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Artigo de método

Um método para definir os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade de Microbiome cólon em um modelo de Tumor de cólon de Mouse

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DOI:

10.3791/57182

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28 de fevereiro de 2018

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1Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Huntsman Cancer Institute, University of Utah

Neste artigo

Resumo

Enriquecimento ambiental (EE) é um ambiente de alojamento dos animais que é usado para revelar os mecanismos que fundamentam as conexões entre o estilo de vida, estresse e doença. Este protocolo descreve um procedimento que utiliza um modelo do rato da tumorigênese cólon e EE para definir especificamente alterações na microbiota biodiversidade que pode afetar a mortalidade de animais.

Resumo

Vários estudos recentes ilustraram os efeitos benéficos de viver em um ambiente enriquecido em melhorar a doença humana. Em camundongos, enriquecimento ambiental (EE) reduz a tumorigênese ativando o sistema imunológico do mouse, ou afeta a sobrevivência animal do tumor rolamento, estimulando a resposta de reparação de ferida, incluindo diversidade microbiome melhorada, no microambiente do tumor. Desde que aqui é um procedimento detalhado para avaliar os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade da microbiome em um modelo de tumor de cólon do rato. Precauções em matéria de criação de animais e considerações para integração de colônia de genótipo e mouse animal são descritas, que acabará por afectar a biodiversidade microbiana. Atendendo a estas precauções pode permitir a transmissão de microbiome uniforme mais e consequentemente irá aliviar efeitos dependentes do não-tratamento que podem confundir as conclusões do estudo. Além disso, neste procedimento, as alterações da microbiota são caracterizadas usando 16S rDNA de sequenciamento de DNA isolado de fezes coletadas de cólon distal após enriquecimento ambiental a longo prazo. Desequilíbrio de microbiota do intestino está associado com a patogênese da doença e cólon câncer de inflamação intestinal, mas também de obesidade e diabetes entre outros. Importante, este protocolo para análise EE e microbiome pode ser utilizado para estudar o papel da patogênese microbiome através de uma variedade de doenças onde existem modelos de rato robusto que pode recapitular a doença humana.

Introdução

Estudos de enriquecimento ambiental (EE) utilizam parâmetros de complexo habitacional para afetar a estimulação social (habitação grandes gaiolas, grandes grupos de animais), estimulação cognitiva (cabanas, túneis, materiais de nidificação, plataformas) e atividade física (correr rodas). EE tem sido utilizada por muitos laboratórios para compreender os efeitos da atividade aumentada e melhorada de interações sociais e cognitivas na doença início e progressão usando uma ampla gama de modelos do rato, incluindo a alopécia induzida barbeiro, a doença de Alzheimer, Síndrome de Rett e doença tumoral e digestivo vários modelos1,2,3,4,5,6.

Vários modelos de mouse foram desenvolvidos para estudar a tumorigênese de cólon em ratos. Talvez o modelo mais bem definido é o mouse ApcMin . O mouse ApcMin foi desenvolvido no laboratório de William pomba em 19907e tem sido usado como um modelo do rato de mutações no gene APC que são comumente associados com câncer colorretal humano. Em contraste com os humanos abrigando mutações do APC , ApcMin ratos principalmente desenvolvem pequenos tumores intestinais, com ocorrência muito rara de tumores de cólon. No entanto, um alelo Tcf4Het com uma única mutação heterozigoto knockin-nocaute em Tcf4, aumenta vastamente tumorigênese cólon quando combinado com o alelo de ApcMin 8. Recentemente, este modelo de rato da tumorigênese cólon serviu para determinar os efeitos de EE no cólon tumorigênese6. No Bice et al. estudar, os efeitos fisiológicos e fenotípicos de EE nos machos e nas fêmeas de quatro linhas de mouse diferente (tipo selvagem (WT), Tcf4Het / + Apc+ +, Tcf4+ + ApcMin / +, e Tcf4 Het / + APCMin / +)) foram definidos. Talvez a descoberta mais interessante foi que EE aumenta significativamente a vida útil dos animais de rolamento de tumor de cólon tanto masculinos como femininos. Isto demonstrou que EE pode reduzir pelo menos alguns dos sintomas associados a tumorigênese do cólon e melhorar a saúde animal. Notavelmente, este prazo de vida melhorado nos machos não é um resultado direto da tumorigênese reduzido e em vez disso, estava relacionado com o início de uma resposta, incluindo melhoria microbiome biodiversidade6de cicatrização de feridas de tumor.

Vários estudos específicos de EE têm sido publicados com resultados interessantes. No entanto, do ponto de vista técnica, importantes resultados muitas vezes não são traduzíveis para outros laboratórios. Manutenção de metodologias EE idênticas entre diferentes laboratórios é um incrivelmente complexa, não só devido a dispositivos de enriquecimento e habitação usada, mas também roupa de cama, comida, ventilação, reprodução, genética, atividade em sala e do protocolo de animais requisitos, entre outros9,10,11. Um exemplo é a integração de animais, onde os animais devem ser estàvel integrados a colônia de rato, portanto normalizando a composição genética da dieta e plano de fundo, para evitar efeitos relacionados não-tratamento. Além disso, muitos estudos EE foram concluídos antes da realização da importância da microbiome na doença e a maneira que práticas de maneio comuns do mouse podem afetar a composição do intestino microbiome10,12.

