Method Article

Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

DOI:

10.3791/57188

⸱

May 31st, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Sackler School of Medicine, Tel-Aviv University, 2Department of Pathology, School of Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Células dendríticas (DC) são populações de células heterogêneas que diferem em seus marcadores de membrana celular, padrões de migração e distribuição e em sua apresentação de antigénios e capacidades de ativação de células T. Desde que a maioria das vacinas de modelos experimentais de tumor exigem milhões de DC, são amplamente isolados da medula óssea ou baço. No entanto, estes DC significativamente diferem sangue e tumor DC nas suas respostas aos complexos imunes (IC) e presumivelmente a outros receptores de lectina Syk-acoplado. Importante, dada a sensibilidade da DC para moléculas associadas a perigo, a presença de endotoxinas ou anticorpos que crosslink receptores de ativação em um do isolando passos poderia resultar de escorva DC e, assim, afetar os parâmetros, ou pelo menos a dosagem, necessária para ativá-los. Portanto, aqui descrevemos um protocolo detalhado para isolar MoDC de sangue e tumores, evitando sua ativação prematura. Além disso, um protocolo é fornecido para ativação MoDC com tumor IC e suas análises subsequentes.

Introduction

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Desde a sua descoberta, as células dendríticas (DC) têm sido um foco de pesquisa extensa devido à sua capacidade única de inclinar a diferenciação de células T1. Ao longo das últimas décadas, buscou-se um esforço de pesquisa extensiva definir os vários subconjuntos de DC e sua função durante a progressão do tumor e imunidade 2. DCs são compostas de populações de células heterogêneas que diferem entre si em seus receptores de reconhecimento de padrões, distribuição tecidual, e migratórias e antígeno apresentação recursos3,4,5. Comparado a outros subconjuntos de DC, DC derivados de monócitos (MoDC) são muito mais abundante em tumores e podem ser facilmente gerados a partir de circulação ou tumor infiltrando monócitos6,7. Portanto, muitos ensaios clínicos procuram se aproveitar de sua prevalência relativa baseiam-se na manipulação in vivo e ex vivo de MoDC autólogo para eliciar a célula T imunidade 8,9.

Da mesma forma, a vacinação baseada em DC de modelos experimentais de tumor requer injeções seriais de 2-3, 5-7 dias de diferença, de 1-2 x 106 registrado DC pulsado com antígenos do tumor. Portanto, para alcançar este grande número de DC, a maioria dos estudos de rato ter usado principalmente MoDC cultivada de precursores da medula óssea (BM) em GM-CSF para dias 7-9 (IL-4 não é necessário na configuração do mouse)10,11. No entanto, dado que nocaute de GM-CSF, os ratos têm total normal DC compartimento 12,13e dado as populações mistas obtidas essa cultura,14 a relevância fisiológica destes DC tem sido posta em causa.

Alternativamente, a DC pode ser rotineiramente isolado de células de baço. No entanto, DC compreendem apenas cerca de 0,3-0,8% de células de baço total (resultando em cerca de 7 x 105 DC/baço) e destas células, apenas CD103+ DC e MoDC podem migrar para órgãos linfoides. Desde que MoDCs representam cerca de 10-15% de esplênica DC populações15,16, a maioria dos protocolos de isolamento rendem aproximadamente 1 x 105 MoDC por baço. Expansão de MoDC pode ser alcançado através da injeção de células transfectadas do B16 que secretam GM-CSF, resultando em um aumento de 100 vezes no esplênica MoDC17. No entanto, o uso de MoDC para o desenvolvimento de vacinas de DC é limitado, desde que este procedimento não pode ser feito em seres humanos e os obtidos MoDC já altamente são ativados.

Além de obter números adequados de DC, outro desafio para o desenvolvimento de vacinas DC eficazes contra células cancerígenas autólogas envolve a falta de sinais de perigo suficiente no cenário de tumor para ativar completamente DC. Indução de sinais co-estimulatória geralmente é conseguida através da ativação de receptores de reconhecimento de padrões (PRR), ou lectina tipo c sinalização percursos18,19,20,21. Uma abordagem mais para ativar DC explora sua capacidade para assumir a antígenos através de interações com receptores de superfície Fcγ (FcγR). Com efeito, um número de manuscritos importantes têm demonstrado que a injeção de MoDC de precursores BM ativado com tumor-IgG IC pode impedir o crescimento do tumor em configurações profiláticas e pode levar à erradicação dos tumores estabelecido22,23 .

