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Chemistry

सीटू के क्रिस्टल एक्स-रे विवर्तन में और सीरियल क्रि के लिए सीटू डायनामिक लाइट कैटरिंग में Microfluidic चिप्स

Published: April 24, 2018 doi: 10.3791/57133
Automatic Translation
*1,2, *3,4,5, 3, 6, 6, 3,4, 3,4,5, 1,2,4, 1,7
1Center for Free Electron Laser Science, DESY, 2Department of Physics, University of Hamburg, 3Institute for Biochemistry and Molecular Biology, Laboratory for Structural Biology of Infection and Inflammation, University of Hamburg, 4The Hamburg Center for Ultrafast Imaging, University of Hamburg, 5Integrated Biology Infrastructure Life-Science Facility at the European XFEL (XBI), 6European Molecular Biology Laboratory, EMBL c/o DESY, 7Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल विस्तार से वर्णन कैसे बनाना है और कमरे के तापमान पर एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह के लिए microfluidic उपकरणों का संचालन । इसके अतिरिक्त, यह गतिशील प्रकाश बिखरने और कैसे प्रक्रिया और विश्लेषण प्राप्त विवर्तन डेटा द्वारा प्रोटीन क्रिस्टलीकरण की निगरानी करने के लिए कैसे का वर्णन करता है ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल कम एक्स-रे पृष्ठभूमि के साथ microfluidic उपकरणों के निर्माण का वर्णन goniometer के लिए अनुकूलित निर्धारित लक्ष्य धारावाहिक क्रि आधारित है । उपकरणों के नरम लिथोग्राफी का उपयोग कर epoxy गोंद से नमूनों और कमरे के तापमान पर सीटू एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों में के लिए उपयुक्त हैं । नमूना कुओं बहुलक polyimide पंनी खिड़कियां है कि कम एक्स-रे पृष्ठभूमि के साथ विवर्तन डेटा संग्रह की अनुमति के साथ दोनों पक्षों पर lidded हैं । इस निर्माण विधि इनपर और सस्ती है । एक एसयू-8 मास्टर वेफर की सोर्सिंग के बाद, सभी निर्माण एक ठेठ अनुसंधान प्रयोगशाला वातावरण में एक cleanroom के बाहर पूरा किया जा सकता है । चिप डिजाइन और निर्माण प्रोटोकॉल केशिका valving का उपयोग करने के लिए परिभाषित nanoliter आकार बूंदों में एक जलीय प्रतिक्रिया विभाजित microfluidically । इस लोडिंग तंत्र चैनल मृत मात्रा से नमूना नुकसान से बचा जाता है और आसानी से पंप या द्रव actuation के लिए अंय उपकरणों का उपयोग कर के बिना मैंयुअल रूप से किया जा सकता है । हम वर्णन कैसे पृथक nanoliter प्रोटीन समाधान के आकार बूंदों सीटू में गतिशील प्रकाश कैटरिंग द्वारा प्रोटीन क्रिस्टल nucleation और विकास को नियंत्रित करने के लिए निगरानी की जा सकती है । उपयुक्त क्रिस्टल बड़े हो रहे हैं के बाद, पूरा एक्स-रे विवर्तन डेटासेट कमरे के तापमान पर सीटू तय लक्ष्य सीरियल एक्स-रे क्रि में आधारित goniometer का उपयोग कर एकत्र किया जा सकता है. प्रोटोकॉल को हल करने और प्रोटीन क्रिस्टल संरचना को परिष्कृत करने के लिए सॉफ्टवेयर उपकरण का एक सूट का उपयोग विवर्तन डेटासेट प्रक्रिया करने के लिए कस्टम लिपियों प्रदान करता है । इस दृष्टिकोण संभवतः क्रायो के दौरान प्रेरित कलाकृतियों संरक्षण या मैनुअल पारंपरिक क्रि प्रयोगों में क्रिस्टल हैंडलिंग से बचा जाता है । हम वर्तमान और तीन प्रोटीन संरचनाओं कि लगभग 10-20 चिप में उगाया µm के आयामों के साथ छोटे क्रिस्टल का उपयोग कर हल कर रहे थे तुलना करें । सीटू मेंसघन और diffracting द्वारा, हैंडलिंग और इसलिए नाजुक क्रिस्टल के यांत्रिक गड़बड़ी कम है । प्रोटोकॉल विवरण कैसे एक कस्टम एक्स-रे पारदर्शी microfluidic चिप के लिए उपयुक्त बनाना करने के लिए सीटू धारावाहिक क्रि में । के रूप में लगभग हर क्रिस्टल विवर्तन डेटा संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इन microfluidic चिप्स एक बहुत ही कुशल क्रिस्टल वितरण पद्धति हैं ।

Introduction

एक प्रोटीन की 3d संरचना जानने के लिए अपनी कार्यक्षमता को समझने के लिए आवश्यक है । पास-परमाणु संकल्प संरचनाओं अब तक सबसे अधिक एक्स-रे क्रि द्वारा प्राप्त कर रहे हैं । इस तकनीक का एक्स-रे विकिरण के लिए प्रोटीन क्रिस्टल का पर्दाफाश और जिसके परिणामस्वरूप विवर्तन पैटर्न तो संरचना निर्धारण और शोधन के लिए विश्लेषण कर रहे हैं । पारंपरिक एक्स-रे क्रि में, एक पूर्ण विवर्तन डेटासेट एक एकल, आदर्श बड़े, क्रायोजेनिक तापमान पर क्रिस्टल से दर्ज किया गया है । इस तरह के क्रिस्टल, तथापि, ज्यादातर तुच्छ नहीं हो जाना, और उपयुक्त क्रायो-संरक्षण की स्थिति की पहचान के लिए अपने आप में चुनौतीपूर्ण हो सकता है और कई बार देशी प्रोटीन संरचना से भी विचलन का कारण हो सकता है5.

एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर (FEL) और सिंक्रोट्रॉन beamlines में हाल ही में तकनीकी विकास के छोटे क्रिस्टल से संरचनाओं को हल करने की अनुमति दी है, के रूप में नए सूक्ष्म beamlines ध्यान केंद्रित, एक्स-रे बीम प्रतिभा में वृद्धि हुई है, और बेहतर एक्स-रे डिटेक्टरों बन गया उपलब्ध6,7. आमतौर पर, छोटे क्रिस्टल बड़े और दोष मुक्त क्रिस्टल8,9से बढ़ने के लिए आसान कर रहे हैं । हालांकि, छोटे क्रिस्टल बहुत तेजी से बड़े क्रिस्टल से एक्स-रे विकिरण नुकसान से ग्रस्त हैं । यह है क्योंकि एक बड़े क्रिस्टल की तुलना में, एक उच्च एक्स-रे खुराक एक छोटे क्रिस्टल मात्रा में पेश किया जाना चाहिए तुलनीय संकल्प को diffract. इसलिए, भी क्रायोजेनिक सुरक्षा अक्सर एक पूर्ण विवर्तन डेटा एक एकल microcrystal से सेट रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त नहीं है ।

इस बाधा को दूर करने के लिए, सीरियल क्रि एक पूर्ण डेटासेट प्राप्त करने के लिए कई बेतरतीब ढंग से उन्मुख microcrystals से विवर्तन पैटर्न इकट्ठा करने और विलय करने के लिए विकल्प की विधि बन गया है. विकिरण प्रेरित क्रिस्टल क्षति कुल एक्स-रे के लिए क्रिस्टल की एक उच्च संख्या में एक प्रोटीन संरचना को हल करने के लिए इस्तेमाल किया खुराक5,10फैलाने से कम है । FEL प्रयोग को नष्ट करने से पहले एक ' diffract में, प्रत्येक क्रिस्टल केवल femto-दूसरा एक्स-रे दालों का उपयोग कर एक जोखिम के लिए प्रयोग किया जाता है । माइक्रो-फोकस beamlines में तीसरी पीढ़ी सिंक्रोट्रॉन सूत्रों के बदले में कुछ मिलीसेकंड लघु एक्स-रे जोखिम11,12,13,14के साथ धारावाहिक क्रि प्रदर्शन कर सकते हैं । एक क्रिस्टल दोलन या डेटा संग्रह के दौरान रोटेशन के बिना, तथापि, केवल आंशिक डींग प्रतिबिंब और दर्ज किया जा सकता है इसलिए हजारों या अधिक विवर्तन पैटर्न के दसियों आम तौर पर संरचना निर्धारण15के लिए आवश्यक हैं । तारीख करने के लिए, नमूना वितरण विधियों के एक विविध सेट सीरियल क्रि के लिए विकसित किया गया है, के रूप में हाल ही में14,16,17,18,19की समीक्षा की । उन लोगों के बीच में, कई निश्चित-लक्ष्य आधारित नमूना वितरण रणनीतियों सफलतापूर्वक एक्स के दौरान क्रिस्टल रोटेशन के साथ संयुक्त-रे जोखिम इस तरह के काफी कम विवर्तन पैटर्न समान रूप से पूरा डेटासेट प्रदान कर सकते हैं, जबकि भी कम खपत नमूना शास्त्रीय धारावाहिक क्रि प्रयोगों की तुलना में जहां अभी भी छवियों दर्ज कर रहे हैं7,16,20,21,22,23 , 24.