Colocação de estratégia e animal de criação em EE pode aumentar o estresse se não for executado corretamente. Desde que estudos EE utilizam grandes números de animais machos e fêmeas e vários genótipos, instalação experimental pode ser difícil dada a exigência de animais de várias ninhadas para ser combinado. Portanto, uma criação e estratégia de desmame foi desenvolvido para permitir a combinação de animais desmamados com o genótipo de correto de ninhadas diferentes. A principal justificativa para isso foi para normalizar a microbiota entre ninhadas e reduzir o estresse, quando os animais foram transferidos para o ambiente experimental. A microbiome foi transmitido do dam10. Para fornecer diversidade microbiana para a colônia, fêmeas foram adquiridas de laboratórios de Jackson e integradas a colônia por um mês antes do início do experimento de10,9,12. Para normalizar mais microbiome biodiversidade entre os animais, as fêmeas foram co alojadas antes da reprodução. Após a criação, habitação comunal durante a criação e a capacidade de escape enfermagem filhotes melhoraram os níveis de estresse de cuidados maternos13,14, possivelmente promover microbiome normalização. Para evitar a não-EE relacionados com efeitos sobre a microbiome, esta habitação comunal de todos os animais experimentais impediu estresse adicional e luta que ocorreu quando combinando vários machos de ninhadas diferentes em uma gaiola experimental. Finalmente, um número igual de animais de todos os genótipos foram incluído nas gaiolas. Isto forneceu a oportunidade para a biodiversidade da microbiota melhorada através de genótipos e removido a contribuição de coprofagia (tendência do animal para consumir fezes) ou possíveis diferenças comportamentais de genótipo específico para o estudo global.

Este protocolo fornece uma estratégia que expande os estudos anteriores EE para incluir aspectos conhecidos de microbiome pesquisa, incluindo integração de colônia transmissão e animal microbiota para normalização da microbiota, para permitir mais uniforme microbiome populações entre animais experimentais. Atendendo a estas precauções é essencial devido à capacidade de não-tratamento relacionados microbiota diferenças para confundir as conclusões do estudo. Eliminação não-EE relacionadas com alterações da microbiota permitirá aos pesquisadores definir especificamente o papel do EE na composição da microbiota durante o desenvolvimento da doença e a progressão.

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Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Utah.

1. delineamento e EE e configuração do controle gaiola

Nota: Para referência, um esboço do projeto experimental é ilustrado (Figura 1).