Em dois trabalhos recentes, Carmi et al descobriram que em contraste com BMDC e baço DC, MoDC pelo sangue e tumores não pode responder a IgG IC sem estímulos adicionais. Isto foi encontrado para ser devido à presença de altos níveis intracelulares de fosfatases de tirosina regulação FcγR sinalização24,25. Definindo um ponto de controle crítico no DC, este trabalho forneceu uma visão importante sobre os requisitos de vacinação bem sucedida baseada em DC. A exigência de estímulos adicionais habilitar FcγR, sinalização e presumivelmente sinalização de outros receptores de lectina utilizando uma cascata de fosforilação semelhante, assim ressalta a necessidade de evitar a escorva da DC durante seu isolamento.

Portanto, o presente protocolo descreve o isolamento de MoDC do sangue e tumores, que diferem marcadamente de BM e baço DC, e destaca as precauções vale a pena considerar durante o processo.

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Protocol

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Os protocolos abaixo referem-se ao isolamento do mouse MoDC, no entanto, os princípios globais podem se aplicar a outras células de subconjuntos de DC, também. 12 - camundongos C57Bl/6j de 16 semanas de idade foram mantidos em uma associação americana para a facilidade de animais credenciados – acreditação do cuidado de Animal de laboratório. Todos os protocolos foram aprovados pela Universidade de Stanford e Tel-Aviv University institucional Cuidado Animal e Comitê de uso.