हम कम एक्स-रे पृष्ठभूमि के साथ microfluidic उपकरणों के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । उपकरणों 5-ंयूनतम epoxy गोंद से नरम लिथोग्राफी का उपयोग कर नमूनों रहे है और के लिए उपयुक्त है -सीटू एक्स-रे कमरे के तापमान पर विवर्तन प्रयोगों है कि सीधे एक्स-रे सेट अप में नमूना तैयारी को एकीकृत करने से लाभ, के रूप में मामले के साथ समय-हल अध्ययन है कि मिश्रण प्रेरित कैनेटीक्स18,19का पालन करें । Microfluidic चैनल के बारे में 16 µm कि कम एक्स-रे पृष्ठभूमि इमेजिंग के लिए अनुमति के एक संयुक्त मोटाई के साथ एक्स-रे खिड़कियों में जिसके परिणामस्वरूप, बहुलक polyimide पंनी के साथ दोनों पक्षों पर lidded हैं । सभी प्रयुक्त सामग्री अच्छा विलायक प्रतिरोध प्रदान करते हैं । इस निर्माण विधि तुलनात्मक सरल और सस्ती है । एक एसयू-8 मास्टर वेफर की सोर्सिंग के बाद, सभी निर्माण एक ठेठ अनुसंधान प्रयोगशाला की स्थापना में एक cleanroom के बाहर पूरा किया जा सकता है ।

एक आवेदन उदाहरण में, हम goniometer आधारित निश्चित लक्ष्य धारावाहिक क्रि के लिए चिप्स का वर्णन । सबसे पहले, nanoliter आकार की बूंदों की एक चयनित संख्या में एक जलीय प्रतिक्रिया विभाजित microfluidically करने के लिए केशिका valving का उपयोग करने के लिए डिजाइन और निर्माण विचार चर्चा की जाती है । इस लदान तंत्र चैनल मृत से नमूना हानि से बचा जाता है मात्रा और विभाजन आसानी से मैंयुअल रूप से पंप या द्रव actuation के लिए अंय उपकरणों का उपयोग कर के बिना किया जा सकता है । प्रोटीन सॉल्यूशन की ऐसी पृथक nanoliter आकार की बूंदों को प्रोटीन क्रिस्टल nucleation और विकास को नियंत्रित करने के लिए डायनामिक लाइट कैटरिंग (DLS) का उपयोग करते हुए सीटू में मॉनिटर कर रहे हैं । यह पहले से प्रदर्शित किया गया है कि DLS माप microfluidic उपकरणों में एक polydimethylsiloxane (PDMS) एक गिलास स्लाइड25,26के लिए बंधुआ संरचना से मिलकर किया जा सकता है । polyimide परत ५५० एनएम से अधिक तरंग दैर्ध्य के लिए एक उच्च संचरण है क्योंकि, दृष्टिकोण एक उपयुक्त लेजर तरंग दैर्ध्य27,28का उपयोग करते समय के रूप में अच्छी तरह से, एक्स-रे पारदर्शी चिप्स में माप करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । DLS परिणामों के आधार पर, प्रारंभिक nucleation मनाया जा सकता है, और आगे छोटी बूंद वाष्पीकरण कम लेकिन बड़ा प्रोटीन क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए रोका जा सकता है ।

पर्याप्त क्रिस्टल बड़े हो रहे हैं के बाद, पूरा एक्स-रे विवर्तन डेटासेट तो कमरे के तापमान पर सीटू तय लक्ष्य सीरियल एक्स-रे क्रि में आधारित goniometer का उपयोग कर एकत्र किया जा सकता है. विवर्तन डेटासेट प्रोटीन क्रिस्टल संरचना को हल करने के लिए सॉफ्टवेयर उपकरण और कस्टम लिपियों के एक सुइट का उपयोग कर संसाधित कर रहे हैं । इस तकनीक अक्सर क्रायो-पारंपरिक क्रि प्रयोगों में इस्तेमाल संरक्षण के दौरान प्रेरित कलाकृतियों से बचा जाता है ।

हम तीन प्रोटीन लक्ष्य संरचनाओं कि के बारे में 10-20 µm छोटे चिप में विकसित करने के लिए बेहतर तो 2 Å संकल्प क्रिस्टल का उपयोग कर हल थे तुलना करें । सीटू मेंसघन और diffracting द्वारा, हैंडलिंग और इसलिए नाजुक क्रिस्टल के यांत्रिक गड़बड़ी कम है । इस प्रोटोकॉल प्रोटीन क्रिस्टल जो उच्च संकल्प के साथ ही कम संकल्प (१.७ å करने के लिए ३.० å) diffract के लिए लागू किया जा सकता है । के रूप में लगभग हर क्रिस्टल विवर्तन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, थोड़ा नमूना व्यर्थ है, यह एक बहुत ही कुशल क्रिस्टल वितरण विधि बना ।

यह प्रोटोकॉल कैसे सीटू प्रोटीन क्रिस्टलीकरण और विवर्तन डेटा संग्रह में के लिए एक्स-रे पारदर्शी microfluidic चिप्स तैयार करने के लिए पर एक विस्तृत गाइड प्रदान करता है । प्रक्रिया ध्यान से प्रयोगशाला में परिष्कृत उपकरणों की आवश्यकता के बिना microfluidic परिशुद्धता से लाभ के लिए डिज़ाइन किया गया था । इसके अलावा, सिंक्रोट्रॉन beamline पर डेटा संग्रह एक विशेष goniometer या humidifier गैर विशेषज्ञों द्वारा परिणाम reproducing आसानी के लिए आवश्यकता के बिना किया जा सकता है । प्रस्तुत तकनीक के कमरे में धारावाहिक मिलीसेकंड क्रि डेटा संग्रह के लिए लागू किया जा सकता है, जबकि विकिरण नुकसान कम रखते हुए और क्रायो-सुरक्षा या क्रिस्टल हैंडलिंग द्वारा विकास के बाद क्रिस्टल को तनाव शुरू करने के बिना तापमान । इसलिए, वर्णित विधि किसी भी प्रोटीन क्रिस्टलीकरण परियोजना के लिए उपयुक्त है ।

Protocol

1. चिप डिजाइन और मास्टर निर्माण

  1. मुखौटा डिजाइन
    1. रूपरेखा वांछित चैनल geometries एक उपयुक्त सीएडी ड्राइंग कार्यक्रम का उपयोग कर । प्रत्येक photoresist परत के लिए, एक व्यक्ति मुखौटा तैयार करते हैं । इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सभी डिजाइनों के परिणाम अनुभाग में विस्तार से चर्चा कर रहे है और ' AutoCad के रूप में उपलब्ध हैं । अनुपूरक फ़ाइल 1में ' DWG प्रारूप ।
      नोट: सभी-PDMS डिवाइस बनाने के लिए, चैनल की ऊंचाई-से-चौड़ाई पहलू अनुपात चैनल ढहने को रोकने के लिए 1:10 से अधिक नहीं होना चाहिए. दोनों polyimide पंनी और ठीक epoxy राल मजबूत है और सिद्धांत में भी उच्च पहलू अनुपात की अनुमति चाहिए । हालांकि, हम जानबूझकर 1:10 अनुपात से अधिक नहीं था, ताकि प्रारंभिक डिजाइन पारंपरिक PDMS उपकरणों के रूप में प्रोटोटाइप किया जा सकता है ।
    2. सीएडी-फ़ाइलों में पायस फिल्म photomasks का अनुवाद करें । सटीक सुविधाओं के बारे में 5 µm आकार करने के लिए नीचे की अनुमति दें करने के लिए कोई नाममात्र 64 k DPI रिज़ॉल्यूशन का उपयोग करें ।
      नोट: यह एक व्यावसायिक सेवा के माध्यम से किया जा सकता है । इमेजिंग सेवाएं मास्क इमेजिंग के लिए फ़ाइल कनवर्ज़न को सरल बनाने के लिए विभिंन आरेखण सम्मेलनों को प्राथमिकता दे सकती हैं । कृपया रूपांतरण के दौरान श्रमसाध्य मुसीबत शूटिंग से बचने के लिए अग्रिम पसंदीदा ड्राइंग सम्मेलनों के बारे में पूछताछ । काली पृष्ठभूमि पर पारदर्शी सुविधाओं के साथ मास्क पैटर्न SU8 photoresist सुविधाओं वेफर पर प्रतिकृति ढलाई के दौरान कार्यात्मक PDMS microchannels उपज होगा । बदले में, पारदर्शी पृष्ठभूमि मास्क पर काले सुविधाओं PDMS molds एक्स-रे चिप निर्माण के लिए उपयुक्त तैयार करने की जरूरत है । हम दोनों मुखौटा ध्रुवीय आदेश के लिए जल्दी प्रोटोटाइप और डिजाइन सत्यापन के लिए अनुमति देने के लिए एक्स-रे चिप्स में डिजाइन अनुवाद से पहले PDMS उपकरणों बनाना सलाह देते हैं ।
  2. SU8 मास्टर निर्माण
    नोट: यह एक cleanroom में किया जा करने की आवश्यकता है कि केवल प्रक्रिया है । यदि महत्वपूर्ण cleanroom उपकरण उपलब्ध नहीं है, पूरा कदम एमईएमएस फाउंड्री सेवा कंपनियों है कि तैयार नमूनों SU8 परास्नातक उद्धार करने के लिए आउटसोर्स किया जा सकता है । डेटा पत्रक अनुदेश के अनुसार प्रक्रिया SU8 । 1.2.4 करने के लिए 1.2.1 चरण सामान्य SU8 मास्टर निर्माण कार्यप्रवाह, तीन परत एक्स-रे चिप डिजाइन तालिका 1में सूचीबद्ध के लिए पूर्ण पैरामीटर के साथ । बहु परत SU8 संरेखण के लिए एक परिचय पहले29प्रकाशित किया गया है ।
    1. SU8 के बारे में 1 मिलीलीटर डालो 3 इंच वेफर और स्पिन कोट पर SU8 इच्छित उचित स्पिन गति और समय का उपयोग कर के रूप में तालिका 1 में निर्दिष्ट मोटाई के लिए नीचे (चित्रा 1, चरण 1) । पूर्व सेंकना photoresist परत मोटाई के अनुसार ६५ ° c और ९५ डिग्री सेल्सियस पर एक कुछ मिनट के लिए प्रत्येक । पूर्व सेंकना करने के लिए SU8 जमना को रोकने के लिए यह photomask से चिपके हुए और सब्सट्रेट करने के लिए आसंजन का विरोध में सुधार करने के लिए (चित्रा 1, चरण 2) ।
    2. photoresist यूवी प्रकाश को बेनकाब के रूप में तालिका 1 में निर्दिष्ट के बाद एक पोस्ट-जोखिम सेंकना द्वारा ९५ डिग्री सेल्सियस पर) उत्प्रेरक photoreaction कि जोखिम के दौरान शुरू की है पूरा करने के लिए (चित्रा 1, चरण 3) ।
    3. प्रत्येक अनुवर्ती परत के लिए इन चरणों को दोहराएँ. फिर एक मुखौटा संरेखण और Vernier कैलिपर संरेखण29का उपयोग कर मास्टर के साथ अनुवर्ती परत के photomasks संरेखित करें ।
    4. दूर धो सभी उजागर SU8 propylene ग्लाइकोल मिथाइल ईथर एसीटेट (PGMEA) में वेफर विकसित करके विरोध, जब तक isopropanol धोने अब दूधिया वर्षा (चित्रा 1, चरण 4) पता चलता है । दबाव नाइट्रोजन के साथ वेफर सूखी ।
      नोट: Isopropanol SU8 के लिए एक गरीब विलायक है और इसकी वर्षा अवशिष्ट अवशेष है इंगित करता है ।
  3. PDMS मोल्ड निर्माण
    1. एल्यूमीनियम पंनी का एक टुकड़ा प्लेस (15 × 15 सेमी) एक पेट्री डिश में (10 सेमी) और PDMS इलाज के बाद मास्टर की आसान हटाने के लिए पेट्री डिश में एल्यूमीनियम पंनी पर SU8 गुरु जगह है ।
    2. मिक्स सिलिकॉन बेस इलाज एजेंट के साथ (10:1), 25 जी की कुल राशि में जिसके परिणामस्वरूप, एक जार या एक यांत्रिक मिक्सर में एक रंग के साथ जोरदार. एक पेट्री डिश में 3 इंच वेफर (10 सेमी) एक 5 मिमी मोटी स्लैब में परिणाम के लिए PDMS के बारे में 25 ग्राम की खपत ।
    3. SU8-मास्टर पर पूर्व मिश्रित PDMS डालो (चित्रा 1, चरण 5) 4 मिमी Desiccate की ऊंचाई के लिए 5 मिनट के लिए PDMS हवा-बुलबुले को दूर करने के लिए नहीं, या केवल कुछ बुलबुले PDMS सतह पर रहते हैं ।
    4. 1 एच के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में PDMS इलाज फिर एक स्केलपेल के साथ ठीक PDMS काट और धीरे SU8 मास्टर से PDMS मोल्ड छील (चित्रा 1, 6 कदम) । सभी तरह काट मास्टर को नीचे छीलने के दौरान PDMS दरारें रोकने के लिए ।
    5. वैकल्पिक: मास्टर पर सभी SU8-परतों वांछित मोटाई (चित्रा 1) है कि पुष्टि करने के लिए PDMS मोल्ड के क्रॉस-अनुभागीय स्लाइस तैयार करें । अर्ली microfluidic चैनल लेआउट परीक्षण सभी PDMS चिप्स में किया जा सकता है ।
      नोट: एक प्रतिकृति-ढाला PDMS का उपयोग बंदरगाहों छिद्रण के बाद सीधे एक ग्लास सब्सट्रेट करने के लिए बंधुआ किया जा सकता है (चरण ३.३) PDMS में o2 प्लाज्मा सक्रियण के माध्यम से 20 एस, ०.४ mbar ओ2, ५० W, १३.५६ मेगाहर्ट्ज । के रूप में १.२ धारा में उल्लेख किया., यह एक्स-रे चिप निर्माण के लिए विपरीत मुखौटा ध्रुवीकरण और इसलिए वेफर रूपरेखा की आवश्यकता है ।