  1. Configurar controle (NE) e gaiolas EE (Figura 2).
    1. Para configurar NE gaiolas, use gaiolas autoclavado controle convencional (tabela 1) que não possuem dispositivos de enriquecimento.
    2. Para gaiolas grandes, faça um furo por gaiola que é grande o suficiente para acomodar um túnel (Tabela de materiais) e anilha.
    3. Para configurar o filhote criação e gaiolas EE, conectar-se dois grandes gaiolas autoclavadas com um túnel seguro ilhó esterilizado e 2 plataformas esterilizadas para aumentar o espaço de chão (tabela 1). Para experiências EE, fornece esterilizado executando rodas, túneis, iglus, cabanas, bolas de rastreamento e ninhos de material dentro de jaulas dos EE.
    4. Coloque ambos os EE e NE gaiolas em um rack ventilado para fornecer a ventilação igual.
      Nota: Duas gaiolas grandes com 2 plataformas (tabela 1) permitem um máximo de 12 fêmeas grávidas por filhote criação instalação15 (ver Tabela de materiais, passo 3.2 em documento e tabela 2).
    5. Ratos de alimentação ad libitum irradiados chow padrão e água de osmose reversa autoclavados.
    6. Fornece os ratos com materiais de cama estéril.
      Nota: Todas as manipulações de vazias jaulas e gaiolas com animais devem ser feitas no bairro para evitar a contaminação. Para manipulação de gaiola gaiolas grandes, cobrir o buraco na gaiola com uma película adesiva.
  2. Prepare os animais para reprodução. Grupo casa 15 2 - meses de idade fêmeas em uma única gaiola grande (tabela 1) por 2 semanas antes do acasalamento. 2 - meses de idade machos littermate separadamente de casa 2 semanas antes do acasalamento.
    Nota: O número de fêmeas para reprodução é dependente da experiência e o número de animais necessários. Neste estudo, 15 mulheres foram utilizadas para obter 12 fêmeas conectadas, que é o máximo número permitido no filhote criação instalação descrita em 1.1.2 (tabela 2).
  3. Para reprodução, combine animais senhor e represa, 1 macho por 2 fêmeas. O primeiro cheque da manhã deve ser para tampões vaginais, que podem ser um sinal visual que os animais tem acasalado durante a noite.
    Nota: Casa de machos e fêmeas juntas, até que cada fêmea tem ligado. Um plugue vaginal pode ser identificado visualmente, se for externo.
    1. Para detectar os plugues interiorizadas, uma sonda é inserida na abertura vaginal e se o plug vaginal está presente, a sonda não é facilmente inserida (16; Veja a seção 4.3.6).
      Nota: Grave pela manhã que um plug é detectado como ½ dia, desde o acasalamento ocorreu no meio da noite.
    2. Uma vez que as fêmeas têm plugues vaginais, transferi-los para um grande filhote criação gaiola para Alojamento em grupo com outras fêmeas acasaladas (instalação na etapa 1.1.2 sem dispositivos de enriquecimento).
    3. Substitua Unidos fêmeas com novas fêmeas do grupo unmated alojado para acasalamento e continuar acasalamento para obter um número máximo de ninhadas em um período de 7 dias.
      Nota: Todos os animais devem ter uma data de entrega no prazo de 7 dias do outro.
  4. Permitir que as fêmeas grávidas dar à luz no grupo habitação para que todas as ninhadas são geradas dentro de um cachorro grande criação gaiola (instalação na etapa 1.1.2 sem dispositivos de enriquecimento).
    1. Manter o controle de datas de nascimento e números de filhote e começar os filhotes de genotipagem com 7 dias de idade.
      1. Tatuagem filhotes em seus dedos com 7 dias de idade com um código numérico para identificar os13,17.
      2. Limpe o dedo do pé com 70% de etanol e suavemente, inserir um dispositivo microtatuagem que contém tinta na superfície da pele paralela para o dedo do pé17 (ver Tabela de materiais).
      3. Recolha o tecido com tesoura para genotipagem das pontas da cauda de incisão um pequeno pedaço de tecido de 7 - dias velhos neonatos.
    2. Isolar o DNA genômico de tecidos e realizar PCR usando um método convencional de HotSHOT, conforme descrito em 18.
    3. Animais separados por sexo às 14-21 dias em gaiolas grandes com as mães.
      Nota: Certifique-se que os filhotes mais velhos são capazes de se alimentar de suas próprias, e que mais jovens filhotes continuam a enfermeira até a idade suficiente para se alimentar de suas próprias.
    4. De 21 a 28 dias, distribua animais machos e fêmeas separadamente pelo genótipo em ambientes NE ou EE, certificando-se de manter proporções iguais de cada genótipo por gaiola(Figura 2).
      Nota: Certifique-se de que o número total de animais permitidos em cada gaiola NE ou EE baseia-se o número máximo permitido pelo IACUC (tabela 2). As gaiolas NE tem no máximo 5 animais (tabela 2). Em gaiolas EE, a estimulação social, nada menos que 20 e com restrições de espaço, não mais de 41 animais devem ser permitidos na gaiola do EE (tabela 2).

2. fezes coleção com 16 semanas de idade

  1. Iniciar a coleta de fezes 1 a 2 dias antes do sacrifício e separadamente, recolher fezes no dia do sacrifício durante a dissecção usando ferramentas estéril.
    Nota: Coleta de fezes ao mesmo tempo 1-2 dias antes da coleta podem ajudar a evitar a perda de uma amostra devido à possibilidade de que não há fezes está presente no momento da coleta.
    1. Para recolher fezes de animais vivos, cuidadosamente a nuca do animal sobre uma gaiola limpa. Colete fezes usando pinça estéril em um tubo de microcentrífuga estéril.
      Nota: Animais tipicamente vão eliminar fezes quando imobilizados, que permite a coleta de fezes rápida directamente para um tubo de microcentrífuga estéril. Se um animal não defecam imediatamente quando imobilizados, coloque-o em uma gaiola limpa e esperar que o animal defecar (tipicamente até 1 h).
    2. Colete as fezes no dia do sacrifício.
      1. Para a eutanásia do animal, coloca o animal em uma redoma de vidro contendo um pequeno recipiente com uma bola de algodão embebida em isoflurano. Uma vez que a cessação da respiração é observada (geralmente depois de 2 min), colocar o animal em sua parte traseira para permitir a dissecação do cólon.
      2. Aplica o etanol a 70% no abdômen de rato.
      3. Levantar a pele anterior a abertura uretral com fórceps e use uma tesoura para cortar ao longo da linha mediana ventral até atingir a caixa torácica e corte da base da primeira incisão para cada perna. Dobre a pele e use uma tesoura para cortar a parede peritoneal no mesmo padrão.
      4. Use fórceps para apreender o cólon distal no ânus para dissecar e desanexar o cólon distal do reto. Enquanto puxa os dois pontos verticalmente com fórceps, use uma tesoura para cortar o mesentério para liberar o cólon.
      5. Corte logo abaixo do ceco cólon e colocá-lo no papel de filtro. Use a pinça para levantar a parte superior do tubo do cólon, abrindo o lúmen para permitir que um lado da tesoura aberta a ser inserido. Corte longitudinal, aberto de distal para proximal e angulações do cólon longitudinalmente.
      6. Colete fezes do cólon distal em um tubo de microcentrífuga estéril utilizando Pinças esterilizadas.
  2. Armazenar fezes em um tubo de microcentrífuga no-80 ˚ c até o tempo de isolamento de DNA bacteriano.
    Nota: No dia do sacrifício, além de fezes, colete outras amostras como sangue total, soro, plasma, normal e o tecido do tumor de cólon e intestino delgado, microssomas, tecido adiposo, etc. para abordar questões definidas no estudo.

