Um método para definir os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade de Microbiome cólon em um modelo de Tumor de cólon de Mouse

Resumo

Enriquecimento ambiental (EE) é um ambiente de alojamento dos animais que é usado para revelar os mecanismos que fundamentam as conexões entre o estilo de vida, estresse e doença. Este protocolo descreve um procedimento que utiliza um modelo do rato da tumorigênese cólon e EE para definir especificamente alterações na microbiota biodiversidade que pode afetar a mortalidade de animais.

Resumo

Vários estudos recentes ilustraram os efeitos benéficos de viver em um ambiente enriquecido em melhorar a doença humana. Em camundongos, enriquecimento ambiental (EE) reduz a tumorigênese ativando o sistema imunológico do mouse, ou afeta a sobrevivência animal do tumor rolamento, estimulando a resposta de reparação de ferida, incluindo diversidade microbiome melhorada, no microambiente do tumor. Desde que aqui é um procedimento detalhado para avaliar os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade da microbiome em um modelo de tumor de cólon do rato. Precauções em matéria de criação de animais e considerações para integração de colônia de genótipo e mouse animal são descritas, que acabará por afectar a biodiversidade microbiana. Atendendo a estas precauções pode permitir a transmissão de microbiome uniforme mais e consequentemente irá aliviar efeitos dependentes do não-tratamento que podem confundir as conclusões do estudo. Além disso, neste procedimento, as alterações da microbiota são caracterizadas usando 16S rDNA de sequenciamento de DNA isolado de fezes coletadas de cólon distal após enriquecimento ambiental a longo prazo. Desequilíbrio de microbiota do intestino está associado com a patogênese da doença e cólon câncer de inflamação intestinal, mas também de obesidade e diabetes entre outros. Importante, este protocolo para análise EE e microbiome pode ser utilizado para estudar o papel da patogênese microbiome através de uma variedade de doenças onde existem modelos de rato robusto que pode recapitular a doença humana.

Introdução

Estudos de enriquecimento ambiental (EE) utilizam parâmetros de complexo habitacional para afetar a estimulação social (habitação grandes gaiolas, grandes grupos de animais), estimulação cognitiva (cabanas, túneis, materiais de nidificação, plataformas) e atividade física (correr rodas). EE tem sido utilizada por muitos laboratórios para compreender os efeitos da atividade aumentada e melhorada de interações sociais e cognitivas na doença início e progressão usando uma ampla gama de modelos do rato, incluindo a alopécia induzida barbeiro, a doença de Alzheimer, Síndrome de Rett e doença tumoral e digestivo vários modelos^1,

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Utah.

1. delineamento e EE e configuração do controle gaiola

Nota: Para referência, um esboço do projeto experimental é ilustrado (Figura 1).

1. Configurar controle (NE) e gaiolas EE (Figura 2).
   1. Para configurar NE gaiolas, use gaiolas autoclavado controle convencional (tabela 1) que não poss....

Resultados

Vários estudos têm demonstrado que a prática da medicina mente-corpo melhora os resultados de saúde. Da mesma forma, em ratos, enriquecimento ambiental melhora os resultados, incluindo a melhoria de vida útil e tumor ferida reparo⁶. Portanto, um procedimento EE foi desenvolvido com o objectivo de definir o papel da microbiota este fenótipo enquanto primeiro normalizando o microbiome antes do início do experimento (Figura 1). Importante.......

Discussão

Este procedimento permite a análise da microbiota isolado de fezes de enriquecimento ambiental de normal ou tumor rolamento animais a seguir. Porque estas são as grandes experiências que envolvem a reprodução para obter muitos animais de sexos diferentes e de genótipos, normalizar o microbiome entre animais antes do início do experimento é essencial evitar a não-EE relacionados com efeitos na microbiome biodiversidade.