2. सीटू में एक्स-रे चिप निर्माण

  1. ४० wt% की एक अंतिम इथेनॉल एकाग्रता के लिए इथेनॉल में दोनों epoxy राल पुरोगामी पतला । इथेनॉल में प्रत्येक epoxy राल अग्रदूत की ०.२५ जी की कुल द्रव्यमान एक के लिए पर्याप्त है 1 cm2 चिप ।
    नोट: यह बुलबुला मुक्त मिश्रण और प्रतिकृति-मोल्ड कास्टिंग को सरल करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप 5 मिनट epoxy की चिपचिपाहट कम कर देता है, और अंतिम ठीक epoxy परत की मोटाई को कम करने के लिए । इथेनॉल इलाज कदम के दौरान PDMS के माध्यम से लुप्त हो जाती है ।
  2. Degas 30 मिनट के लिए एक निर्वात desiccator में PDMS मोल्ड है, ताकि यह ढलाई कदम के दौरान epoxy राल से छोटे हवा के बुलबुले को अवशोषित कर सकते हैं ।
  3. के बारे में ७० × ७० mm polyimide पंनी कट और यह एक ७५ × ५० mm ग्लास टेप का उपयोग कर स्लाइड के आसपास अवधि के लिए पीठ पर टेप के साथ एक फ्लैट और कठोर सतह प्राप्त करते हैं । प्लाज्मा ५० डब्ल्यू के साथ पंनी को सक्रिय करें, १३.५६ मेगाहर्ट्ज, ०.४ mbar ओ 20 एस के लिए2 प्लाज्मा, तो पूरा पन्ना-1 vol% (3-aminopropyl) trimethoxysilane (APTS) या (3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GPTS) के एक जलीय समाधान में स्लाइड 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ।
  4. अच्छी तरह से मिश्रण दोनों इथेनॉल epoxy अग्रदूत समाधान पतला इष्टतम इलाज व्यवहार सुनिश्चित करने के लिए । वैक्यूम चैंबर से PDMS-molds पुनः प्राप्त करने और उंहें एक सपाट सतह पर जगह है । तो जल्दी से मोल्ड पर प्रत्येक microstructure पर मिश्रित राल की एक छोटी बूंद एक micropipette का उपयोग कर वितरण (के बारे में 10 µ एल microstructures के 1 सेमी2 प्रति) (चित्रा 1, कदम 7a) ।
  5. जलीय silane (APTS या GTPS) समाधान से polyimide पंनी स्लाइड सैंडविच पुनः प्राप्त करें । दबाव हवा या नाइट्रोजन के साथ पंनी सूखी ।
  6. तैयार polyimide पन्नी-ग्लास स्लाइड सैंडविच जमा epoxy राल पर प्लेस (चित्रा 1, step 7b) । मजबूती से ग्लास स्लाइड PDMS मोल्ड के खिलाफ polyimide पंनी से जुड़ी प्रेस । ग्लास स्लाइड पर एक धातु शीट प्लेस और फिर जमा वजन 1 एच के लिए १.४ N/cm2 दबाव को लागू करने के लिए, जबकि कमरे के तापमान पर epoxy राल इलाज ।
    नोट: आदर्श रूप में, कोई राल क्षेत्रों में पंनी पर रहता है, जहां मोल्ड में संरचनाओं अधिक से अधिक ऊंचाई है । ये क्रिस्टलीकरण कुओं जहां क्रिस्टलीकरण बाद में जगह लेता है के अनुरूप है ।
    1. वैकल्पिक: यदि छोटे सुविधाओं के सटीक मोल्डिंग महत्वपूर्ण है, PDMS मोल्ड ढलाई चरण31के दौरान एक एल्यूमीनियम फ्रेम के साथ प्रबलित किया जा सकता है ।
  7. polyimide पंनी और PDMS मोल्ड से यह छीलने द्वारा नमूनों epoxy के साथ कांच स्लाइड निकालें (चित्रा 1 8 कदम) । प्लाज्मा ५० डब्ल्यू, १३.५६ मेगाहर्ट्ज, ०.४ mbar हे2 प्लाज्मा के लिए 20 एस के साथ patterned epoxy पक्ष को सक्रिय करें
  8. प्लाज्मा चैंबर से polyimide पंनी को हटाने के बाद, एक 1 vol% जलीय APTS (या GPTS) 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए समाधान में epoxy पैटर्न पंनी गर्मी । इसी प्रकार, पूरक 1 vol% GPTS (या APTS) silane सक्रियण के साथ एक दूसरे संयुक्त राष्ट्र के नमूनों polyimide पंनी तैयार करते हैं । मशीन के बाद, दबाव हवा के साथ दोनों संरचित और unस्ट्रक्चर्ड पंनी सूखी ।
  9. स्थिति epoxy की ओर एक सपाट सतह पर चेहरा, एक मध्यस्थ के रूप में नीचे पानी की एक बूंद की सतह तनाव का उपयोग करने के लिए पन्नी के कर्लिंग को रोकने के लिए और अधिक से अधिक संकुचन सुनिश्चित करने के लिए । फिर शीर्ष पर दूसरी सक्रिय polyimide पंनी जगह और एक कोने से अपनी उंगली के साथ धीरे लकीर विपरीत करने के लिए उंहें बांड बनाने के लिए और बुलबुले के गठन से बचने के लिए ।

3. तरल पदार्थ वितरण के लिए पहुंच बंदरगाहों

  1. SU8-मास्टर का उपयोग किए बिना 1.3.3 करने के लिए 1.3.1 चरणों के अनुसार एक पेट्री डिश में 4 मिमी मोटी PDMS स्लैब तैयार करें । उचित आकार के PDMS ब्लॉकों में स्लैब काट चिप में सभी प्रवेश बंदरगाहों को कवर करने के लिए, चिप के व्यक्तिगत क्रिस्टलीकरण डिब्बों को कवर किए बिना ।
  2. प्लाज्मा सक्रिय दोनों, चिप और PDMS ब्लॉक में ५० डब्ल्यू, १३.५६ मेगाहर्ट्ज, ०.४ mbar हे2 प्लाज्मा के लिए 20 एस. रासायनिक संबंध के लिए, तो एक 1 vol% जलीय APTS या 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए GPTS समाधान में प्रत्येक भाग गर्मी । दबाव हवा के साथ प्रत्येक भाग सूखी और पंनी चिप पर PDMS स्लैब दबाएं ।
  3. बंधन में सुधार करने के लिए, एक फ्लैट PDMS स्लैब पर चिप जगह है, और यह एक प्लास्टिक की पंनी के साथ कवर, एक स्वच्छ गिलास स्लाइड और एक धातु ब्लॉक के बाद । अंत में, जमा वजन के बारे में 1 एच के लिए १.४ N/
  4. प्रत्येक स्थिति में एक ०.७५ mm बायोप्सी पंच के साथ पंच का उपयोग छेद जहां प्रवेश और आउटलेट बंदरगाहों चिप डिजाइन में चिह्नित और टेप के साथ वापस सील कर रहे हैं । चिप एक बाहरी छेद के व्यास मिलान व्यास के साथ किसी भी ट्यूबिंग के लिए अब सुलभ है (के रूप में ४.२ कदम में विस्तृत) ।

4. भूतल उपचार

  1. fluoro में 9 wt% फ्लोरो शेयर के 1:20 कमजोर पड़ने-विलायक ०.४५ wt% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए तैयार करते हैं । 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में एक फ्रिज में स्टॉक समाधान और कमजोर पड़ने की दुकान ।
  2. एक 1 मिलीलीटर Luer-लॉक सिरिंज में 1:20 फ्लोरो कमजोर पड़ने लोड । एक 27G × 5/8 "सिरिंज को सुई और फिर सुई के लिए एक PTFE टयूबिंग देते हैं ।
  3. एक्स-रे चिप आउटलेट के लिए टयूबिंग कनेक्ट और सभी चैनलों भर रहे हैं जब तक चरण ४.१ में तैयार फ्लोरो काम समाधान सुई ।
  4. एक पतली फिल्म कोटिंग में फ्लोरो जमा करने के लिए सभी विलायक लुप्त हो जाना करने के लिए 5 मिनट के लिए एक १९० डिग्री सेल्सियस गर्म थाली पर नीचे फ्लैट पक्ष के साथ चिप प्लेस ।
    नोट: जब एक नया ज्यामिति का उपयोग कर, जांच अगर चैनल फ्लोरो के साथ इस कोटिंग प्रक्रिया के दौरान भरा गया । यदि हां, तो आगे शेयर समाधान पतला ।