1. isolamento de Tumor associado DC derivados de monócitos

  1. Em uma capa de fluxo laminar, remover tumores de CO2 eutanásia de ratos e coloque tumores em meio RPMI sem soro fetal bovino (FBS).
    Nota: É altamente recomendável para raspar os ratos e pulverizá-los com etanol a 70% antes de retirar os tumores, para minimizar possíveis contaminações partir da pele. Certifique-se de que o tumor não exceda 25-40 mm2 , desde que os tumores maiores têm menos DC que tendem a ser frágil e propenso a sofrer a morte celular. Se um número maior de DC é necessários, cada rato pode ser injetado com células de tumores em vários locais.
  2. Sob uma capa laminar estéril, pique os tumores usando tesouras de cirurgia em pedaços pequenos (aproximadamente 1 x 1 mm2).
    1. Adicionar todos os fragmentos de tumor de um rato em um 30 mL tubo estéril de fundo plano com barras de agitação magnética, que contém 5 mL de Hank está equilibrada solução salina (HBSS), 2 mg/mL IV de colagenase e 0,01 mg/mL DNase eu.
      Cuidado: Pilhas Myeloid produzem energia através de glicosilação, mesmo em estado estacionário. Portanto, a única mídia de uso que contém glicose (por exemplo, HBSS, RPMI e DMEM), como fome de glicose para tão pouco como 10-15 min resultará em morte celular e apoptose dentro de 24 h. uso somente uma colagenase endotoxina baixa IV, como colagenase é produzido por Gram-positivas bactérias (Clostridium histolyticum).
  3. Agita-se a cerca de 200-400 rpm numa incubadora 37 oC com um agitador magnético para 20-30 min.
  4. Adicionar 5 mL de mídia completa e ressuspender vigorosamente.
  5. Filtre as células através de um filtro de célula de 70 µm. Centrifugar a 4 oC 400 rcf, por 5-10 min para as células de Pelotas.
    Cuidado: Não tente isolar as células diretamente após digestão enzimática, como alguns tumores são necróticos e contêm quantidades relativamente grandes de restos celulares ou matriz extracelular. Aplicam-se as células em 15% médio gradiente de densidade para obter apenas as células.
  6. Suspenda o 9 mL do meio de gradiente de densidade com 1 mL de PBS de x 10 para ajustar a pressão osmótica e para obter a solução-mãe de Percoll 100%. Mistura 1,5 mL densidade gradiente médio estoque solução com 8,5 mL HBSS e misture vigorosamente com tumor derivado centrifugado. Suavemente da camada 2 mL de DMEM na parte superior 15% densidade gradiente médio e centrifugar rcf 400 por 20 min em temperatura ambiente. Descarte os sobrenadantes, como as células formarão um sedimento no fundo do tubo.
    1. Lave as células peletizadas duas vezes por re-suspensão-los em 10 mL HBSS contendo 2% FBS, 1% penicilina/estreptomicina e 10 mM EDTA (Buffer de isolamento) e centrifugar 4 óC 400 rcf por 5-10 min para as células de Pelotas.
    2. Contar as células em um hemocytometer usando trypan azul sob um microscópio de luz.
  7. Ressuspender as células de 1 x 108 isoladamente 1 mL buffer e incube-os a 4 oC com 30 μL de CD11b+ conjugado magnéticos grânulos por 15 min.
    Atenção: Evite o uso de grânulos CD11c-conjugados, pois isso irá ativar o DC e induzir a morte celular. Não tente bloquear FcγRII e FcγRIII com anticorpos anti-CD16/32. Bloqueando os anticorpos ligate FcγR e induzir forte fosforilação de quinases mapa e prime o DC.
    1. Remover os excesso grânulos desvinculados pela adição de 9 mL de tampão de isolamento e centrífuga células no rcf 400 durante 5-10 minutos a 4oC.
  8. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de tampão de isolamento. Aplicam-se as células em uma coluna magnética pré-lavadas. Lave a coluna duas vezes com 3 mL de tampão de isolamento.
    1. Remova a coluna do ímã. Pipete 6 mL de tampão de isolamento para a coluna e expulsar as células magneticamente-etiquetadas em um tubo de coleta estéril, empurrando o êmbolo. Centrífuga de células no rcf 400 durante 5-10 minutos a 4 oC.
    2. Ressuspender as células em 100 μL por 1 x 107 células e manchar com os seguintes anticorpos conjugados fluoróforo: Linage negativo (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI e Ly6G), MHCII, Ly - 6C.
  9. Classificar as células por retenção de pequenas células, usando dispersão lateral (SSC) e encaminhar a dispersão (FSC) e cultura em completo suplementado com 5 ng/mL, GM-CSF. Incubar as células durante 1 hora a 3 7 oC para permitir que os macrófagos aderir a placa. Em seguida, transferir o frouxamente e células não-aderentes para um novo prato de cultura.
    Nota: O Mouse MoDC são definidos como CD11b+/CD11c+/MHCIIOi/Ly6Clo/int 7,26,27. Expressão de Ly6C pode variar drasticamente entre modelos de tumor e em alguns modelos (por exemplo, LMP) MoDCs falta completamente a expressão de Ly6C. Em geral, um tumor de3 B16F10 100 mm normalmente contém 5 x 104 de DC, resultando em aproximadamente 4-5 x 106 células total. Destas células, 10-15% são células do sistema imunológico e 8-10% são MoDC. Aumentar os números de DC pode ser alcançado através da injeção de ratos com tumores em vários locais. Apenas pequenas células SSC/FCS de espécie, como outras células mieloides podem expressar marcadores como CD11c e Ly6C.
    Opcional: Classificar o tumor infiltrando monócitos como pequenas células SSC/FSC que expressam Ly6COi e são negativos para MHCII. Depois disso, cultura de monócitos em vitro com 50 ng/mL GM-CSF para obter DC.

2. isolamento de DC derivados de monócitos do sangue periférico

Nota: Desde que MoDCs maduros são relativamente raros em sangue de rato, o protocolo abaixo refere-se a sua derivação em vitro de monócitos classificados.

