharyngeal (PAs) devem ser visíveis. - Disse a região embrionária de interesse, ou seja, os 3rd e 4th região arco faríngeo (3/4PAR), usando uma tesoura de olho Wecker.
- Comece cortando longitudinalmente e paralelamente ao eixo do embrião, entre a área do tubo neural/somite e o PAs.
- Retire o tubo de coração posicionado ventralmente por cortá-lo. Mantendo a tesoura na mesma posição, gire o prato de Petri para reposicionar o embrião de acordo com a direção do corte.
- Corte entre as 2nd e 3rd PAs e abaixo 4th PA
- Retire as membranas restantes do 4PAR/3 com a ajuda da pinça fina.
- Aspire os tecidos isolados (a 3/4PAR) e transferência-los para um prato de vidro 3/4 cheio de PBS frio usando uma pipeta plástica estéril de 2 mL.
Nota: Daqui por diante, os tecidos podem ser crescidos em vitro até 48 h ou imediatamente ser enxertados o CAM de um embrião de galinha no E8. - Mantenha o prato de vidro contendo a 3/4PAR isolados no gelo durante a preparação do ensaio em vitro .
3. ensaio de Organotypic in Vitro : cultura da região embrionária que contém o território presuntivo de rudimentos das paratireoides e do Timo
- Prepare o meio de cultura com RPMI-1640, suplementado com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina.
Nota: Solúveis reagentes farmacológicos podem ser adicionados ao meio (por exemplo, LY-411.575 (Ly) e di-benzazepine ou cyclopamine e vismodegib, para inibir o entalhe e Hedgehog (Hh), sinalização de caminhos, respectivamente. Para este teste, use 50-200 nM de Ly ou 5-15 µM de Di-benzazepine para inibir a sinalização de entalhe no 3 / 4PAR. usar 20 µM de cyclopamine ou 10 µM de vismodegib para inibir Hh sinalização no 3/4PAR5. - Prepare a cultura em vitro do explante 3/4PP em uma placa de 6.
- Encha um poco da placa de 6 com 5 mL de meio de cultura. Coloque um Insert de membrana de policarbonato de 24 mm (ver Tabela de materiais) sobre o bem com a ajuda da pinça fina.
- Sob o microscópio estereoscópico, transferir o explante 3/4PAR do prato de vidro para a superfície da membrana deslizando suavemente com a ajuda de uma colher de transplante (ou espátula) e fina fórceps. Coloque os explantes com o lado ventral para cima e do lado dorsal em contato com a membrana. Adicione até sete explantes por inserção de membrana. Prossiga para a etapa 3.4.
- Como alternativa, cultura explants em filtros de membrana de flutuação.
- Prepare um prato de Petri com 5 mL de meio de cultura de 35mm. Com a ajuda da pinça fina, float uma membrana filtro (ver Tabela de materiais) e manter uma superfície seca em contato com o ar.
- Sob o microscópio estereoscópico, transferir o explante 3/4PAR do prato de vidro para o filtro de membrana deslizando suave com a ajuda de uma colher de transplante (ou espátula) e fina fórceps. Coloque os explantes com o lado ventral para cima e do lado dorsal em contato com a membrana. Adicione até 8 explantes por filtro de membrana.
- Coloque cuidadosamente os explantes preparados nas etapas 3.2 e 3.3 numa incubadora umidificado a 37 ° C com 5% de CO2.
- Após um período de incubação de 48 h, remova a placa de 6 e o prato de Petri de 35mm a incubadora.
- Recolha os explantes culturas da inserção da membrana da placa 6-poços.
- Adicione PBS em temperatura ambiente (RT) a inserção da membrana.
- Desanexe os explantes da membrana por lavagem vigorosa, utilizando uma pipeta plástica estéril de 2 mL.
- Com a ajuda da espátula e pinça fina, transferir os explantes cultivadas para um prato de vidro 3/4 cheios de PBS em RT
- Da mesma forma, colete os explantes cultivados através do filtro de membrana flutuante no 35 mm placa de Petri.
- Transferir o filtro de membrana com pinça fina para um prato de Petri 35mm nova cheia de PBS em RT
- Desanexe os explantes do filtro de membrana, vigoroso pipetagem usando uma pipeta plástica estéril de 2 mL.