3. genômica DNA isolado do tamborete

Nota: Utilize um kit comercial para isolar o DNA microbiano de fezes seguindo um protocolo de deteção do patógeno de fezes. Remova as amostras diretamente para o congelador ˚ c-80 e loja em gelo seco durante a pesagem.

  1. Até 220 mg de fezes de transferir para um tubo de microcentrífuga limpos contendo 1,4 mL de tampão de lise de fezes de temperatura (RT) (ver Tabela de materiais).
  2. Amostra de vórtice para 1 min homogeneizar completamente sólidos (Figura 2B). Aqueça a suspensão para 95 ˚ c por 5 min lisar todas as bactérias (incluindo bactérias gram-positivas).
  3. Amostras de vórtice durante 15 s e então centrifugar a 20.000 x g por 1 min para os sólidos de fezes de Pelotas. Transferi o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 2 mL. Adicionar um comprimido para cada amostra a absorver inibidores do PCR, vórtice até que o comprimido é dissolvido e incubar a amostra a RT por 1 min.
  4. Centrifugar a amostra a 20.000 x g por 3 min e transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 20.000 x g durante 3 min. 15 alíquota μL de proteinase K (20 mg/mL de caldo) em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Pipetar 200 µ l da amostra para o tubo contendo proteinase K.
  5. Adicionar 200 μL de tampão de lise de cloreto de guanidínio ao tubo, vórtice abundantemente durante 15 s (consulte a Tabela de materiais) e incubar a amostra em 70 ˚ c por 10 min. Adicionar 200 μL de etanol (96-100%) para os tubos e misture bem por num Vortex.
  6. Lugar de sílica com base em coluna de rotação em um tubo de coleta de 2 mL e aplicar as amostras para a coluna. Feche a tampa e centrifugar por 1 min a 20.000 x g.
  7. Transferir a coluna para um novo tubo de coleta de 2 mL e adicionar 500 μL de tampão de lavagem 1 para a coluna, a coluna e centrifugar por 1 min em 20.000 x g. transferência da coluna para um novo tubo de coleta de 2 mL do tampão e adicionar 500 μL de tampão de lavagem 2 à coluna , feche a tampa e centrifugar 20.000 x g por 3 min.
  8. Com a tampa fechada, transferir a coluna para um novo tubo de coleta de 2 mL e centrifugar para um adicional 1 min a 20.000 g x para remover o tampão de lavagem residual. Transferir a coluna para um 1,5 mL rotulado tubo de microcentrífuga e eluir amostra adicionando 200 μL de tampão de eluição contendo EDTA para a membrana (ver Tabela de materiais).
  9. Feche a tampa e incubar a RT por 1 min. centrifugar a amostra por 1 min em 20.000 x g. descartar a coluna.

4. determinação da concentração DNA e preparação da amostra para o PCR

Nota: Utilizar um dados e um ensaio fluorescente dsDNA comercialmente disponíveis para determinar a concentração de DNA genômica em cada amostra (ver Tabela de materiais). O corante fluorescente deve ligar o ADN encalhado dobro especificamente.

  1. Preparar uma diluição de 1: 200 de cada amostra (1 µ l de cada amostra em 199 mistura de mestre dsDNA µ l) e um 01:50 diluição das normas. Analise em um dados usando a configuração de dsDNA.
    Nota: Um alto volume de DNA na PCR pode ser inibitório, portanto, o volume de DNA utilizado não deve ser mais do que 10% do volume final do PCR. Um dados permite uma medição precisa de DNA na amostra, como só DNA ligado para o corante fluorescente será fluorescem, eliminando a possível contribuição de contaminantes para a concentração final de DNA calculado. Este nível de quantificação exata é essencial para a aplicação de sequenciamento a jusante.
  2. Prepare modelos PCR diluídos a 5 ng / µ l com o volume apropriado de 10mm Tris, pH 8,5 existências de modelo de trabalho de cada amostra.
  3. Armazenar as amostras a-20 ° C.

