Isolamento e cultura de roedor Microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro

Resumo

Esforços para entender a função microglial no detalhe tem sido prejudicados pela falta de modelos de cultura microglial que recapitular as propriedades de micróglia maduro na vivo . Este protocolo descreve uma abordagem de isolamento e cultura projetada para manter a sobrevivência robusta de rato maduro altamente ramificados microglia sob condições definidas e médias.

Resumo

Microglia representam 5-10% de todas as células do sistema nervoso central (SNC) e são cada vez mais atenção devido a suas contribuições durante o desenvolvimento, homeostase e doença. Embora os macrófagos têm sido estudados em detalhe por décadas, recursos especializados de micróglia, os macrófagos de tecido-residente do SNC, mantiveram-se em grande parte misteriosa, em parte devido às limitações na habilidade de recapitular microglial maduro Propriedades em cultura. Aqui, podemos ilustrar um procedimento simples para o isolamento rápido de puro microglia no cérebro de roedor maduro. Descrevemos também condições de cultura livre de soro que suportam níveis elevados de microglial viabilidade ao longo do tempo. Microglia cultivada sob essas condições definidas e médias apresentam elaborados processos ramificados e comportamento dinâmico de vigilância. Podemos ilustrar alguns efeitos de exposição de soro na microglia culta e discutir como essas culturas isento de soro comparam com culturas expostas ao soro, bem como micróglia em vivo.

Introdução

Como os macrófagos do parênquima CNS, microglia interagir com uma vasta gama de circuitos neuronais e gliais redes de sinalização. Eles desempenham um papel vital no desenvolvimento e na homeostase do cérebro através de poda sináptica, afastamento de célula apoptótica e transitórias interações com processos neuronais^1,2. Microglia são primeiros respondentes a lesões neurológicas, estendendo seus processos longos e finos para sites de lesão para coordenar as respostas inflamatórias e limitar o sangramento^3,4. Alterações na função e morfologia microglial são onipresentes em lesões de CNS agudas e crônicas, e microglia exposição alterou a expressão de mediadores inflamatórios em uma variada gama de Estados de doença¹, localização e morfologia. Estudos de genéticos humanos indicam que mutações que alteram o risco para doenças neurodegenerativas são frequentemente predominantemente ou exclusivamente expressa pela micróglia no SNC intacta, apontando para um papel crucial para microglia na patogênese da doença ou progressão⁵ . Dada sua proeminência em ferimentos e doenças, promover a compreensão da biologia microglial é uma alta prioridade para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.

Muitos avanços importantes para a compreensão da biologia microglial surgiram extrapolando as técnicas e mecanismos descobertos em estudos de outras populações de macrófagos, incluindo métodos de cultura, perfis de expressão de gene e definições de funcional / morfológica dos Estados. Embora generalizada macrófago funções muitas vezes jogar em formas surpreendentes dentro da paisagem do CNS, microglia são eles próprios altamente especializado, exibindo uma morfologia ramificada e uma assinatura de expressão de gene único que os distingue de outros tecidos os macrófagos⁶. Microglia tem uma linhagem que é diferente da maioria dos outros macrófagos de tecido; Eles colonizam o CNS durante uma onda de embrionária precoce da hematopoiese primitivo e auto renovam ao longo da vida, independente de contribuições de hematopoiese definitivo⁷. A assinatura de expressão de gene totalmente maduro do adulto microglia não é alcançada até a segunda semana pós-parto⁸. Dicas ambientais no tecido circundante desempenham um papel importante em ditar o macrófago tecido-específica características⁶, que no SNC inclui limitada exposição a fatores transmitidas pelo sangue, concedido pelo barreira hemato - encefálica,⁹.

Um obstáculo para compreender plenamente microglial contribuições para a homeostase do CNS e doença é a dificuldade de sintetizando as propriedades especializadas do maduro microglia visto na vivo com células purificadas in vitro. Muitos métodos têm sido desenvolvidos para isolar e cultura microglia intacta, mas a maioria das abordagens dependem de soro para apoiar a sobrevivência da pilha. Mostramos que além de soro, que é um reagente inerentemente variável que contém uma vasta gama de moléculas bioativas, é especialmente problemática quando trabalhar com microglia porque promove uma morfologia ameboide, aumentou a proliferação, e aumento da fagocitose⁹ muitas vezes visto em vivo quando microglia são expostas ao sangue a cargo de fatores após o rompimento da barreira do sangue - cérebro. Por essas métricas, células expostas ao soro se assemelham a micróglia em lesões ou doenças, mas tais alterações são reduzidas quando microglia são cultivadas em meio de crescimento definidos contendo CSF-1 (ou IL-34), TGF-β, colesterol e Selenito.