- Com a ajuda da pinça fina, descarga do filtro de membrana livre de explant depois confirmar que nenhum explantes permaneceram ligado a ele.
- Com uma espátula e pinça fina, transferir os explantes para um prato de vidro cheio de PBS em RT
- Recolha os explantes culturas da inserção da membrana da placa 6-poços.
- Transferir os explantes cultivados com uma espátula para 1 mL de reagente para isolamento de RNA total e usar para estudos de expressão gênica.
Atenção: Exposição a este reagente (ver Tabela de materiais) pode ser um perigo grave para a saúde. Use luvas, roupas e óculos de proteção apropriado. Siga as instruções de manuseamento e ler as fichas de dados de segurança fornecidas pelo fabricante. - Como alternativa, os tecidos cultivados em CAM de embriões de galinha no E8 do enxerto. Siga para o passo 4.
4. preparação da came
- Retire os ovos de galinha com 8 dias de desenvolvimento embrionário da incubadora.
Nota: Os ovos foram incubados com câmara de ar, virada para cima para 38 ° C numa incubadora umidificado. - Cobrir o fim brusco do ovo com fita de plástico transparente para impedir que partes da casca na câmara de ar. Bata a casca e corte uma abertura circular no ovo com uma tesoura curva. Câmara de ar deve ser visível.
- Retire com cuidado a membrana branca da câmara de ar com pinça fina. CAM é visível e acessível para o transplante de tecido ectópico.
Nota: Não use PBS para hidratar o CAM, antes ou após o transplante, desde que o PBS promove deslizamento e extravio dos explantes. Se a membrana desseca, descarte o ovo.
5. enxerto de explantes cultivados para o CAM
- Crie pequenas lesões vasculares/feridas nos pequenos vasos da came com um microscalpel em um suporte.
Nota: Use a ponta de uma pipeta Pasteur para remover sangue por capilaridade em caso de sangramento excessivo. - Use uma espátula e pinça fina para transferir o explante cultivada à área ferida da CAM.
- Corte um pedaço de papel de filtro ligeiramente maior do que o explante e colocá-lo no topo do explante.
Nota: O filtro de papel ajuda a localização de explante de rastreamento após seu desenvolvimento na CAM. Além disso, permite entrega diária da droga para o explante durante o desenvolvimento no ovo , se necessário (descrito na etapa 5.6). - Feche a janela de ovo com fita de plástico transparente e identificá-lo usando um lápis de carvão.
Nota: A fita de plástico protege o embrião da desidratação durante o período de incubação. - Incubar o ovo manipulado por 10 dias em uma incubadora umidificado a 38 ° C. Siga para a etapa 6.
- Passo opcional: Droga administração diária durante o período de incubação.
- Para acessar o filtro, parcialmente levante a fita plástica. Adicione 100 µ l de solução de fármaco, gota a gota, em cima do papel. Re-feche a janela e coloque o ovo de volta na incubadora umidificada a 38 ° C.
Nota: Para este ensaio, a dose de 20 µM de cyclopamine inibirá Hh sinalização durante no ovo desenvolvimento5.
- Para acessar o filtro, parcialmente levante a fita plástica. Adicione 100 µ l de solução de fármaco, gota a gota, em cima do papel. Re-feche a janela e coloque o ovo de volta na incubadora umidificada a 38 ° C.
6. gravidez ectópica órgão formação na câmara após 10 dias de desenvolvimento no Ovo
- Após 10 dias de incubação, retire o ovo da incubadora e retirar cuidadosamente a fita plástica.
- Corte o CAM em torno da região de filtro usando tesouras curvas e transferência do explante CAM-derivado com papel de filtro para um pequeno copo bacia cerca de 3/4 cheio de frio PBS.
- Com a ajuda da pinça fina transferi o explante CAM-derivado a uma placa de Petri de 100mm com base preto contendo 10 mL de PBS. Remova cuidadosamente o papel de filtro e o excesso de membrana usando Wecker olho tesoura e pinça fina.