5. प्रोटीन की तैयारी

  1. lyophilized thaumatin तौलना और यह एक बफर ४० मिलीग्राम एमएल-1के अंतिम प्रोटीन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए उचित मात्रा में 2 तालिका में सूचीबद्ध समाधान में भंग ।
  2. Dialyze ग्लूकोज isomerase में सूचीबद्ध बफ़र के विरुद्ध तालिका 2 निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार ।
  3. Schubert एट. अल द्वारा पहले बताए गए अनुसार प्रोटीन thioredoxin तैयार करें । 30.
  4. अंतिम प्रोटीन सांद्रता तालिका 2में संक्षेप में सारांशित गुणांक का उपयोग photometrically सत्यापित करें, सॉफ्टवेयर ProtParam३२द्वारा गणना की ।
  5. ultrapure पानी का उपयोग कर सभी समाधान तैयार है और एक ०.२ µm फिल्टर के साथ उन्हें फिल्टर ।
  6. १६१०० x g पर 15 मिनट के लिए 20 ° c में प्रोटीन समाधान केंद्रापसारक, और क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के लिए supernatant ले लो ।

6. एक्स-रे चिप में प्रोटीन क्रिस्टलीकरण

  1. microfluidic चिप्स में प्रोटीन सघन करने के लिए, प्रोटीन समाधान और precipitant समाधान के बराबर मात्रा में मिलाएं । प्रोटीन एकाग्रता, बफर संरचना और precipitant रचना 2 तालिकामें संक्षेप हैं । एक microfluidic चिप को भरने के लिए लगभग 20 µ एल की कुल मात्रा तैयार करें ।
  2. तुरंत मिश्रण के बाद, एक सिरिंज के माध्यम से चिप के प्रवेश बंदरगाह में समाधान सुई, एक 27G × 5/8 "सुई और PTFE टयूबिंग ०.७५ mm बाहरी व्यास के साथ युग्मित (चरण ४.२ में विस्तृत).
    नोट: धारावाहिक लेआउट के लिए भरने की प्रक्रिया एक fluorinated तेल है, जो सबसे आसान प्रवेश बंदरगाह के माध्यम से क्रिस्टलीकरण समाधान इंजेक्शन से पहले आउटलेट बंदरगाह से fluorinated तेल लदान द्वारा किया जाता है के साथ चिप की भड़काना की आवश्यकता है । सभी लदान कदम एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए लागू सिरिंज दबाव और इसी प्रवाह दर को नियंत्रित करने के लिए निगरानी की जानी चाहिए. "
  3. चिप के बाद भर जाता है, चिप के प्रवेश बंदरगाह में fluorinated तेल इंजेक्शन द्वारा व्यक्तिगत क्रिस्टलीकरण डिब्बों अलग । चिप के सभी प्रवेश और आउटलेट बंदरगाहों अवरुद्ध द्वारा चिप सील । यह एक क्लिप डालने के द्वारा किया जा सकता है ।
    नोट: क्योंकि क्रिस्टलीकरण डिब्बों प्रोटीन/precipitant समाधान द्वारा भर रहे हैं, fluorinated तेल केवल चिप के प्रवेश चैनल भरता है, क्रिस्टलीकरण डिब्बों में समाधान को प्रभावित किए बिना ।
  4. वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण कैनेटीक्स नकल करने के लिए, परिवेश के तापमान और सामान्य वातावरण पर सील चिप जगह polyimide पंनी के माध्यम से पानी के वाष्पीकरण से हटना करने के लिए क्रिस्टलीकरण डिब्बे में छोटी बूंद की अनुमति दें ।
  5. क्रिस्टल गठन के बाद एक खुर्दबीन या DLS माप (7 कदम) के माध्यम से मनाया जाता है, उचित precipitant समाधान में पूरा microfluidic चिप हस्तांतरण, क्रिस्टलीय कुओं से आगे वाष्पीकरण रोकने के लिए जब तक एक्स-रे विवर्तन प्रयोग किया जाता है ।

7. चिप में क्रिस्टलीकरण कुओं में गतिशील प्रकाश बिखरने माप

नोट: DLS माप १०० मेगावाट, ६६० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य और बिखरे हुए प्रकाश का एक लेजर उत्पादन शक्ति के साथ प्रदर्शन किया गया १४२ ° के एक कैटरिंग कोण पर पाया गया । क्योंकि सभी जांच नमूना समाधान जलीय पानी के अपवर्तन सूचकांक (n = १.३३) थे सभी गणना में इस्तेमाल किया गया था ।

  1. microfluidic चिप में SBS स्वरूप प्लेट होल्डर DLS इंस्ट्रूमेंट का उपयोग करके चरण ८.१ में वर्णित एडाप्टर में रखें । डिवाइस में एडाप्टर संमिलित करें ।
  2. ध्यान से microfluidic चिप के एक डिब्बे के अंदर मोटर चालित एक्स का उपयोग करके लेजर ध्यान समायोजित करें-, y-, z-चरण । क्योंकि microfluidic चिप बहुत पतली है, छोटे वेतन वृद्धि चरणों को लागू करने से z-स्तर समायोजित करें ।
    नोट: एक सही समायोजन एक उच्च अवरोधन और परिणामी DLS माप के सहसंबंधी फ़ंक्शन की एक चिकनी पूंछ द्वारा पुष्टि की है । एक अंशांकन फ़ाइल microfluidic चिप में अच्छी तरह से प्रत्येक व्यक्ति क्रिस्टलीकरण की स्थिति से मेल करने के लिए बनाया जा सकता है, समय के साथ कई डिब्बों में स्वचालित DLS माप की अनुमति.
  3. 30 एस के लिए २९३ K पर प्रत्येक DLS माप प्रदर्शन और क्रिस्टलीकरण प्रयोग के अंत तक माप हर 5 मिनट दोहराने.
    नोट: प्रारंभिक nucleation समय और सफल क्रिस्टल गठन समानांतर में DLS माप की त्रिज्या वितरण के द्वारा पीछा किया जा सकता है समांतर में निर्मित DLS प्लेट रीडर के माइक्रोस्कोप के द्वारा पीछा किया जा सकता है ।

8. विवर्तन डेटा संग्रह

  1. एडेप्टर beamline goniometers के लिए
    1. एडाप्टर के लिए प्लेट goniometer स्थिति और crystallographic डेटा संग्रह के दौरान एक्स-रे चिप्स घुमाने के लिए प्रिंट ।
    2. निर्माता द्वारा अनुशंसित के रूप में डिफ़ॉल्ट पैरामीटर सेटिंग्स का उपयोग कर एक शौक ग्रेड 3 डी प्रिंटर पर आधार goniometer के लिए एडेप्टर बनाना.
      नोट: एडेप्टर एक 3d CAD-सिस्टम का उपयोग करके डिज़ाइन किए गए थे और एडाप्टर के समंवय फ़ाइलें ' में अनुलग्न हैं । STL'-पूरक में फ़ाइल स्वरूप ।
    3. डबल पक्षीय टेप का उपयोग कर एडाप्टर के लिए एक्स-रे चिप्स फिक्स ।
  2. सीटू में एक्स-रे क्रि
    1. 10 × 5 µm के एक बीम आकार का उपयोग कर विवर्तन डेटा लीजिए (FWHM of गाऊसी profile) at २९६ K. का उपयोग करें X-किरणों की एक ऊर्जा के साथ १२.८ कीव और एक फ्लक्स के २.२ · 1011 फोटॉनों · एस-1 तनु बीम और रिकॉर्ड विवर्तन एक पिलाटस 6M हाइब्रिड पिक्सेल डिटेक्टर का उपयोग कर पैटर्न में ।
      नोट: thaumatin, ग्लूकोज isomerase या thioredoxin क्रिस्टल युक्त Microfluidic उपकरणों के लिए उपयोग किया जाता है सीटू एक्स-रे crystallographic प्रयोगों में EMBL beamline P14 के पेट्रा III सिंक्रोट्रॉन. उपलब्ध बीम फोकस आकार और प्रवाह अंय एक्स-रे स्रोतों पर अलग हो सकता है । उजागर प्रोटीन क्रिस्टल की संख्या, प्रत्येक क्रिस्टल से दर्ज विवर्तन पैटर्न की संख्या, प्रदर्शन प्रति दोलन कोण रेंज, और जोखिम समय तालिका 3में संक्षेप हैं ।
    2. XDS३३प्रोग्राम का उपयोग करते हुए दो लगातार विवर्तन प्रतिमान की प्रक्रिया सेट करता है । मार स्क्रिप्ट "xds.sh" पूरक में पाया का प्रयोग करें ।
    3. सभी क्रिस्टल से प्रत्येक डेटासेट के लिए HKL फाइल बनाएं और उन्हें सॉफ्टवेयर XSCALE३३का उपयोग करके स्केल करें । xscale के लिए एक इनपुट फ़ाइल बनाने के लिए पूरक में बैश स्क्रिप्ट "xscale.sh" का उपयोग करें ।
      नोट: केवल datasets सहसंबंध गुणांक ९०% से बड़ा है, जो isomorphism की एक उच्च अंश इंगित करता है, स्केल किया जाना चाहिए । रूढ़िवादी कसौटी ‹ मैं/σ (i) › (> 2) उच्चतम रिज़ॉल्यूशन शेल निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए । आणविक प्रतिस्थापन CCP4 सुइट३५ से कार्यक्रम MOLREP३४ का उपयोग कर प्रोटीन डेटा बैंक (PDB) तालिका 3में दिखाया गया है की 3 डी निर्देशांक का उपयोग करके आगे मॉडल निर्माण के लिए चरणों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता.
    4. Refmac5३५,३६ का उपयोग कर isotopically सभी संरचनाओं को परिष्कृत और अंतिम मॉडल के दृश्य निरीक्षण के लिए कूट३७ का उपयोग करें ।
      नोट: विलायक अणुओं काे प्रक्रिया के दौरान स्वचालित रूप से जोड़ दिया जाना चाहिए और रासायनिक रूप से उचित स्थिति की पुष्टि करने के लिए जांच की जानी चाहिए । रामचंद्रन outliers की पहचान के लिए सभी मॉडलों का निरीक्षण करना होगा ।