Este protocolo fornece detalhes sobre cultivo microglia juvenil rato sob condições isento de soro, relacionadas com o trabalho recentemente publicado⁹. Este protocolo foi racionalizado para ratos de pós-Natal dia 21-30 (P21 - P30), mas pode ser adaptado para isolar microglia de ratos e camundongos, de qualquer idade, embora o rendimento e a viabilidade global irão variar dependendo da espécie e idade do animal. Máximo rendimento e viabilidade ideal é alcançada quando usando um pouco imaturo microglia (~ P9), com rendimentos e viabilidade gradualmente afilado, um pouco mais baixos níveis em animais adultos. Microglia também pode ser isolado de ratos, mas achamos que pilhas do rato mostram significativamente mais elevados rendimentos, viabilidade e complexidade de morfologias ramificadas, quando comparado com as pilhas do rato em culturas isento de soro. Animais com idade superior a P50 não foram avaliadas com este protocolo. Este procedimento de isolamento de immunopanning foi otimizado para minimizar as alterações nos perfis transcriptional microglial durante o isolamento e para maximizar a jusante viabilidade das células. Usando estas técnicas e formulações de mídia, alta-viabilidade culturas primárias podem ser sustentadas por semanas. Microglia cultivada sob essas condições apresentam uma morfologia altamente ramificada envolvendo rápida extensão e retração dos processos e relativamente baixas taxas de proliferação. Podemos destacar a importância do soro-exposição sobre essas propriedades e discutir os pontos fortes e fraquezas deste método em relação a outras abordagens.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo roedores em conformidade com as diretrizes da Universidade de Stanford, que estejam em conformidade com políticas e leis estaduais e nacional. Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo painel administrativo da Universidade de Stanford no cuidado do Animal de laboratório.

Nota: Todas as composições de buffer e solução são fornecidas na Tabela de materiais.

1. preparar um prato de Petri para Immunopanning CD11b (dia 0)

Nota: Prepare 1 prato de immunopanning para cada cérebro de rato juvenil de 1-2.

1. Adicione 25 mL de solução de Tris pH 9,5 de 50 mM para uma placa de Petri 15 cm.
2. Adicione o anti-rato de cabra IgG (correntes de H + L) para o prato para uma concentração final de 6 µ g/mL. Redemoinho-placa para distribuir uniformemente.
3. Incubar o prato para 1-3 h a 37 ° C.
4. Pratos de lavar três vezes com DPBS +⁺ (fosfato salino (PBS) com Ca^{2 +} e Mg^{2 +}), em seguida, substituir com uma solução de tampão contendo 1 µ g/mL OX42 anticorpo de garimpar. Deixe os pratos durante a noite em temperatura ambiente sobre uma superfície plana.

2. tecido coleção (dia 1)

Nota: Este protocolo deve tomar ~ 3-4 h.

1. Antes de começar, certifique-se de todas as soluções são estéreis e refrigerados no gelo. Relaxa todos os instrumentos no gelo e esterilizar com etanol antes de usar.
2. Seguintes procedimentos regulamentares adequados, sacrificar um rato de laboratório juvenil por asfixia de dióxido de carbono.
   Nota: Como alternativa, animais mais jovens podem ser sacrificados com uma dose letal de cetamina/xilazina (100-200 µ l de 24mg/mL cetamina, xilazina 2,4 mg/mL). Xilazina/cetamina deve ser usada se os animais são menos de 14 dias de idade. Se usar vários animais, extrair o tecido de um animal e colocá-lo em pre-refrigerados DPBS +⁺ no gelo antes de prosseguir para animais subsequentes.
3. Beliscar um hindpaw e assegurar a completa apatia do animal antes de prosseguir.
4. Transcardially perfundir o animal com 10-30 mL de tampão de perfusão gelada usando uma agulha de 27½-G até o tampão funciona claro.
   Nota: O Volume da reserva de perfusão pode variar dependendo da tamanho/idade do animal.
5. Imediatamente após a perfusão remova a cabeça do animal. Vindo da medula espinhal, corte o côndilo occipital de cada lado com uma tesoura de dissecação, tenha cuidado para não danificar o cérebro. Após o corte cada lado corte cuidadosamente, por um lado, ao longo do parietal e osso frontal para o osso nasal. Com pinça puxe o topo do crânio, rapidamente Retire cuidadosamente o cérebro (ou estruturas de CNS de interesse) e coloque no pre-refrigerados DPBS +⁺ no gelo.
6. Repita para todos os restantes animais.
   Nota: Todas as etapas do processo devem ser realizadas em uma capa de fluxo laminar, sob condições estéreis.