5. projeto Primers para as 16 desejado regiões V

  1. Desenho de primers para amplificar seletivamente regiões desejadas V 16S rRNA.
  2. Analise as primeiras demão com sonda Match, desde o projeto de banco de dados Ribosomal19, para determinar a taxa de acertos aproximada para diversos filos.
    Nota: Para as regiões V1-V3, o estudo atual usado publicou cartilhas Bosshard frente20, que se ligam na posição 8 dentro da região V1 e 533 reversa,21, que vincula-se em posição 533 dentro da região V3. As primeiras demão devem incluir sequências de adaptador saliência para indexação.
  3. Ao projetar primers, inclua sequências de adaptador nas extremidades 5' de cada primer, como recomendado por 16S metagenomics sequenciamento biblioteca preparação22 (tabela 3).
  4. Sintetiza estas primeiras demão grande com purificação de cartucho. Reconstituir as primeiras demão dessecadas e diluir um PCR estoque de 1 μM a trabalhar em 10 mM Tris, pH 8,5.

6. Amplicon PCR para amplificar a região (ões) V com saliência adaptador sequências anexado 22

  1. Configure o amplicon mistura de reação de PCR conforme descrito na tabela 4.
  2. Coloque um adesivo selo de placa PCR claro sobre a chapa e executar o amplicon PCR usando os parâmetros na tabela 5.
  3. (Opcional) Executar o amplicon produtos do PCR em um gel de agarose ou um ensaio de DNA de alta sensibilidade que permite uma medição quantitativa do amplicon tamanho (ver Tabela de materiais).
    Nota: O amplicon tamanho deste estudo é 550 bp(Figura 3).

7. PCR limpeza usando magnético contas 22

  1. Centrifugue a placa do PCR amplicons rapidamente a 1.000 x g, durante 1 min coletar condensação.
    Nota: Tiras de tubo PCR podem ser usadas em vez de placas PCR para minimizar a contaminação. Descartar as tampas de tubo e nunca reutilizar.
  2. Vórtice os grânulos magnéticos uniformemente dispersá-los e adicionar 20 μL de magnético contas para cada amplicon PCR, depois Pipetar todo o volume acima e para baixo lentamente 10 vezes.
  3. Incube a RT por 5 min. lugar a placa do PCR em um carrinho magnético por 2 min até esferas magnéticas são recolhidas e o sobrenadante é claro. Remover e descartar o sobrenadante.
  4. Grânulos de lavagem com 200 μL fresco 80% etanol enquanto a placa do PCR é na magnético ficar e incube por 30 s em RT sobre o suporte magnético. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
  5. Repeti a lavagem pela segunda vez. Agora, use uma ponta de pipeta fina para remover qualquer etanol residual dos poços e permitir que o ar de secagem por 10 min.
  6. Retire a placa do PCR do suporte magnético e adicionar 52,5 μL de pH de 10 mM Tris 8.5 a cada poço. Pipetar acima e para baixo 10 vezes para suspender contas e incubar a temperatura ambiente por 2 min.
  7. Transferi a placa do PCR para o suporte magnético para coletar esferas magnéticas e transferir 50 µ l do sobrenadante para um prato limpo de PCR. Coloque um adesivo selo de placa PCR claro sobre a chapa e armazenar a-20 ˚ c por até uma semana.

8. elaboração de um esquema de placa para índice do PCR

Nota: Para gerar uma biblioteca de V1-V3, um segundo PCR foi executada com um índice kit (veja a Tabela de materiais). Um esquema de indexação padrão foi usado para mapear as combinações de índice exclusivo duplo para cada amostra (Figura 3B e 23).

  1. Certifique-se de que cada amostra tem uma combinação única das 2 primeiras demão de índice (ou seja, dupla indexação).

9. Execute índice PCR para anexar os códigos de barras para as sequências de adaptador como descrito 22 .

  1. Transfira 2,5 μL de amplicons PCR (amplicons limpo) para um novo 96 placa bem e coloque em um dispositivo elétrico placa de índice para ajudar na indexação.
  2. Organizar o índice 1 e índice 2 primeiras demão, como no exemplo do gráfico prato preparado (Figura 3B).
    Nota: Pistas visuais são fornecidas para evitar confusões primeira demão: tubos de índice 2 da primeira demão devem ter capuzes brancos e uma solução clara, enquanto tubos de índice 1 da primeira demão devem ter solução amarela e laranja tampões.
  3. Monte o índice de reação de PCR Mix conforme descrito na tabela 6. Misture pipetando acima e para baixo 10 vezes. Cubra com um adesivo selo de placa PCR claro e centrifugar para coletar a x 1.000 g à temperatura ambiente durante 1 min.
  4. Execute o índice do PCR usando os parâmetros na tabela 7.

10. purificar biblioteca Final do PCR

Nota: Este PCR limpar é idêntico ao passo 7 acima e usa grânulos magnéticos para realizar PCR Clean-Up do índice PCR22.