9. डाटा मूल्यांकन

  1. विकिरण क्षति
    1. समय पर विवर्तन शक्ति के क्षय का विश्लेषण एक ओवेन एट अल३८द्वारा वर्णित विधि का उपयोग कर । इसके लिए, i/σ के कुल योग की गणना (i) (XDS३३द्वारा प्रदत्त) प्रत्येक मूल्यांकित विवर्तन डेटासेट (2 क्रमिक विवर्तन प्रतिमान) के सभी अनुक्रमित प्रतिबिंबों के संदर्भ मूल्य के रूप में उपयोग करने के लिए । पार्टी की योजना बनाई स्क्रिप्ट "पूरक से ISigma.sh" का प्रयोग करें ।
    2. प्रत्येक dataset की विवर्तन पावर पहले dataset का माध्य विवर्तन पावर करने के लिए सामान्य है ।
    3. XDS ३३ से प्राप्त Rmeas मानों को ले जाकर समय के साथ Rmeas मानों के परिवर्तन का विश्लेषण करें (पूरक से मार स्क्रिप्ट "Rmeas.sh").
  2. क्रिस्टल ओरिएंटेशन
    1. Euler कोण निर्धारित करने के लिए क्रिस्टल जाली के वितरण के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए प्रयोगशाला समंवय प्रणाली के संबंध में झुकाव । आउटपुट फ़ाइल में दिए गए XDS ओरिएंटेशन मैट्रिक्स से Euler कोण परिकलित करें XPARM३९ सॉफ़्टवेयर Matlab का उपयोग कर रहा है । XPARM फ़ाइल से प्रत्येक क्रिस्टल से रोटेशन मैट्रिक्स निकालने के लिए पार्टी की योजना बनाई स्क्रिप्ट "rotation_matrix. sh" का उपयोग करें । Matlab फ़ंक्शन rotro2eu. m (अनुपूरक फ़ाइल) का उपयोग करके Euler कोणों की गणना करने के लिए Matlab में इनपुट के रूप में आउटपुट फ़ाइल का उपयोग करें ।
      नोट: गणना का विस्तृत विवरण Zarrine-अफसार एट अल४०द्वारा प्रकाशित किया गया है ।
    2. रेडियंस से प्राप्त Euler कोणों को अंशों में रूपांतरित करें. सभी तीन रोटेशन विमानों (xy, xz और zy) के लिए प्राप्त Euler कोण 10 डिग्री की कक्षाओं में समूह और सॉफ्टवेयर Origin9 का उपयोग करके उंहें साजिश ।

Representative Results

Epoxy एक्स-रे चिप निर्माण के लिए एक उत्कृष्ट भरने सामग्री है । यह सस्ता है, सरल और मजबूत विशेष उपकरण की आवश्यकता के बिना प्रक्रिया करने के लिए (चित्रा 1) । यह ४० wt% इथेनॉल के साथ कमजोर द्वारा epoxy चिपचिपापन को कम करने के साथ क्रिस्टलीकरण के ऊपर अतिरिक्त राल को हटाने की सुविधा अच्छी तरह से, परिभाषित एक्स-रे खिड़कियों में जिसके परिणामस्वरूप । उच्च इथेनॉल कमजोर पड़ने ठीक राल में दोषों के परिणामस्वरूप । एक्स-रे चिप क्रॉस-वर्गों का विश्लेषण करके, हम दोनों पक्षों की कुल खिड़की की मोटाई निर्धारित करने के बारे में 19 µm मोटी है, जो बहुत 2 × ७.५ µm का इस्तेमाल किया polyimide पंनी की नाममात्र मोटाई के करीब है (चित्रा 2)

क्रिस्टलीकरण परीक्षण कई nanoliter आकार की प्रतिक्रिया डिब्बों में अलग थे, एक केशिका वाल्व तंत्र का उपयोग कर के रूप में पहले से४१वर्णित. इस ' स्टोर-तो ' बनाने लदान तकनीक चैनल मृत मात्रा से नमूना नुकसान से बचा जाता है और आसानी से मैंयुअल रूप से किया जा सकता है, पंप या द्रव actuation४२के लिए अंय उपकरणों का उपयोग करने की आवश्यकता को नष्ट करने । चिप जलीय नमूना लदान से पहले fluorinated तेल के साथ प्रधानमंत्री है । तेल में सतह तनाव-भड़काना तेल और नमूना इंटरफेस भर में एक दबाव के परिणाम के बीच पानी इंटरफेस । इस लाप्लास दबाव वक्रता के दोनों त्रिज्या और इंटरफेस की सतह तनाव पर निर्भर करता है । अपनी ऊर्जा को कम करने के लिए, इंटरफेस अपनी सतह है, जो लगातार मात्रा में वक्रता के अपने मुख्य radii अधिकतम करने के लिए बराबर है कम करना चाहिए । एक विस्तृत चैनल में एक कम वक्रता इंटरफेस एक कम लाप्लास दबाव तो एक संकीर्ण चैनल खंड में एक उच्च वक्रता इंटरफेस है । इसलिए, नमूना प्लग तरजीह में प्रवेश करती है और संकीर्ण केशिका वाल्व प्रतिबंध के माध्यम से बहने के बजाय चौड़े बाईपास चैनल के माध्यम से बहती है । अंत में, नमूना प्लग fluorinated तेल के बाद स्वतंत्र बूंदों में नमूना कुओं अलग है ।

मजबूत और विश्वसनीय लोडिंग दोनों, एक धारावाहिक और एक समानांतर अच्छी तरह से व्यवस्था (चित्रा 3) में अप करने के लिए 1 मिलीलीटर की प्रवाह दरों के साथ प्राप्त किया गया था । ' धारावाहिक ' लेआउट में, अच्छी तरह से प्रवेश और केशिका वाल्व कसना क्रमिक रूप से एक बाईपास चैनल31के माध्यम से जुड़े हुए हैं । इसके विपरीत, ' समानांतर ' लेआउट में, दो अलग मुख्य चैनल सभी अच्छी तरह से कनेक्ट करने देता है या केशिका वाल्व केवल४३। दोनों व्यवस्था अवधारणाओं पहले से संरचना नियंत्रण के साथ संयोजन स्क्रीन करने के लिए संयुक्त किया गया है, जो प्रोटीन क्रिस्टलीकरण४३,४४में एक उपयोगी पहलू है । धारावाहिक डिजाइन केवल दो द्रव बंदरगाहों, एक प्रवेश और एक दुकान है । यह कम तरल बंदरगाहों है, और इस वजह से, बनाने और संचालित करने के लिए आसान है । समानांतर लेआउट 4 द्रव बंदरगाहों, मुख्य चैनल के लिए 2 कुओं को जोड़ने और केशिका वाल्व को जोड़ने के लिए हवा या अतिरिक्त तेल बच जाने के लिए 2 है । इसलिए लोडिंग दोनों मुख्य चैनल पक्षों से आगे बढ़ सकते हैं । इस लेआउट अपने छोटे बाईपास के कारण कुओं की एक बराबर संख्या के लिए समग्र कम प्रवाह प्रतिरोध है । यह इसलिए बेहतर कुओं के एक उच्च संख्या के साथ उपकरणों के लिए अनुकूल है । इसके अलावा, नमूना कुओं करीब एक साथ उंमुख हैं, जो स्वचालित इमेजिंग के लिए लाभ प्रदान करता है ।

पूरा नमूना अच्छी तरह से लोडिंग दोनों लेआउट के लिए मनाया गया था, अगर या तो एक दो ऊंचाई या एक तीन ऊंचाई डिजाइन के रूप में बनाया । एक दो ऊंचाई डिजाइन में, दोनों नमूना अच्छी तरह से और बाईपास चैनलों के बराबर ऊंचाई के हैं । तीन ऊंचाई वाले डिज़ाइन को एक तीसरा मास्क, एक अतिरिक्त SU8 लेयर और संरेखण चरण की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नमूना वेल्स पूर्ववर्ती बायपास चैनलों की तुलना में अधिक हो । यह ऊंचाई-अंतर एक ही केशिका valving सिद्धांत के माध्यम से अच्छी तरह से नमूना तरल पदार्थ के प्रवेश को बढ़ावा देता है कि कसना पर प्रवाह बंद हो जाता है । यहां, उच्च अच्छी तरह से छत आगे meniscus और बाईपास दिशा के साथ प्रवाह के एक कम लाप्लास दबाव से मेल खाती है केवल कुओं के बाद पूरी तरह से भर दिया है कि वाल्व कसना आगे प्रवाह ब्लॉक और यह बाईपास नीचे हटाने इष्ट है । हालांकि, सफल लोडिंग सख्ती से कुओं की आवश्यकता नहीं है के रूप में उचित केशिका valving भी चैनल चौड़ाई तदनुसार समायोजित द्वारा प्राप्त किया जा सकता बाईपास से अधिक है । बहरहाल, हमारे अनुभव में, उच्च कुओं काफी अधिक मजबूत प्रदर्शन किया और दोष मुक्त लोडिंग अप करने के लिए दस गुना उच्च प्रवाह दर सभी तीन ऊंचाई डिजाइनों में उनके दो ऊंचाई समकक्ष की तुलना में देखा गया था । यह प्रभाव समानांतर लेआउट में अधिक स्पष्ट किया गया था ।

वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण कैनेटीक्स नकल करने के लिए, polyimide पंनी के परिमित पारगम्यता समय के साथ पानी के वाष्पीकरण को नियंत्रित करने के लिए शोषण किया गया था । प्रयोगात्मक वाष्पीकरण दरों ड्रॉप सतह क्षेत्र और अच्छी तरह से ऊंचाई (चित्र 4c) समानता से समय के साथ छोटी बूंद मात्रा के परिवर्तन की निगरानी द्वारा quantified थे. एक्स-रे चिप में क्रिस्टलीकरण कुओं से वाष्पीकरण एक रैखिक फैशन में आगे बढ़ना नहीं है, समय के साथ एक कम वाष्पीकरण दर में बढ़ती घुला हुआ पदार्थ एकाग्रता परिणाम के साथ मेल खाती ड्रॉप के एक सिकुड़ते सतह क्षेत्र के रूप में४५. प्रारंभिक वाष्पीकरण के बारे में ०.५ nL एच-1 के लगभग रैखिक दर धारावाहिक लेआउट ज्यामिति के कुओं में पीछा किया ।

बेहतर क्रिस्टलीकरण कैनेटीक्स को समझने के लिए, DLS माप microfluidic चिप के क्रिस्टलीय कुओं में प्रदर्शन किया गया । प्रारंभिक DLS माप के लिए, एक गिलास स्लाइड पर बंधुआ एक PDMS चिप के लिए प्रकाश बिखरने प्रयोग के लिए बेहतर ऑप्टिकल गुण प्रदान किया गया था । यह चिप एक्स-रे चिप के रूप में ही अच्छी तरह से आयाम था । PDMS एक्स-रे चिप४५में polyimide खिड़कियों के polyimide की तुलना में एक उच्च जल वाष्प पारगम्यता है । प्रवाह के बाद से दूरी के साथ रैखिक तराजू, एक polyimide के वाष्पीकरण पथ अच्छी तरह से विडों उपयुक्त मोटाई के एक इसी PDMS खिड़की के साथ मिलान किया जा सकता है ।