3. mecânica dissociação (dia 1)

1. Depois que todos os cérebros foram recolhidos, cortar um cérebro em pedaços de³ de 1 mm em um prato de Petri no gelo com uma lâmina de bisturi frio e transferir para um homogenizador homogenizacao gelada com 5-7 mL de tampão de douncing gelada. Dissocia um cérebro de cada vez.
2. Dissocia o tecido através de movimentos de suaves e incompletos de 10-20 com um homogeneizador de homogenizacao folgadas. Tome cuidado para não esmagar diretamente o tecido na parte inferior do homogenizador, mas em vez disso, impel o tecido através do espaço entre os lados do pistão e do homogenizador.
3. Remova cuidadosamente o pistão para evitar a introdução de bolhas de ar. Permitir que pedaços de tecido mal dissociada a ajustar-se ao fundo o homogenizador e transferir o sobrenadante para um novo tubo cônico refrigerado 50 mL.
4. Substituir o volume removido com buffer de douncing fresco e repita as etapas de 3.2 e 3.3, para um total de 3-4 rodadas, ou até que todo o tecido tem sido dissociado. Repita o procedimento para cada cérebro.

4. a mielina remoção (dia 1)

Nota: Remoção de mielina é usada para a isolação de micróglia de animais mais velhos que P12.

1. Medir o volume da suspensão celular no tubo cónico de 50 mL com uma pipeta de 25 mL e, em seguida, adicione douncing gelada buffer para ajustar o volume total de 33,5 mL.
2. Adicione 10 mL de tampão de separação de mielina (MSB) para a suspensão de células e misture cuidadosamente o tubo várias vezes por inversão. Isso resultará em uma concentração final de 23% de MSB em um volume de 43,5 mL.
3. Centrifugar as células por 15 min a 500 x g a 4 ° C, com frenagem lenta.
   Nota: A centrífuga deve tomar aproximadamente 1.5-2 min para desacelerar. Isso irá gerar uma camada superior de mielina e restos de células mortas, um sobrenadante um pouco turva e uma menor pelota que é enriquecida por células vivas.
4. Remova a camada superior da mielina/detritos e o sobrenadante com uma pipeta. Tome cuidado ao remover a camada superior para garantir como muito do que é removido quanto possível.
5. Ressuspender as células em 12 mL de tampão de garimpar. Delicadamente, Triture a suspensão de eritrócitos para quebrar qualquer aglomerados de células que possam permanecer.

5. Immunopanning (dia 1)

1. Passe a suspensão de células através de um filtro de célula de 70 µm para remover detritos grandes ou aglomerados de células.
2. Enxague o prato panning revestido OX42 três vezes com DPBS +⁺. Não permitir que a placa completamente seco entre lavagens.
3. Deite fora a última lavagem DPBS +⁺ e aplicar a suspensão de células filtrada para o prato de panning. Suavemente agitar a placa para distribuir as células e, em seguida, incubar a placa sobre uma superfície plana em temperatura ambiente por 20 min permitir que as células a aderir. Não incubar mais do que 20 min ou células se tornará muito difícil recuperar do prato.
4. Enxague o prato panning com DPBS +⁺ 10 vezes para remover as células não-aderentes. Microglia será tão firmemente ligado à placa, agite a placa com cada enxágue para assegurar a remoção de outras células não-aderentes.
5. Deite fora a última lavagem DPBS +⁺ e substitua com 15 mL DPBS +⁺ e 200 tripsina μL (1,25% solução estoque).
6. Incube o prato para ≤ 10 min a 37 ° C, com 10% de CO₂ para trypsinize.
   Nota: Não faça mais do que 10 min ou micróglia se tornará difícil de remover.
7. Após 10 min de tripsinização, microglia ainda vai ser preso à placa. Decantar a tripsina/DPBS +⁺ e lave suavemente 2x com DPBS +⁺ para remover a tripsina, substituir com 12 mL de meio de crescimento microglia gelada (MGM).
8. Garimpando o prato no gelo por 2 min para ajudar a enfraquecer a interação célula/substrato e certifique-se o prato é plana para evitar áreas do prato panning sequem.
9. Pipetar vigorosamente com um 10 mL pipeta e pipeta controlador de alta velocidade para recuperar células do prato panning. Desenhe uma grade de 16 x 16 com o fluxo do líquido da pipeta para tentar remover todas as células.
10. Verifique as células sob um microscópio ampliação de 20 X para certificar-se de células têm separada da placa. Marca pontos em cima do prato onde as células ainda estão presos e repetição de pipetagem nessas áreas.
11. Recolha a suspensão de células e alíquota 3-4 mL do sobrenadante por tubo cônico de 15 mL. Rotação por 15 min a 500 x g a 4 ° C, com frenagem lenta.
    Nota: Microglia através de um pequeno volume de giro permite a máxima recuperação das células.
12. Aspire o sobrenadante, deixando 0,5 mL da MGM com o centrifugado.
13. Cada Ressuspender em MGM restante e as células de todos os tubos da piscina.
14. Contar as células com hemocytometer.
15. Células de placa conforme descrito nos passos 6 - 7, dependendo da aplicação.
16. Células de cultura a 37 ° C, com 10% de CO₂.
    Nota: As células podem ser cultura para até 3-4 semanas com mudanças regulares de mídia ou uma semana sem alterações de mídia.