  1. Centrifugue a placa do PCR da etapa 10 rapidamente a 1.000 x g, durante 1 min coletar condensação.
  2. Vórtice os grânulos magnéticos uniformemente dispersá-los, em seguida, adicionar 20 μL de magnético contas para cada amplicon PCR, pipetar então todo o volume subindo e descendo lentamente 10 vezes para misturar.
  3. Incube a RT por 5 min.
  4. Placa de PCR lugar num suporte magnético por 2 min até esferas magnéticas são coletados e sobrenadante é clara. Remover e descartar o sobrenadante.
  5. Grânulos de lavagem com 200 μL fresco 80% etanol enquanto a placa do PCR é na magnético ficar e incube por 30 s na temperatura de quarto no stand magnético. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
  6. Repeti a lavagem pela segunda vez.
  7. Após a segunda lavagem, use uma ponta de pipeta fina para remover qualquer etanol residual dos poços e permitir que o ar de secagem por 10 min.
  8. Retire a placa do PCR do suporte magnético e adicionar 52,5 μL de pH de 10 mM Tris 8.5 a cada poço. Pipetar acima e para baixo 10 vezes para suspender contas e incubar a temperatura ambiente por 2 min.
  9. Transferi a placa do PCR para o suporte magnético para coletar esferas magnéticas e transferir 50 µ l do sobrenadante para um prato limpo de PCR. Coloque um adesivo selo de placa PCR claro sobre a chapa e armazenar a-20 ˚ c por até uma semana.
  10. (Opcional) Executar os produtos de PCR de índice em um gel de agarose ou um ensaio de DNA de alta sensibilidade que permite uma medição quantitativa do amplicon tamanho (ver Tabela de materiais).
    Nota: O tamanho da biblioteca indexado final deste estudo foi 668 bp (Figura 3C-D).

11. quantificar, normalizar e piscina as bibliotecas indexadas para sequenciamento

  1. Determinar a concentração de DNA de cada amostra com um dados e um kit de ensaio fluorescente dsDNA (ver tabela de materiais).
    1. Prepare uma diluição de 1: 200 da amostra (1 µ l de cada amostra em 199 µ l dsDNA mestre mix, que inclui o buffer e reagente) para cada uma das amostras indexadas e padrões (190 mistura de mestre dsDNA µ l e 10 µ l do padrão). Analise em um dados usando a configuração de dsDNA.
  2. Após o cálculo da concentração de DNA, normalize as bibliotecas calculando o tamanho médio da biblioteca. Fazer isto somando V amplicon tamanho de primers, comprimentos de índice e comprimentos de adaptador e ver os produtos de gel de agarose para ter a certeza de que o tamanho real é semelhante para o tamanho calculado (consulte aFigura 3C, 22).
    1. Como alternativa, utilize um ensaio de DNA de alta sensibilidade que permite uma medição quantitativa de DNA integridade amplicon tamanho e concentração (tabela de materiais, Figura 3D).
      Nota: Neste estudo, o tamanho médio da biblioteca foi calculado com base na soma de comprimentos de adaptador, comprimentos de índice e tamanho de V1-V3 amplicons de cartilhas. O tamanho médio foi 668 bp.
    2. As concentrações das amostras são normalizadas usando a fórmula no quadro 8.
  3. Diluir as amostras 4 nM e piscina 5 μL de cada amostra 4-nM em um único tubo para sequenciamento.

12. a biblioteca usando um sistema de sequenciamento de próxima geração de sequenciar e analisar os dados

  1. Sequência da biblioteca.
    Nota: Para este estudo, o núcleo de genômica Universidade de Utah, alta taxa de transferência realizada biblioteca desnaturação e sequenciamento de amostra (conforme descrito em 6,,22).
  2. Analisa os dados.
    Nota: Para separar dados de amostras em pool, índice leituras foram identificadas e separadas (conforme descrito em 22).
  3. Gerar arquivos de FASTQ e utilizar isto para análise de dados subsequentes.

13. analisar dados sequenciados da biblioteca de amplicons 16S

Nota: Esta etapa é executada conforme descrito no Bice et al., 20176.

  1. Instalar as ferramentas de análise de dados livremente disponíveis (ver Tabela de materiais; 24).
  2. Junte demultiplexed fastq arquivos de dados sequenciais (conforme descrito em25,,26). Descarte todas as sequências de montagem.
  3. Realize análises seguindo uma de novo aberto taxonômica unidade (OTU) escolher o protocolo (como descrito em 27).
    1. Bin sequências em um arquivo único fastq por sampleID e sequências de grupo com 97% ou maior similaridade em OTUs, conforme descrito em 28. Alinhe sequências representativas do núcleo definido com comprimento de sequência mínima de 150 e 75% por cento identidade29,30. Atribua a taxonomia como descrito28.
      Nota: Amostras podem ser guardadas e analisaram31, seguido por atribuição taxonômica e OTU tabela construção32.
    2. Crie um arquivo de mapeamento que identifica nomes descritivos e características de amostras para vincular a identificação da amostra e validar o arquivo de mapeamento33,34.
    3. Fazer uma rede OTU links OTUs para descrições de amostra usando um arquivo de mapeamento35.
    4. Calcule resumos de taxonomia em termos de abundância relativa por Resumindo táxons através de parcelas de36.
    5. Explore a diversidade alfa de amostras na profundidade de sequenciamento de uniforme adequada para amostras. Para definir a profundidade apropriada para diversidade alfa, resuma contagens totais observadas em cada amostra, usando o comando de resumir-tabela de bioma, conforme descrito em 37.