DLS परिणाम बताते हैं कि समय के साथ त्रिज्या वितरण परिवर्तन (चित्र 4a-B), प्रदर्शन कि DLS माप पहले क्रिस्टलीय कणों मनाया जाता प्रारंभिक nucleation का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं. यह जानकारी nucleate और nucleation४६के एक प्रारंभिक चरण में बाह्य वाष्पीकरण दर और इसलिए supersaturation स्तर का समायोजन करके अच्छी तरह से प्रति एकल क्रिस्टल विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

एक्स-रे चिप के लिए एक 3d मुद्रित एडाप्टर पर तय किया गया था SBS संगत प्लेट goniometer के EMBL beamline पर सिंक्रोट्रॉन P14 के पेट्रा III (चित्र 5 ए) । वैकल्पिक रूप से, एक छोटे 3 डी मुद्रित फ्रेम मानक beamline goniometers21के लिए एक्स-रे चिप्स माउंट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Thaumatin क्रिस्टल 10-20 µm(चित्रा 5B) का एक आकार है और २.० Å(चित्रा 5C) के एक संकल्प को diffract । के रूप में की उंमीद है, एक्स-रे चिप से दो पतली polyimide पन्नी खिड़कियों के एक्सरे पृष्ठभूमि योगदान 11 å (2θ ~ 5 °) और ३३ å (2θ ~ १.७ °) में polyimide बहुलक कैटरिंग के छल्ले तक ही सीमित है ०.९७ å के एक्स-रे तरंग दैर्ध्य के लिए । ये दोनों रिंग्स डेटा प्रोसेसिंग को डिस्टर्ब नहीं करतीं । ८३ thaumatin क्रिस्टल के साथ एक कुल डेटासेट एकत्र किया गया था और 10 विवर्तन पैटर्न प्रत्येक फ्रेम के दौरान एक 1 डिग्री रोटेशन के साथ प्रत्येक क्रिस्टल से दर्ज किए गए थे । डेटा संसाधन और परिशोधन पैरामीटर, साथ ही thaumatin डेटासेट के आँकड़े सूचीबद्ध होते हैं और ग्लूकोज isomerase के दो अन्य डेटासेट के साथ तुलना करते हैं और सीटू में भी एकत्र किए गए thioredoxin तालिका 3 में सूचीबद्ध होते हैं और तालिका 4.

समय के साथ सामान्यीकृत विवर्तन पावर की तीव्रता क्षय thaumatin dataset पाँच उप datasets में विभाजित करके जांच की गई थी (दो विवर्तन प्रतिमान पूर्ण datasets बनाए रखने के लिए प्रति सबसेट का उपयोग किया गया) । जैसा कि चित्रा घमण्डमें दिखाया गया है, विवर्तन पावर पहले उप डेटासेट के बाद कम करने के लिए शुरू किया और चौथे उप डेटासेट में ५०% से नीचे था. परिणामस्वरूप, उप डेटासेट के Rmeas मान भी समय के साथ बढ़ रहे हैं, डेटा संग्रह के दौरान एक्स-रे विकिरण क्षति का संकेत है । हम परिकल्पना कि मुक्त एक्स-रे जोखिम के दौरान उत्पंन कण जल्दी ही प्रतिक्रिया डिब्बे में पड़ोसी क्रिस्टल नीचा । उदाहरण के लिए, इस तरह के माध्यमिक एक्स-रे क्षति एक संबंधित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है, जहां क्रिस्टल एक polyimide सैंडविच21में एक काफी बड़ा क्षेत्र में वितरित किया गया है में कम स्पष्ट था । समग्र एक्स-रे नुकसान को कम करने के लिए, केवल एक विशेष क्रिस्टल से विवर्तन पैटर्न की एक छोटी संख्या कमरे के तापमान पर एकत्र किया जाना चाहिए । इसके अलावा, केवल एक ही प्रोटीन क्रिस्टल microfluidic चिप के डिब्बे के प्रति उजागर किया जाना चाहिए । फिर भी, संसाधित डेटासेट का उपयोग कर परिष्कृत सभी संरचना मॉडल बहुत अच्छा stereochemistry और उपयुक्त आँकड़े (तालिका 4) दिखाते हैं । इसके अलावा, सभी अंतिम इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शे बहुत अच्छी गुणवत्ता के थे ।

एक्स-रे पारदर्शी चिप्स, अभिविन्यास और क्रिस्टल की व्यवस्था पर पिछले क्रि दृष्टिकोण में जानबूझकर हेरफेर करने के लिए क्रिस्टल झुकाव के एक यादृच्छिक वितरण प्राप्त करने के लिए किया जाना था४० या क्रिस्टल आंदोलनों द्वारा प्राप्त किया गया था तरल परत के भीतर21। इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक्स-रे पारदर्शी microfluidic चिप्स में क्रिस्टल अभिविन्यास का मूल्यांकन करने के लिए, प्रयोगशाला निर्देशांक प्रणाली के संबंध में सभी उजागर क्रिस्टल के यूनिट सेल अभिविन्यास निर्धारित किया गया था. bipyramidal thaumatin क्रिस्टल के लिए, एक मामूली वरीयता (चित्रा 7A) मनाया गया था, जबकि हम ग्लूकोज isomerase क्रिस्टल (चित्रा 7B) के लिए एक व्यापक वितरण प्राप्त की । हम कारण है कि नैनोमीटर पैमाने पर, सबसे सामग्री प्रदर्शित महत्वपूर्ण किसी न किसी । इसलिए, क्रिस्टल सहज काफी कम पक्षपातपूर्ण झुकाव में सतह पर सहज nucleate सकता है । इस तरह के एक छोटे से क्रिस्टल नाभिक एक अभिविन्यास में बंद किया जा सकता है, जबकि सतह के सामान्य करने के लिए सापेक्ष reओरिएंट बिना उचित आकार के लिए विकसित करने के लिए जारी. वास्तव में, सतह की मध्यस्थता क्रिस्टल nucleation लंबे समय की प्रक्रिया में क्रिस्टल को नुकसान पहुँचाए बिना सतह से एक संलग्न क्रिस्टल पाश की कोशिश कर रहा crystallographers के लिए एक उपद्रव किया गया है. यहां, हम सीधे विवर्तन डेटा संग्रह के लिए ऐसे क्रिस्टल का उपयोग कर सकते हैं । हालांकि, सिस्टम विशिष्ट सीमाएं मौजूद हैं, के रूप में thioredoxin xy में कुछ झुकाव के लिए एक मजबूत पसंद का पता चला-, xz-और yz-विमानों (चित्रा 7C) । उदाहरण के प्रदर्शन से पता चला है कि अभिविन्यास वितरण न केवल वृद्धि पर्यावरण पर भी क्रिस्टल आकार पर निर्भर करता है । thioredoxin क्रिस्टल आकार जो पसंदीदा अभिविंयास में विकसित करते हैं, जबकि चतुष्कोणीय bipyramidal thaumatin क्रिस्टल या orthorhombic ग्लूकोज isomerase क्रिस्टल इस व्यवहार नहीं दिखाते हैं । हालांकि, सभी मामलों में, यहां तक कि पसंदीदा झुकाव के साथ क्रिस्टल rotations की सुलभ रेंज पारस्परिक अंतरिक्ष की पर्याप्त अच्छी कवरेज के परिणामस्वरूप और इसलिए पूरा डेटा सभी जांच की प्रोटीन के लिए सेट । इस प्रकार, एक्सरे एक्सपोजर के लिए क्रिस्टल का चयन करते समय कोई अतिरिक्त उपाय नहीं किए गए ।