6. lugar revestimento placas de cultura de tecidos/lamelas (dia 1)

1. Placa de 15 µ l de revestimento de colagénio IV directamente no centro de uma placa de cultura de tecido revestido 24-bem aniônicos catiônicos (consulte Tabela de materiais para obter detalhes) e incube por 15 min a 37 ° C, com 10% de CO₂.
2. Depois de contar células com hemocytometer dilua as células para 2.3 x 10⁵/mL, no MGM. Aspire o colagénio IV spot e imediatamente placa 15 µ l de suspensão de células para este ponto; Isto dará 3.5 x 10³ células/spot. Incube durante 5-10 min a 37 ° C, com 10% de CO₂ para permitir que as células aderem, adicionar 500 µ l de CO_{2 -}equilibrado meio de crescimento TGF-β2/IL-34/colesterol contendo (TIC) suavemente para o poço.
3. Se chapeamento em lamelas, primeiro casaco lamelas de vidro estéril com 10 µ g/mL estratagema-D-lisina (PDL) em H₂O por 1h no RT, lavar 3 vezes com H₂O e deixe secar em um capuz sob luz UV. Uma vez que as lamelas são secas, prossiga com chapeamento local sobre as lamelas conforme descrito no passo 6.2.

7. chapeamento para isolamento de RNA/proteína

1. No dia 1, casaco, toda a área de uma 24-bem aniônicos/catiônica revestido com placa de cultura de tecido com revestimento de colágeno IV e incubar por 10 min - 1 h a 37 ° C, com 10% de CO₂, retire e imediatamente placa 3-5 x 10⁴ células/poço em CO₂ incubado Mídia TIC.
2. No dia 2, realizar uma alteração de mídia de 50% para cada um bem no dia após o preparo. Células mortas tendem a cluster no centro do poço, então assumo o mídia.
3. Realizar uma alteração de mídia de 50% a cada 2-3 dias para manter as culturas. Se alterações mídia introduzirem uma variável indesejada para as culturas, as células podem sobreviver por cerca de 1 semana sem qualquer alteração de mídia, em oposição a mais de 3 semanas com uma manutenção regular.

Resultados

Este protocolo descreve um método de cultura alta pureza ramificada microglia de ratos jovens. Resultados semelhantes podem ser obtidos usando animais imaturos, perinatais e adultos, como discutido abaixo. Desde que os isolamentos de célula frequentemente incluem nuances sutis e muitas oportunidades para as células a morrer, usamos pontos de verificação de controle de qualidade para ajudar a determinar o sucesso em várias etapas. Nós normalmente monitorados suspensões celulares usando um ...