Para consistência entre condições NE e EE, o processo de criação é realizad.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Teklad Diets / Harlan Labs Chow	Harlan Labs	3980X	Ração irradiada padrão formulada pelo Dr. Mario Capecchi em colaboração com a Harlan Labs.
Roupa de cama Cell-Sorb Plus	Autoclave Fangman Specialties	82010	antes do uso.
Sistema de tatuagem AIMS para recém-nascidos	AIMS	NEO-9	https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Outros sistemas e tintas de tatuagem de grau animal podem ser usados com resultados semelhantes, incluindo o Aramis Micro Tattoo Kit.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Completo com gaiola, tampa do filtro AllerZone e sistema modular de entrega de dieta	Produtos de laboratório	82120ZF	Cada gaiola EE requer um de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF e 82101ZF, bem como dois de 82109ZF. A comida está apenas de um lado.
Zyfone One Cage 2100 Dispositivo de Enriquecimento de Vida Útil	Produtos de Laboratório	82109ZF	Cada gaiola EE requer um de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF e 82101ZF, bem como dois de 82109ZF. A comida está apenas de um lado.
Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Comprimento X 19-1/16" Largura X 7-3/4" Profundidade	Produtos de Laboratório	82100ZF	Cada gaiola EE requer um de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF, e 82101ZF, bem como dois de 82109ZF. A comida está apenas de um lado.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top	Produtos de Laboratório	82101ZF	Cada gaiola EE requer um de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF e 82101ZF, bem como dois de 82109ZF. A comida está apenas de um lado.
Túnel	Bio-Serv	K3323 ou K3332	Conecte gaiolas juntas e use para enriquecimento
Ilhós para conectar o túnel às gaiolas	Fabricado pela Oficina de Máquinas da Universidade de Utah	n/a	Certifique-se de que o material é resistente à mastigação e autoclavável
Roda fast-track	Bio-Serv	K3250 ou K3251	Use com iglu de rato e iglu de rato de chão
	Bio-Serv	K3328, K3570 ou K3327	Use com roda e piso Fast-track
Mouse Igloo floor	Bio-Serv	K3244	Use com mouse Igloo e Fast-Track
Mouse Hut	Bio-Serv	K3272, K3102 ou K3271
Crawl Ball	Bio-Serv	K3330 ou K3329
Bio-hut	Bio-Serv	K3352	Wood pulp hut usado para abrigar e aninhar
Filme adesivo	VWR	60941-072	Utilize para cobrir temporariamente o orifício perfurado em uma gaiola grande para evitar que os ratos escapem
Rack ventilado de fluxo laminar	Techniplast	Bio-C36	O armário que utilizámos neste estudo não é fornecido de momento. O Bio-C36 é muito semelhante.
Tubo Microfuge de 1,5 mL - livre de RNAse e DNAse	Qualquer fornecedor
QIAamp DNA Stool MiniKit	Qiagen	51504	Este kit fornece reagentes para 50 preparações de DNA. Tampão de lise fecal = ASL; Tampão de lise de cloreto de guanidínio = AL; Tampão de lavagem 1 com cloreto de guanidínio = AW1; Tampão de lavagem 2= AW2; Tampão de eluição com banho-maria EDTA = AE
(capaz de aquecer até 95)	Qualquer fornecedor		Para incubação de 94 graus de amostras de fezes para lisar células.
Banho-maria (capaz de aquecer a 70 graus)	Qualquer fornecedor		Para incubação de amostras de fezes a 70 graus
Etanol (200 provas)	Sigma Aldrich	E7023
Fluorômetro: Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33216
Qubit dsDNA kit de ensaio de amplo alcance	ThermoFisher Scientific	Q32850
EB Buffer ou 10 mM Tris pH 8.5	Qiagen	19086
Primers específicos para experimentos	Qualquer fornecedor
Grau de PCR água	Qualquer fornecedor
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix	Kapa Biosystems	KK2601	para amplificação de amplicon (1,25 mL permite 100 rxns).
Agarose para execução de géis de diagnóstico	Qualquer fornecedor
TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace	Agilent	5067-5583	TapeStation ou instrumentos Bioanalyzer são comuns em Núcleos de Genômica Institucional para analisar a qualidade da biblioteca. Alternativamente, um Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) pode ser usado.
Agencourt AMPure XP Grânulos Magnéticos	Beckman Coulter	A63880	Grânulos Magentic Para limpeza de PCR - 5 mL limparão 250 reações de PCR
Suporte magnético	Life Technologies	AM10027
Guia de Preparação da Biblioteca	Illumina		Illumina. Preparação da Biblioteca de Sequenciamento Metagenômico 16S: Preparando Amplicons de Genes de RNA ribossômico 16S para o Sistema Illumina MiSeq. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf.
Software Único de Indexação Dupla	Illumina	Illumina Experiment Manager	Disponível gratuitamente em: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html
Nextera XT 96 Index Kit	Illumina	FC-131-1002	Usado para adicionar códigos de barras a amplicons
MicroAmp Placa de reação óptica de 96 poços	Applied Biosystems/ThermoFisher	N8010560
Fixture de Placa de Índice TruSeq	Illumina	FC-130-1005
Vedação de placa transparente	Applied Biosystems /ThermoFisher	4360954	Applied Biosystems/ThermoFisher Filme adesivo Microamp
Sequenciamento por MiSeq com reagentes v3 e leituras duplas de 300 bp	Illumina	MS-102-3003
mAU/ml)	Qiagen	19131	Equivalente a 20 mg/ml de proteinase K. Fornecido com o kit QiaAmp
Ferramentas de análise de dados	QIIME	Qiime	instalação pode variar de acordo com o seu sistema e o site do QIIME descreve várias opções (http://qiime.org/install/install.html). Para este estudo, foi utilizado o pacote de software MacQIIME 1.9.1 (compilado por Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime
Etapa 13.2.	Método Qiime	FastQ Join	( http://code.google.com/p/ea-utils  ).   Para este estudo, foi utilizada a http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html de múltiplas extremidades pareadas. Aronesty, E. ea-utils: Ferramentas de linha de comando para processamento de dados de sequenciamento biológico. Análise de Expressão, Durham, NC. (2011).
Etapa 13.3.	Protocolo de coleta Qiime De-Novo OTU	http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html.
Etapa 13.3.1.		Abra Unidades Taxonômicas (OTUs) usando Uclust	Edgar, R.C. Pesquise e agrupe ordens de magnitude mais rápido que o BLAST. Bioinformática. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010).
Etapa 13.3.1.	Pynast	Pynast	Caporaso, J.G. et al. PyNAST: uma ferramenta flexível para alinhar sequências a um alinhamento de modelo. Bioinformática. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010).
Etapa 13.3.1.	Pynast	Pynast_Greengenes	DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, um banco de dados de genes 16S rRNA verificado por quimera e bancada de trabalho compatível com ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). A versão 13_8 de Greengenes foi utilizada neste estudo
13.3.1. Observação:	divididas múltiplas	Qiime	http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html.
13.3.1. Observação:	de OTUs de novo	Qiime	Pick http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html
Etapa 13.2.2.	Qiime	Crie um arquivo de mapeamento	http://qiime.org/documentation/file_formats.html.
Etapa 13.2.2.	Qiime Valide	um arquivo de mapeamento	http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html.
Etapa 13.3.3.	Qiime	Vincule a OTU à descrição da amostra para o arquivo de mapeamento	http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html.
Etapa 13.3.4.	Qiime	Resumir táxons por meio de parcelas	http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html.
Etapa 13.3.5.	Resumo da tabela	Bioma Qiime	http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html  Neste estudo, todas as amostras foram rarefeitas para 20.000 OTUs, seguidas de análise usando script de rarefação alfa no QIIME.