Figure 1
चित्र 1 : microfluidic एक्स-रे चिप निर्माण की योजना । (1) SU-8 एक सिलिकॉन सब्सट्रेट पर तिरस्कृत और वांछित परत मोटाई प्राप्त करने के लिए लेपित स्पिन है । (2) Photoresist एक मुखौटा के माध्यम से यूवी विकिरण के संपर्क में है । (3) unexposed photoresist तो PGMEA और isopropanol के साथ लगातार धोने से दूर विकसित की है, जिसके परिणामस्वरूप (4) आगे कास्टिंग कदम के लिए एक एसयू-8 मास्टर । (5) PDMS पर डाला जाता है, और (6) PDMS मोल्ड के इलाज के बाद, SU-8 मास्टर से खुली है । (7a) epoxy गोंद PDMS मोल्ड पर तिरस्कृत किया है और (7b) एक सक्रिय polyimide पंनी रासायनिक Epoxy राल के लिए बंधुआ है । (8) इलाज के बाद, नमूनों पतली epoxy फिल्म के साथ polyimide पंनी PDMS मोल्ड से खुली है । (9) एक अंतिम चरण में, उपकरण एक दूसरे polyimide पंनी के साथ lidded के लिए एक संलग्न कम एक्स-रे पृष्ठभूमि microfluidic चिप उपज है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : फोटोग्राफ (बाएं) और अंतिम चिप्स के पार वर्गों के सूक्ष्म छवियों । एक प्रतिनिधि चैनल खंड (मध्य) और एक क्रिस्टलीकरण अच्छी तरह से (सही) दो अलग चिप्स से दिखाया जाता है । तीर मापा दूरी का संकेत है । सभी आयाम µm में हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : क्रिस्टलीकरण की योजनाबद्धता अच्छी तरह से डिजाइन [एक] समानांतर या [B] धारावाहिक लेआउट, के रूप में ऊपर से देखा और पक्ष से, µm में संकेत आयामों के साथ. ठेठ चैनल हाइट्स थे: ५० µm बाईपास, 50-60 µm क्रिस्टलीकरण अच्छी तरह से, 5-10 µm केशिका वाल्व, के बारे में २.५ nL (समानांतर लेआउट) और 8 nL (धारावाहिक लेआउट) की अच्छी मात्रा के लिए इसी । प्रतिनिधि अच्छी तरह से लोड व्यवहार खाद्य रंजक का उपयोग करके दिखाया गया है. चिप 12 wt% 2, 1, 2H, 2H-perfluoro-octanol एफसी-४३ में, से पहले खाद्य डाई का भंडारण कुओं में इंजेक्ट किया गया था के साथ प्रधानमंत्री था । सफ़ेद तीर प्रवाह की दिशा का संकेत देते हैं । लोड उपकरणों के अवलोकन छवियों सभी कुओं भरा दोष मुक्त दिखा, मजबूत नमूना लोडिंग illustrating. समानांतर लेआउट एक तीन ऊंचाई डिजाइन के रूप में सचित्र है, सघन कुओं बाईपास से अधिक के साथ, जबकि धारावाहिक लेआउट कुओं और बाईपास के साथ बराबर ऊंचाई वाले एक दो ऊंचाई डिजाइन के रूप में दर्शाया गया है । ठेठ प्रवाह दरों के आसपास थे १५० µ एल/एच लदान के दौरान, लेकिन दोष मुक्त लदान के लिए एक तीन ऊंचाई-डिजाइन में 1 मिलीलीटर/एच के flowrates के लिए मनाया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : सीटू में एक क्रिस्टलीकरण के गतिशील प्रकाश कैटरिंग अच्छी तरह से समय के साथ । [एक] क्रिस्टलीकरण की सूक्ष्म छवि श्रृंखला अच्छी तरह से । संग्रहीत छोटी बूंद निरंतर सिकुड़ती के रूप में पानी भाप समय पर लुप्त हो जाती है । पहले thaumatin microcrystals 4 ज के बाद मनाया जा सकता है [ख] इसी क्रिस्टलीकरण की प्रक्रिया में फोटो खिंचवाने के दौरान DLS द्वारा मापा thaumatin कणों की इसी hydrodynamic त्रिज्या वितरण [A] । एक दूसरे त्रिज्या अंश के गठन, प्रारंभिक nucleation घटनाओं का संकेत लगभग 1-2 एच के बाद देखा जा सकता है [ग] प्रतिनिधि मात्रा दो संदर्भ छोटी बूंद समय के साथ वाष्पीकरण पानी के नुकसान के कारण संस्करणों की कमी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : सीटू में विवर्तन डेटा कलेक्शन । [एक] व्यक्तिगत microfluidic चिप्स एक प्लेट goniometer पर एक 3 डी मुद्रित अनुकूलक (नीला) द्वारा घुड़सवार हैं । [बी] एक्स के दौरान microfluidic चिप में Thaumatin क्रिस्टल-रे जोखिम के रूप में beamline P14 पर में लाइन माइक्रोस्कोप द्वारा imaged । [ग] thaumatin क्रिस्टल के विवर्तन २.० Å के एक संकल्प को दर्ज किया गया था, एक negligibly कम पृष्ठभूमि के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : microfluidic चिप में thaumatin क्रिस्टल से विवर्तन डेटा का डेटा मूल्यांकन, कमरे में दर्ज तापमान । [एक] परिष्कृत thaumatin मॉडल के इलेक्ट्रॉन घनत्व फ्रेम 1-2 डेटासेट का उपयोग केवल (१.५ σ पर नीले रंग की आकृति) । [बी] एक्स-रे खुराक के एक समारोह के रूप में thaumatin क्रिस्टल की तीव्रता क्षय । [ग] एक्स-रे खुराक पर Rmeas मूल्य का विकास । [बी] में बॉक्स भूखंडों और [सी] quartiles के साथ (ऊपरी मान ७५%, औसत मूल्यों ५०%, कम मूल्यों 25% और मतलब) और ९५% विश्वास अंतराल के साथ मूंछ विवर्तन तीव्रता के क्षय का प्रतिनिधित्व करते हैं और सभी उजागर क्रिस्टल के Rmeas (n = ८३). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : प्रयोगशाला समंवय प्रणाली के संबंध में microfluidic चिप पंनी में यूनिट सेल झुकाव का वितरण । [एक] bipyramidal thaumatin क्रिस्टल ने xy में लगभग १८० ° को कवर करने वाले ओरिएंटेशन का एक व्यापक वितरण दिखाया-(नीला), xz-विमान (हरा) और yz-(लाल) विमान । [ख] ग्लूकोज isomerase भी एक व्यापक वितरण से पता चलता है, जबकि [ग] thioredoxin कुछ झुकाव के लिए एक मजबूत पसंद दिखाया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

SU8-परत स्पिन कोट पूर्व सेंकना बेनकाब पोस्ट-सेंकना
[६५/९५ डिग्री सेल्सियस] [६५/९५ डिग्री सेल्सियस]
1सेंट परत: वेल्स १००० आरपीएम 0/10 मिनट २०० माइकल क्/2 1/4 मिनट
15 µm SU8-3010
2एन डी परत: बाईपास २००० आरपीएम 0/16 मिनट २२० माइकल क्/2 1/5 मिनट
३५ µm SU8-3025
3rd परत: वाल्व ३००० आरपीएम 0/3 मिनट १५० माइकल क्/2 1/2 मिनट
5 µm SU8-3005

तालिका 1: तीन परत समानांतर एक्स-रे चिप डिजाइन के लिए SU8 प्रक्रिया उदाहरण । इस परत का आदेश एक्स-रे चिप निर्माण के लिए एक PDMS मोल्ड कास्टिंग के लिए अनुमति देगा । सीधे प्रोटोटाइप के दौरान एक PDMS मोल्ड करने के लिए, मास्टर निर्माण के दौरान आदेश परत रिवर्स 3rd से शुरू करने के बजाय 1सेंट परत के साथ समाप्त करने के लिए ।

प्रोटीन प्रोटीन एकाग्रता प्रोटीन बफर precipitant स्पेस ग्रुप, PDB एंट्री विलुप्त गुणांक [M-1 cm-1]
Thaumatin (Thaumatococcus daniellii) ४० मिलीग्राम एमएल-1 ५० मिमी बीआईएस-Tris, पीएच ६.५ १.१ मीटर सोडियम tartrate, ५० एमएम Tris, पीएच ६.८ I4२२२, 1LR2 २९४२०
ग्लूकोज isomerase (Streptomyces rubiginosus) 25 मिलीग्राम एमएल-1 10 मिमी HEPES, 1 मिमी MgCl2, पीएच ७.० १०० मिमी बीआईएस-Tris, २.७ एम अमोनियम सल्फेट, पीएच ५.७ I222, 4ZB2 ४६४१०
Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) ३४ मिलीग्राम एमएल-1 20 एमएम Tris-एचसीएल, 5 एमएम EDTA, १५० एमएम NaCl, पीएच ८.० २७.५% PEG1500, १०० मिमी एसपीजी बफर, पीएच ६.३ पी 41212, 4FYU २४०७५

तालिका 2: क्रिस्टलीकरण शर्तों और प्रोटीन क्रिस्टल के अंतरिक्ष समूहों, विलुप्त गुणांक और pdb कोड सहित तैयार किया ।

प्रोटीन उजागर क्रिस्टल की संख्या क्रिस्टल प्रति विवर्तन पैटर्न की संख्या प्रदर्शन प्रति दोलन रेंज [°] एक्सपोजर टाइम [ms] PDB प्रवेश के लिए श्री
Thaumatin (Thaumatococcus daniellii) १०३ 10 1 ४० 1LR2
ग्लूकोज isomerase (Streptomyces rubiginosus) ६९ १०० ०.१ ८० 4ZB2
Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) ६८ 10 1 ४० 4FYU

तालिका 3: X-ray विवर्तन डेटा संग्रह पैरामीटर ।

डेटा संग्रह आंकड़ेa thaumatin
(फ़्रेम 1-20)		 ग्लूकोज isomerase (फ्रेम 1-100) thioredoxin
(फ़्रेम 1-10)
Beamline P14
तरंग दैर्ध्य [Å] ०.९६८६३
अंतरिक्ष समूह पी 41212 I222 पी 4 2 212
इकाई कक्ष पैरामीटर: a = b, c [Å] ५८.६२, १५१.४८ ९३.९१, ९९.६०, १०३.०४ ५८.४५, १५१.५९
क्रिस्टल की संख्या १०१ ४१ ३४
कुल दोलन [°] 10 10 10
संकल्प [Å] 30.1.1989
(१.९५ – १.८९)		 30.1.1975
(१.८० – १.७५)		 30.3.2000
(३.२० – ३.००)
तापमान [K] २९६ २९६ २९६
आर p.i.m.बी ७.५ (२५.५) ८.८ (२८.०) ९.१ (३३.२)
मापा प्रतिबिंब १५५३२०० ६९०००० १११११९६
अद्वितीय प्रतिबिंब २१८५० ४८९४२ ४४४४९
औसत मैं/σ (i) ६.०७ (१.७८) ५.८५ (१.६६) ४.०८ (१.४७)
Mn (I) अर्ध-सेट सहसंबंध CC(1/2) ९६.२ (७२.२) ९५.८ (६८.२) ९७.९ (७५.३)
पूर्णता [%] ९९.८ (१००.०) १००.० (९९.९) ९९.९ (१००.०)
अतिरेक ७१.१ १४.१ 25
शोधन सांख्यिकी
रिज़ॉल्यूशन श्रेणी [Å] 1/30/1989 1/30/1975 3/30/2000
आरनि: शुल्क [%] 18.8/23.9 18.1/20.5 18.9/23.1
प्रोटीन परमाणुओं १५५० ३०४५ ११२९
जल अणुओं ५१ १११ १६४
Ligand अणुओं 20 0 0
Rms विचलन
बांड-लंबाई [Å] ०.०२ ०.०२६ ०.०१
बंधन कोण [°] २.०४ २.२२ १.४३
B फ़ैक्टर [Å2]
प्रोटीन २२.६ 20 ५०
पानी २५.१ २७.१ २९.७
Ligand २०.४
तहकीकात साजिश विश्लेषण
अधिकांश इष्ट क्षेत्र [%] ९७.६७ ९५.३२ ९६.१३
अनुमत क्षेत्र [%] २.४४ ४.१६ ३.६४
उदारता से अनुमत क्षेत्र [%] ०.४९ ०.५२ ०.२३
a: कोष्ठकों में मान उच्चतम रिज़ॉल्यूशन शेल के लिए हैं ।
ख: (), मैं कहां (hkl) प्रतिबिंब hkl का मतलब तीव्रता है, Σhkl सभी प्रतिबिंब पर योग है और Σi मैं प्रतिबिंब hkl की माप पर योग है ।Equation

तालिका 4: डेटा संग्रह आँकड़े डेटासेट के thaumatin, ग्लूकोज isomerase और thioredoxin से.

supplement-फाइल 1: chip_geometry. dwg. सीएडी-चिप geometries इस्तेमाल की फाइल । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

supplement-फाइल 2: goniometer_adapter. stl. STL-एक्सरे चिप goniometer एडेप्टर निर्दिष्ट फ़ाइल । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक-फाइल 3: xds.sh । XDS द्वारा विवर्तन डेटा के कील की प्रक्रिया के लिए इनपुट फ़ाइलें बनाने के लिए मार स्क्रिप्ट । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक-फाइल 4: xscale.sh । बैश स्क्रिप्ट उप सेटों से विवर्तन डेटा विलय और एक HKL फ़ाइल बनाने के लिए । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक-फाइल 5: ISigma.sh । बैश स्क्रिप्ट सभी व्यक्तिगत सबसेट से ISigma मूल्यों को निकालने के लिए । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक-फाइल 6: Rmeas.sh । बैश स्क्रिप्ट सभी व्यक्तिगत सबसेट से Rmeas मूल्यों को निकालने के लिए । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