Discussão

Porque microglia servem como as células imunes Sentinela do SNC, eles são altamente sensíveis às mudanças ambientais; Portanto, muito cuidado é necessário para minimizar as respostas inflamatórias dentro das células durante seu isolamento e cultura⁸. Isso é feito no presente protocolo através de velocidade e temperatura. Sempre que possível reduz a ativação, para que todas as etapas de centrifugação ocorrem a 4 ° C, mantendo as células no gelo ou a 4 ° C, os animais são pintados com buffer de perf...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Rato: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
camundongo anti-rato CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1.000; Coloração: 1:500
Cabra policolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Coloração: 1:500
Coelho policlonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Coloração: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Coloração: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-cabra 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Coloração: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Coloração: 1:500
Triton-X (detergente na coloração ICC)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfato	Galen Suprimentos de Laboratório Cat	# GAG-HS01
Heparina	Sigma	Cat# M3149
Peptona de sólidos do leite	Sigma	Cat# P6838
TGF-β 2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R& D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Colesterol de lã ovina	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Colágeno IV	Corning	Cat# 354233
Ácido oleico	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calceína AM corante	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Tripsina	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicilina/ Estreptomicina	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamina	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetilcisteína	Sigma	Cat# A9165
Insulina	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrina	Sigma	Cat# T1147
Selenito de sódio	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (glicose alta)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poli-D-lisina	Placas Primaria Sigma	Cat# A-003-E
	VWR	Cat# 62406-456
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Reagentes de stock
Apo-transferrin			Reconstituição: 10 mg/mL em PBS Concentração utilizada: 1:100 Armazenamento: -20° C
N-acetilcisteína			Reconstituição: 5 mg/mL em H2O Concentração utilizada: 1:1.000 Armazenamento: -20° C
Reconstituição do selenito			: 2,5 mg/mL em H2O Concentração utilizada: 1:25,000 Armazenamento: -20° C
Reconstituição do Colágeno IV			: 200 μ g/mL em PBS Concentração usada: 1:100 Armazenamento: -80° C
TGF-b2			Reconstituição: 2 mg/mL em PBS Concentração utilizada: 1:1.000 Armazenamento: -20° C
IL-34			Reconstituição: 200 μ g/mL em PBS Concentração usada: 1:1.000 Armazenamento: -80° C
		de lã ovina	Reconstituição: 1,5 mg/mL em etanol 100% Concentração utilizada: 1:1,000 Armazenamento: -20° C
		de heparano	Reconstituição: 1 mg/mL em H2O Concentração utilizada: 1:1.000 Armazenamento: -20° C
Ácido oleico/ácido			Reconstituição: Gondóico: 0,001 mg/mL; Oleico: 0,1 mg/mL em 100% de etanol Concentração usada: 1:1.000 Armazenamento: -20° C
Reconstituição da heparina			: 50 mg/mL em PBS Concentração utilizada: 1:100 Armazenamento: -20° C
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Solutions  Receita de
		perfusão	: 50 μ g/mL de heparina em DPBS++ (PBS com Ca++ e Mg+) Comentários: Use quando gelado
Receita de tampão			: 200 μ L de 0,4% DNaseI em 50 mL de DPBS++ Comentários: Use quando estiver gelado
Receita de tampão			: 2 mg/mL de peptona de sólidos do leite em DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Receita: DMEM/F12 contendo 100 unidades/mL de penicilina, 100 μ g/mL de estreptomicina, 2 mM de glutamina, 5 μ g/mL de N-acetilcisteína, 5 μ g/mL de insulina, 100 μ g/mL de apo-transferrina e 100 ng/mL de selenito de sódio Comentários: Use MGM gelado para retirar a microglia do prato de immnopanning.
Receita de revestimento			: MGM contendo 2 μ g / mL de colágeno IV
Receita de tampão			: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS sem Ca ++ e Mg ++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 μ L 1 M MgCl2 Comentários: Misture bem após a adição de  CaCl2 e MgCl2
TGF-b2/IL-34/Meios de crescimento contendo colesterol (TIC)			Receita: MGM contendo 2 ng/mL de TGF-b2 humano, 100 ng/mL de IL-34 murino, 1,5 μ g/mL de colesterol de lã ovina, 10 μ g / mL de sulfato de heparano, 0,1 μ g/ml de ácido oleico e 0,001 μ g/ml de ácido gondóico Comentários: Certifique-se de adicionar colesterol ao meio aquecido a 37 ° C e não adicione mais de 1,5 μ g/mL ou precipitará. Não filtre meios que contenham colesterol. Equilibre o meio TIC com 10% de CO2 por 30 min- 1 hora antes de adicionar às células para garantir o pH ideal.

de sódioColesterol Sulfato gondóico tampão de de doucamento panorâmico de colágeno IV de separação de mielina