Deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana

Summary

Descreveremos um protocolo para a deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana, usando a ligação do receptor classificação, sortilin, o primeiro loop luminal da proteína do transportador de glicose, GLUT4, como exemplo.

Abstract

Nossa capacidade de explorar as interações da proteína-proteína é a chave para a compreensão de conexões regulamentares na célula. No entanto, a detecção de interações da proteína-proteína em muitos casos é associada com desafios significativos experimentais. Em particular, classificação de receptores interagem com sua carga de proteína no lúmen dos compartimentos da membrana muitas vezes de forma sensível detergente, fazendo co-imunoprecipitação destas proteínas inutilizável. Ligação da classificação sortilin do receptor para o transportador de glicose que GLUT4 pode servir como um exemplo de fracos luminal interações entre proteínas de membrana. Aqui, descrevemos um ensaio rápido, simples e barato para validar a interação entre sortilin e GLUT4. Por isso, nós temos projetado e quimicamente sintetizado o peptídeo myc-tag correspondente para o potencial sortilin-ligação epítopo na parte luminal de GLUT4. Sortilin marcado com seis histidines foi expressa em células de mamíferos e isolada de lisados celulares usando grânulos de cobalto. Sortilin imobilizada em grânulos foi incubado com a solução de peptídeo em valores de pH diferentes, e o material eluted foi analisada pela mancha ocidental. Este ensaio pode ser facilmente adaptado para estudar outras interações da proteína-proteína de detergente sensíveis.

Introduction

GLUT4 é uma proteína de transporte de glicose que se expressa predominantemente nas células do músculo esquelético e gordura onde que medeia o efeito da insulina no sangue pós-prandial glicose autorização¹. Sendo uma proteína muito estável, GLUT4 é regulada em um nível pós-traducional. Na ausência de insulina, GLUT4 é em grande parte excluídos da membrana plasmática (daí baixa permeabilidade basal de glicose) e está localizado principalmente no interior da célula em pequenas vesículas insulin-responsivos (IRVs) e rede trans-Golgi (TGN) que é provável que representam o compartimento do doador IRV. Após a administração de insulina, os IRVs se fun....

Protocol

1. manipulação do Peptide

1. Design e ordenação do peptide
   1. Escolha a sequência desejada do peptide e adicionar uma marca, como myc epítopo (EQKLISEED) no seu ou N - ou C-terminal.
   2. Verifica a solubilidade prevista do peptide em água, usando peptídeo solubilidade calculadora http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Se a solubilidade é baixa, tente adicionar outra tag solúvel em água, para alterar o equilíbrio de carga.
      Nota: Usamos o peptídeo correspondente ao primeiro luminal loop (fll) de GLUT4 marcados com o epítopo myc (negrito) no terminal N (Myc-fll-GLUT4): EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA q....

Results

Lisados foram preparados a partir 3T3 L1 células transfectadas estàvel com Sortilin-myc/His⁵ e de células de L1 3T3 WT, usadas como um controle negativo. Ambos os lisados foram incubados com grânulos de cobalto em pH 6 ou pH 8 e cuidadosamente lavados. Grânulos com proteínas imobilizadas em seguida foram incubados na solução de Myc-fll-Glut4. Após cuidadosos lavagens, proteínas vinculadas aos talões foram eluídas com 0,25 M de imidazol. Amostras foram submetidas, j.......

Discussion

Sortilin é um receptor de proteína de ligante multi conservada evolucionária que está envolvido em ambos sinalização na membrana plasmática e no intracelular classificação eventos^6,7. No entanto, a busca por ligantes do sortilin o autêntico (alguns dos quais são proteínas de membrana luminal ou integral) é complicada, como a interação do sortilin com alguns dos seus parceiros de ligação parece ser sensível aos detergentes. Portanto, uma fácil e uma abordagem gene.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coquetel inibidor de protease	Sigma	P8849	para uso na purificação da proteína de etiqueta de histidina
Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-040-CV	PBS
1mL Seringa de Insulina U-100	BD	329652	26G x 1/2
Kit de Ensaio de Proteína BCA	Pierce	23228
Tampão de lavagem	Boston BioProducts	BP-234	Para purificação de proteína His-tag
Resina de Cobalto HisPur	Thermo Scientific	89964
Tampão de amostra de tricina Bio-Rad		161-0739	com SDS, bMercaptaetanol deve ser adicionado
Eluição  Tampão	Boston BioProducts	BP-236	Para purificação de proteína His-tag com 250mM Imidazole
Mini-Protean Tris-Tricine géis pré-moldados 10-20%	Bio-Rad	456-3115	Para separação de peptídeo e pequena proteína
Tris/Tricine/SDS running buffer	Bio-Rad	161-0744
Tampão de Transferência	Boston BioProducts	BP-190	Adicione 20% de metanol
Membrana de nitrocelulose  0.45 mm	Bio-Rad	1620115
Albumina de soro bovino	Sigma	A9647	BSA
Anti Myc anti Myc anticorpo	Sinalização Celular	2272
Peptídeo de Coelho	Genscipt		personalizar
pedidos Precision Plus Protein Dual color Standarts	BioRad	161-0374