पूरण-फाइल 7: rotation_matrix. श. मार स्क्रिप्ट Matlab के लिए इनपुट फ़ाइल के लिए रोटेशन मैट्रिक्स से Euler कोण की गणना तैयार करने के लिए । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Discussion

हम खिड़की सामग्री के रूप में सामग्री और polyimide पंनी भरने के रूप में epoxy राल patterning द्वारा सीटू एक्स-रे विवर्तन में के लिए microfluidic उपकरणों बनाना । हमारी प्रक्रिया पिछले एक्स-रे चिप डिजाइन16,21पर निर्माण की प्रक्रिया के विभिंन कदम अनुकूलित । हम खिड़की मोटाई कम है और इस तरह की पृष्ठभूमि तितर बितर जबकि भी कम प्रक्रिया कदम के रूप में निर्माण सहजता की आवश्यकता है । वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर सीटू में क्रिस्टलीकरण पर्याप्त लाभ है. यह कमरे के तापमान पर विवर्तन डेटा संग्रह की अनुमति देता है और इस तरह क्रायो संरक्षण, जो कुछ मामलों में प्रोटीन संरचना में कलाकृतियों शुरू करने का खतरा होता है की जरूरत शामिल नहीं है । इसके अलावा, क्रिस्टल शारीरिक तनाव के अधीन नहीं हैं, क्योंकि उनके पैतृक पर्यावरण से क्रिस्टल के हस्तांतरण से बचा जा सकता है । इस प्रक्रिया के माध्यम से, क्रिस्टल अपने उच्चतम गुणवत्ता बनाए रखने और किसी भी इलाज से पीड़ित नहीं है ।

हमारे अनुभव में, प्रोटोकॉल के भीतर सबसे महत्वपूर्ण कदम क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया को नियंत्रित करने के आसपास घूमती है । उचित आयामों के साथ एक्स-रे उपयुक्त क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए मापदंडों की पहचान की empirically की जरूरत है और वाष्प प्रसार प्रयोगों से सीधे नहीं लिया जा सकता है. प्रोटीन और precipitant के समान सांद्रता का प्रयोग हमेशा अलग चिप्स, या एक ही चिप के भीतर विभिंन कुओं में समय में क्रिस्टल में परिणाम नहीं था । यह इंगित करता है कि क्रिस्टल nucleation और विकास को प्रभावित करने वाले सभी कारकों को ध्यान से माना जाना चाहिए, जैसे मां शराब संरचना या क्रिस्टलीकरण कैनेटीक्स (वाष्पीकरण पथ के माध्यम से) । के रूप में बड़े क्रिस्टल उच्च संकल्प को diffract, उपयुक्त बड़े क्रिस्टल आदर्श हो रहे हैं । क्रिस्टल nucleation और विकास की प्रक्रिया DLS माप के साथ पालन किया जा सकता है । के अंदर लेजर ध्यान समायोजित ~ ५० µm चिप के पतले क्रिस्टलीकरण डिब्बों चुनौतीपूर्ण हो सकता है और सावधान मैनुअल संरेखण की आवश्यकता हो सकती है । १०० µm से अधिक गहरे कुओं का उपयोग करके, लेजर ऑटो संरेखण व्यवहार्य और विश्वसनीय था, ऐसी है कि कई कुओं स्वचालित अधिग्रहण योजनाओं के माध्यम से निगरानी की जा सकती है ।

polyimide आधारित एक्स-रे चिप्स केवल एक कम पृष्ठभूमि का उत्पादन और हम तीन मॉडल प्रोटीन के लिए संरचनाओं को हल करके नियमित एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह के लिए इन उपकरणों की उपयुक्तता का प्रदर्शन । सबसे अच्छा चिप में प्राप्त संकल्प अलग, पहले से हासिल संकल्प के साथ तुलना में, काफी बड़ा प्रोटीन क्रिस्टल और पारंपरिक एक्स-रे डेटा संग्रह से । यह कई कारकों के कारण हो सकता है और आगे क्रिस्टलीकरण हालत अनुकूलन आगे विवर्तन में सुधार हो सकता है । यह 30 µm से छोटे आयामों के साथ क्रिस्टल लागू करने १.८ Å संकल्प के लिए सीटू विवर्तन डेटा में इकट्ठा करने के लिए संभव था. thaumatin विवर्तन डेटा का विस्तृत विश्लेषण विकिरण क्षति के बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान की है । विकिरण क्षति के विस्तार को सीमित करने के लिए, केवल एक एकल क्रिस्टल microfluidic डिवाइस में डिब्बे के प्रति उजागर किया जाना चाहिए, के रूप में और पड़ोसी क्रिस्टल में कण के प्रसार हो सकता है । डेटा संग्रह की गति में सुधार करने के लिए, यह भविष्य में स्वचालित होना चाहिए ।

क्रिस्टल आकृति विज्ञान के कारण, कुछ मामलों में एक पसंदीदा अभिविन्यास हो सकता है. इस उदाहरण के लिए thioredoxin डेटासेट, जहां क्रिस्टल एक जोरदार पसंदीदा चिप खिड़कियों के सापेक्ष अभिविंयास था के साथ मामला था । यहां भी, हम एक पूरा विवर्तन डेटासेट एकत्र सकता है । यदि क्रिस्टल चिप में एक पसंदीदा अभिविन्यास प्रदर्शन और विशेष रूप से अगर इसी अंतरिक्ष समूह भी एक कम समरूपता है, तो डेटासेट की संपूर्णता संग्रह के दौरान निगरानी की जानी चाहिए ऐसी है कि पर्याप्त विवर्तन पैटर्न बेंत हो एकत्र.

समय-हल इन चिप्स का उपयोग कर अध्ययन सीधे संभव है जब एक पंप जांच दृष्टिकोण के साथ प्रकाश प्रेरित प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर रहे हैं । पंप लेजर के लिए polyimide पंनी प्रकाश संचरण का आविर्भाव और वैकल्पिक रूप से, ऑप्टिकली रूप से स्पष्ट polyimide या कॉक इस्तेमाल किया जा सकता है की जरूरत है । वर्तमान microfluidic geometries सब्सट्रेट मिश्रण के बाद क्रिस्टल बड़े हो रहे हैं के लिए अनुमति नहीं देते. हालांकि, हम वर्णित एक्स-रे चिप निर्माण प्रोटोकॉल भी दोनों समय के लिए इस तरह के मिश्रण डिजाइन के लिए उपयुक्त हो-हल एक्स-रे विवर्तन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तितर बितर दृष्टिकोण19की उंमीद ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम घाट बीज कोष PIF-2015-46, BMBF अनुदान 05K16GUA और 05K12GU3 द्वारा समर्थित किया गया था, और ' हैंबर्ग सेंटर फॉर Ultrafast इमेजिंग – संरचना, गतिशीलता और मामले की परमाणु पैमाने पर नियंत्रण ड्यूश के उत्कृष्टता समूह ' Forschungsgemeinschaft (DFG) । मुक्त-इलेक्ट्रॉनक लेसर विज्ञान के लिए केंद्र से संबद्ध लेखकों का कार्य कार्यक्रम मूलक निधियों के माध्यम से Helmholtz संघ द्वारा वित्त पोषित किया गया. सिंक्रोट्रॉन एमएक्स डेटा beamline P14 में पेट्रा III भंडारण अंगूठी पर EMBL हैम्बर्ग द्वारा संचालित (DESY, हैम्बर्ग, जर्मनी) में एकत्र किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SU-8 3000 Series MicroChem Corp. SU-8 3000 Photoresist
PGMEA Sigma-Aldrich 484431 Developer
Isopropyl alcohol Solvent
Ethanol Solvent
Epoxy glue UHU Plus Schnellfest 5 min Epoxy glue
PDMS Dow Corning Sylgard 184 Silicone
Kapton foil Dupont/ American Durafilm HN grade, gauge 30 (7.5 μm) polyimide foil
APTS Sigma-Aldrich 440140 Chemical
GPTS Sigma-Aldrich 440167 Chemical
Cytop CTX-109AE Asahi Glass Co. Ltd Cytop CTX-109AE Cytop fluoropolymer coating
CT-Solv 100E Asahi Glass Co. Ltd CT-Solv 100E Cytop fluoro-solvent
HFE-7500 3M Novec 7500 Fluorinated oil
AutoCAD AutoDesk Inc. AutoCAD CAD Software
Biopsy Punch Harris Uni-core 0.75 mm
Photo mask JD Photo Data
3 inch wafer University Wafer Silicon wafer
Mask aligner SÜSS MicroTec MJB4 Mask aligner
PDMS mixer Thinky ARE-250
Plasma machine Diener electronic Zepto
Thaumatin Sigma Aldrich T7638 Protein
Glucose Isomerase Hamton Research HR7-102 Protein
Bis-Tris Sigma Aldrich B9754 Chemical
Sodium Tartrate Merck 106664 Chemical
Tris-HCl Sigma Aldrich 10812846001 Chemical
HEPES Carl Roth 6763.2 Chemical
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 208337 Chemical
Ammonium Sulfate Sigma Aldrich A4418 Chemical
EDTA Sigma Aldrich E6758 Chemical
Sodium Chloride Sigma Aldrich 1064060250 Chemical
PEG1500 Molecular Dimensions MD2-100-6 Chemical
SPG buffer Jena Bioscience CSS-389 Chemical
SpectroLight600 XtalConcepts DLS Instrument
Nanodrop Thermo Scientific Spectrophotometer
Zentrifuge Eppendorf
Ultimaker2 Ultimaker 3D printer
Form2 Formlabs 3D printer
Amicon Filter Sartorius Stedim 0.2 µm filter
Tubing Adtech Polymer Engineering Ltd Bioblock/05 PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter
Syringes  BD 309628 1ml Luer-Lock Tip
Needle  Terumo Agani Needle AN*2716R1 27Gx5/8"

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References

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सीटू के क्रिस्टल एक्स-रे विवर्तन <em>में</em> और सीरियल क्रि के लिए <em>सीटू</em> डायनामिक लाइट कैटरिंग में Microfluidic चिप्स
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Gicquel, Y., Schubert, R., Kapis, S., Bourenkov, G., Schneider, T., Perbandt, M., Betzel, C., Chapman, H. N., Heymann, M. Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography. J. Vis. Exp. (134), e57133, doi:10.3791/57133 (2018).

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