  1. Para aumentar os níveis de monócitos no sangue, anestesiar os ratos com 4% de isoflurano e injetá-las por via subcutânea (s.c.) com 1 μg de GM-CSF em 50 µ l de PBS.
  2. Após 1-2 h, sacrifica os ratos usando CO2.
    Cuidado: Não sacrifica os ratos por deslocamento cervical, porque isso poderá provocar hemorragia interna.
  3. Imediatamente após a eutanásia, pulverize o mouse com 70% de etanol e remover a pele que cobre o coração com uma tesoura cirúrgica, sob uma capa de estéril de fluxo laminar. Limpe a tesoura com etanol e corte aurícula direita do coração. Lentamente, irrigue o coração através do ventrículo direito com 20 mM de EDTA HBSS, usando uma seringa de 10 mL e agulha 25-G.
    1. Colete o sangue com uma seringa estéril da cavidade pleural, em um tubo estéril contendo sulfato de heparan e EDTA. Continue a lavar o coração até o fígado e o pulmões tornam-se rosa ou o branco.
  4. Aplica o sangue para uma densidade gradiente: médio e centrifugar rcf 400 em temperatura ambiente por 15 min com freio baixo.
    Atenção: Uso livre de endotoxinas densidade gradiente médio (normalmente menos de 0,12 EU / mL).
    1. Colete células mononucleares em um tubo de novo. Lave as células pela re-suspensão em 10 mL HBSS contendo 2% FBS, 1% penicilina/estreptomicina e 10mm EDTA (tampão de isolamento) e em seguida de centrifugação em 4 órcf 400 C por 5-10 min para as células de Pelotas.
      Atenção: Utilize apenas a mídia que contém pelo menos 1 g/L de glicose.
  5. Para a selecção positiva CD11b, re-suspender 1 x 108 células em 1 mL de tampão de isolamento e incube-os por 15 min com 50 μL de grânulos magnéticos CD11b-conjugado no 4 oC.
    1. Lave o excesso grânulos adicionando 9 mL de tampão de isolamento e centrifugação no rcf 400 para 5-10 min a 4 oC. Aspire os sobrenadantes e ressuspender as células em 1 mL de tampão de isolamento. Aplicam-se as células em uma coluna magnética pré-lavadas de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Retirar a coluna do ímã, pipete 6 mL de tampão de isolamento para a coluna e expulsar as células magneticamente-etiquetadas em um tubo de coleta estéril, empurrando o êmbolo. Centrifugar as células no rcf 400 durante 5-10 min à 4 óC. Wash a coluna duas vezes com 3 mL de tampão de isolamento.
    3. Ressuspender as células em 1 x 107 células/100 μL isolamento buffer e mancha com os seguintes anticorpos conjugados fluoróforo: 0,1 μg CD115, 0,25 μg MHCII e 0,1 μg Ly-6 C/1 x 106 células.
  6. Classificar as células por retenção na dispersão lateral pequena (SSC) e células pequenas frente dispersão (FSC).
    Nota: Inflamatórios monócitos Mouse são geralmente definidos como CD115+/MHCIIEis/neg/Ly6COie patrulhando os monócitos são definidos como CD115+/MHCII de /Ly6C deEis/negneg 4,5. Em casos onde não há separação entre os dois subconjuntos é necessária, total SSClo/FCSlo/CD115+/MHCIIEis as células podem ser classificadas. Tanto o ingênuo e o tumor-rolamento ratos contêm aproximadamente 5-8 x 104 MoDC por 1 mL de sangue e até 4-5 x 105 MoDC seguinte injeção de GM-CSF. Deles, cerca de 70% são inflamatórios monócitos e 30% estão a patrulhar os monócitos.
  7. As células em uma concentração de 1 x 106 células/mL em uma mídia completa suplementada com 20 ng/mL, GM-CSF da placa. Depois de 1 dia, transferi as células não-aderentes e frouxamente aderentes a uma placa nova e cultura por mais 4-5 dias.
    Cuidado: Mídia DC não deve ser complementadas com piruvato.