- Transferir o CAM-explante para solução fixador (3,7% PFA em PBS) com uma escumadeira. Abater os embriões de galinha sem removê-los do ovo, fazendo um corte preciso na região do pescoço do embrião com a ajuda de uma tesoura grande.
- Avalie a formação do órgão em cortes de parafina dos CAM-derivado de explantes por imuno-histoquímica e histologia convencional.
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Resultados
O acima descrito detalhes de protocolo de um método que permite a investigação de ambos - e tarde-início da organogênese, muitas vezes limitada por complexas interações celulares e moleculares.
Este método foi empregado anteriormente em Figueiredo et al . 5 para desvendar o papel do entalhe e Hh sinalização no desenvolvimento Primórdio comuns aviária paratireoide/Timo.
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Discussão
Um aspecto crucial para o sucesso deste método é a qualidade da galinha e codorna ovos. Considerando os períodos de incubação longos, particularmente durante o ensaio em ovo , uma boa qualidade de ovos de galinha melhora viabilidade taxas (até 90%) até ao final do procedimento. Para conseguir isso, testar os ovos de diferentes fornecedores. Incubar ovos de unmanipulated por longos períodos (até 16-17 dias) e verificar o seu desenvolvimento. Para ser considerado um lote de boa qualidade, mais de 80% dos embriões ...
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores são gratos ao António Cidadão, Isabel Alcobia e Leonor Parreira para a leitura crítica do manuscrito, a Padma Akkapeddi para a narração, e Vitor Proa do serviço de histologia do Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, para suporte técnico. Estamos particularmente agradecidos a Paulo Caeiro e Hugo Silva da Unidade de audiovisuais (unidade do Audiovisual), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa para seu compromisso excepcional para a produção deste vídeo. Reconhecemos a Leica Microsystems para gentilmente fornecendo um estereoscópio equipado com sistema de vídeo e a Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A. por contribuir com codorna fertilizado ovos. Este trabalho foi apoiado pela Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ovos fertilizados com galinha (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Fazenda avícola | |
| Ovos fertilizados com codornas (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| Tubos de centrífuga PP de 15 mL Tubos de centrífuga de PP de 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tubos de centrífuga PP de 50 mL Pratos | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm | Grupo Duran 21 | 755 41 | |
| Pratos de pirex de 100 x 20 mm | Duran group | 21 755 48 | |
| Inserto de membrana de policarbonato | Corning | 3412 | Transwell de 24 mm com Inserção de Membrana de Policarbonato de Poro de 0,4 mm |
| Filtro de membrana | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore filtro de membrana |
| 6-well placas de cultura | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| placa de Petri, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Tigelas | Pyrex de supermercado | ||
| Pipetas de transferência | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S 2 | mL pipeta de plástico Pipeta |
| de pasteur de vidro | normax | 5426015 | |
| Whatman papel de filtro qualitativo | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Papel de filtro |
| Fita | de supermercado | ||
| Citoqueratina (pan; ácido e básico, citoqueratinas tipo I e II), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Hidrato de ciclopamina | Sigma-Aldrich | C4116 | Inibidor farmacológico da sinalização de Hh Soro |
| bovino fetal | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| anticorpo QCPN | Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, suplemento GlutaMAX | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A / B Elastômero de silicone 1,1 kg Kit | ELKEM / Silmid | RH141001KG | Para preparar a base traseira para placa de Petri |
| Estemolécula LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Inibidor farmacológico da sinalização Notch |
| Reagente TRIzol | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagente para isolamento total de RNA |
| Dumont #5 Fórceps | Ferramentas de Ciência Fina | 11251-30 | Pinça fina |
| Tesoura Bonn extra fina, curvada | Ferramentas de Ciência Fina | 14085-08 | Tesouras curvas Alfinetes de |
| insetos | Ferramentas de Ciência Fina | 26001-30 | |
| Micro espátula | Fine Science Tools | 10087-12 | Colher de transplante |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microbisturi |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Suporte |
| Moria Colher perfurada Fine | Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Câmera | Leica Microsystems | MC170 | |
| Leica Microsystems | Microscópio Leica M80 | ||
| Leica | Microsystems | DM2500 |
Referências
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Reimpressões e permissões