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Resultados

Vários estudos têm demonstrado que a prática da medicina mente-corpo melhora os resultados de saúde. Da mesma forma, em ratos, enriquecimento ambiental melhora os resultados, incluindo a melhoria de vida útil e tumor ferida reparo6. Portanto, um procedimento EE foi desenvolvido com o objectivo de definir o papel da microbiota este fenótipo enquanto primeiro normalizando o microbiome antes do início do experimento (Figura 1). Importante...

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Discussão

Este procedimento permite a análise da microbiota isolado de fezes de enriquecimento ambiental de normal ou tumor rolamento animais a seguir. Porque estas são as grandes experiências que envolvem a reprodução para obter muitos animais de sexos diferentes e de genótipos, normalizar o microbiome entre animais antes do início do experimento é essencial evitar a não-EE relacionados com efeitos na microbiome biodiversidade.

Para consistência entre condições NE e EE, o processo de criação é realizad...

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Divulgações

Os autores declaram que têm não há conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos B. Dalley no núcleo genómica da Universidade de Utah para sequenciamento de biblioteca e K. Boucher no núcleo para conselhos de estatístico e acesso a estes núcleos técnicos suportado pelo prêmio do National Cancer Institute P30 CA042014 Bioestatística da Universidade de Utah. O projeto descrito foi apoiado pelo National câncer Institute subsídios P01 CA073992 e K01 CA128891 e o Huntsman Cancer Foundation.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Teklad Diets / Harlan Labs ChowHarlan Labs3980XRação irradiada padrão formulada pelo Dr. Mario Capecchi em colaboração com a Harlan Labs.
Roupa de cama Cell-Sorb PlusAutoclave Fangman Specialties82010antes do uso.
Sistema de tatuagem AIMS para recém-nascidosAIMSNEO-9https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Outros sistemas e tintas de tatuagem de grau animal podem ser usados com resultados semelhantes, incluindo o Aramis Micro Tattoo Kit.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Completo com gaiola, tampa do filtro AllerZone e sistema modular de entrega de dietaProdutos de laboratório82120ZFCada gaiola EE requer um de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF e 82101ZF, bem como dois de 82109ZF. A comida está apenas de um lado.
Zyfone One Cage 2100 Dispositivo de Enriquecimento de Vida ÚtilProdutos de Laboratório82109ZFCada gaiola EE requer um de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF e 82101ZF, bem como dois de 82109ZF. A comida está apenas de um lado.
Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Comprimento X 19-1/16" Largura X 7-3/4" ProfundidadeProdutos de Laboratório82100ZFCada gaiola EE requer um de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF, e 82101ZF, bem como dois de 82109ZF. A comida está apenas de um lado.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter topProdutos de Laboratório82101ZFCada gaiola EE requer um de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF e 82101ZF, bem como dois de 82109ZF. A comida está apenas de um lado.
TúnelBio-ServK3323 ou K3332Conecte gaiolas juntas e use para enriquecimento
Ilhós para conectar o túnel às gaiolasFabricado pela Oficina de Máquinas da Universidade de Utahn/aCertifique-se de que o material é resistente à mastigação e autoclavável
Roda fast-trackBio-ServK3250 ou K3251Use com iglu de rato e iglu de rato de chão
Bio-ServK3328, K3570 ou K3327Use com roda e piso Fast-track
Mouse Igloo floorBio-ServK3244Use com mouse Igloo e Fast-Track
Mouse HutBio-ServK3272, K3102 ou K3271
Crawl BallBio-ServK3330 ou K3329
Bio-hutBio-ServK3352Wood pulp hut usado para abrigar e aninhar
Filme adesivo VWR60941-072Utilize para cobrir temporariamente o orifício perfurado em uma gaiola grande para evitar que os ratos escapem
Rack ventilado de fluxo laminarTechniplastBio-C36O armário que utilizámos neste estudo não é fornecido de momento. O Bio-C36 é muito semelhante.
Tubo Microfuge de 1,5 mL - livre de RNAse e DNAseQualquer fornecedor
QIAamp DNA Stool MiniKitQiagen51504Este kit fornece reagentes para 50 preparações de DNA. Tampão de lise fecal = ASL; Tampão de lise de cloreto de guanidínio = AL; Tampão de lavagem 1 com cloreto de guanidínio = AW1; Tampão de lavagem 2= AW2; Tampão de eluição com banho-maria EDTA = AE
(capaz de aquecer até 95)Qualquer fornecedorPara incubação de 94 graus de amostras de fezes para lisar células.
Banho-maria (capaz de aquecer a 70 graus)Qualquer fornecedorPara incubação de amostras de fezes a 70 graus 
Etanol (200 provas)Sigma AldrichE7023
Fluorômetro: QubitThermoFisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA kit de ensaio de amplo alcanceThermoFisher ScientificQ32850
EB Buffer ou 10 mM Tris pH 8.5Qiagen19086
Primers específicos para experimentosQualquer fornecedor
Grau de PCR águaQualquer fornecedor
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix Kapa BiosystemsKK2601para amplificação de amplicon (1,25 mL permite 100 rxns).
Agarose para execução de géis de diagnósticoQualquer fornecedor
TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape TraceAgilent5067-5583TapeStation ou instrumentos Bioanalyzer são comuns em Núcleos de Genômica Institucional para analisar a qualidade da biblioteca. Alternativamente, um Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) pode ser usado.
Agencourt AMPure XP Grânulos MagnéticosBeckman CoulterA63880Grânulos Magentic Para limpeza de PCR - 5 mL limparão 250 reações de PCR
Suporte magnéticoLife TechnologiesAM10027
Guia de Preparação da BibliotecaIlluminaIllumina. Preparação da Biblioteca de Sequenciamento Metagenômico 16S: Preparando Amplicons de Genes de RNA ribossômico 16S para o Sistema Illumina MiSeq. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf.
Software Único de Indexação DuplaIlluminaIllumina Experiment ManagerDisponível gratuitamente em: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html
Nextera XT 96 Index KitIlluminaFC-131-1002Usado para adicionar códigos de barras a amplicons
MicroAmp Placa de reação óptica de 96 poçosApplied Biosystems/ThermoFisherN8010560
Fixture de Placa de Índice TruSeqIlluminaFC-130-1005
Vedação de placa transparenteApplied Biosystems /ThermoFisher4360954Applied Biosystems/ThermoFisher Filme adesivo Microamp
Sequenciamento por MiSeq com reagentes v3 e leituras duplas de 300 bpIlluminaMS-102-3003
mAU/ml)Qiagen19131Equivalente a 20 mg/ml de proteinase K. Fornecido com o kit QiaAmp
Ferramentas de análise de dadosQIIMEQiimeinstalação pode variar de acordo com o seu sistema e o site do QIIME descreve várias opções (http://qiime.org/install/install.html). Para este estudo, foi utilizado o pacote de software MacQIIME 1.9.1 (compilado por Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime
Etapa 13.2.Método QiimeFastQ Join ( http://code.google.com/p/ea-utils  ).   Para este estudo, foi utilizada a http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html de múltiplas extremidades pareadas. Aronesty, E. ea-utils: Ferramentas de linha de comando para processamento de dados de sequenciamento biológico. Análise de Expressão, Durham, NC. (2011).
Etapa 13.3.Protocolo de coleta Qiime De-Novo OTUhttp://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html.
Etapa 13.3.1.Abra Unidades Taxonômicas (OTUs) usando UclustEdgar, R.C. Pesquise e agrupe ordens de magnitude mais rápido que o BLAST. Bioinformática. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010).
Etapa 13.3.1.PynastPynastCaporaso, J.G. et al. PyNAST: uma ferramenta flexível para alinhar sequências a um alinhamento de modelo. Bioinformática. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). 
Etapa 13.3.1.PynastPynast_GreengenesDeSantis, T.Z. et al. Greengenes, um banco de dados de genes 16S rRNA verificado por quimera e bancada de trabalho compatível com ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). A versão 13_8 de Greengenes foi utilizada neste estudo
13.3.1. Observação: divididas múltiplasQiimehttp://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html.
13.3.1. Observação: de OTUs de novoQiimePick http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html 
Etapa 13.2.2.QiimeCrie um arquivo de mapeamentohttp://qiime.org/documentation/file_formats.html.
Etapa 13.2.2.Qiime Valideum arquivo de mapeamentohttp://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html.
Etapa 13.3.3.QiimeVincule a OTU à descrição da amostra para o arquivo de mapeamentohttp://qiime.org/scripts/make_otu_network.html.
Etapa 13.3.4.QiimeResumir táxons por meio de parcelashttp://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html.
Etapa 13.3.5.Resumo da tabelaBioma Qiimehttp://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html  Neste estudo, todas as amostras foram rarefeitas para 20.000 OTUs, seguidas de análise usando script de rarefação alfa no QIIME.
Kit de Controle PhiX Proteinase K (600 Software A Bibliotecas do Roteiro do

Referências

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Modelo de Tumor em CamundongoSequenciamento de rDNA 16SIsolamento de DNA MicrobialColeta de FezesTumorogêneseMicrobiota IntestinalManejo Animal
Um método para definir os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade de Microbiome cólon em um modelo de Tumor de cólon de Mouse
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