3. preparação de Tumor-IgG complexos imunes

  1. Células de tumor de cultura no frasco de cultura 75 cm2 a confluência de 70% nos meios de comunicação DMEM completas.
    1. Adicione 2 mL de 0,25% tripsina/EDTA para separar células de cultura balão e monitor celular morfologia sob um microscópio de luz para evitar excesso de tripsinização.
    2. Adicione 8 mL de meios de cultura completo (por 2 mL de tripsina) para inibir a digestão do trypsin e centrifugar a 4 oC, rcf 400 por 5-10 min para as células de Pelotas.
      Nota: Certifique-se de verificar as pilhas do tumor para o micoplasma usando um kit comercial de PCR. Teste para a presença de bactérias Gram-negativas e fungosas endotoxinas usando Métodos de Limulus Lysate (LAL) ensaio28). Soro deve ser filtrado através de 0,22 μM e testado para os 9 vírus do código de regulamentos federais. Além disso, teste a meios de cultura e soros pela queda de 100-200 μL em LB ágar ou caldo e cultura durante 2 dias a 37 oC.
    3. Lavagem de células novamente de restos de tripsina e soro suspendendo-os novamente em 10 mL de PBS e centrifugar rcf 400 por 5-10 min. Aspire o sobrenadante e repetir a lavagem 2 vezes mais.
  2. Células de reparo em 1,8% tamponada paraformaldeído por 10 min à temperatura ambiente.
    1. Lave as células suspendendo-os novamente em 10 mL de PBS e centrifugar a 4 oC 400 rcf por 5-10 min.
    2. Sobrenadantes de aspirado e repetir lavagem duas vezes mais.
      Opcional: Para os ensaios de absorção de tumor, as células podem ser etiquetadas por incubando-os por 5 min em 37 oC em PBS contendo 1 éster de grufo de carboxyfluorescein μM (CFSE). CFSE então é saciada com mídia completa para 10 min no gelo. As células devem ser lavadas extensivamente em PBS contendo 2% de soro para remover o corante residual.
  3. Re-suspenda as células em buffer FACS (PBS suplementado com FCS 2% + 5 mM EDTA) e 0.5 μg/mL de anti-CD16/32 para bloquear potenciais interacções não-específicas da proteína-proteína. Placa em uma U-forma 96 poços/placa em uma concentração de 1 x 105 células por 100 μL.
    1. Adicione diferentes diluições de anticorpos de ligação de tumor variando de 5 μg - 5 ng/1 x 105 células. Incube a placa no gelo por 15-20 min.
      Nota: IgG anticorpos foram isolados do soro de ratos fêmeas de ingênuo 20-24 semanas de idade em colunas de proteína A, como descrito,24.
  4. Lave as células adicionando 150 µ l de PBS e centrifugação a placa em 4 óC 400 rcf, por 5-10 min.
    1. Descartar os sobrenadantes e repita a lavagem duas vezes. Ressuspender as células em buffer de FACS 100 μL contendo anticorpo secundário conjugado fluoróforo. Incube a placa no gelo por 20 min.
    2. Lavagem de células, adicionando 200 μL de tampão, FACS e centrifugação a placa no rcf 400 de 5-10 min. descartar os sobrenadantes e repita a lavagem.
    3. Analisar a vinculação de tumor por citometria de fluxo e determinar a concentração mínima necessária para revestir as células.
      Nota: Os anticorpos que não aumentem fluorescência de média intensidade (IFM) de células de tumor manchada pelo menos cinco vezes ao longo do isotipo controle não devem ser usados em ensaios funcionais subsequentes.

4. activação das MoDC com IC Tumor-IgG

  1. Casaco de células tumorais com concentração mínima de IgG, conforme descrito nas seções 3.1 através de 3.4.3
    1. Um dia antes de ativar o MoDC com tumor IC, substitua MoDC meios de cultura, que contém o GM-CSF. Para fazer isso, delicadamente aspirar a mídia e lavar as células uma vez com meios de cultura completa previamente aquecido.
      Nota: Isolado MoDC maduro tumor-associado deve ser cultivada pelo menos 2-3 h (ou até mesmo durante a noite) depois da classificação nos meios de comunicação completos sem GM-CSF e antes de ativá-los com IC.
    2. Para análises de captação do tumor, adicionar o tumor CFSE-rotulado IC para MoDC em uma proporção de 1:5 (IC:MoDC) e incubar durante uma noite para 12-16 h em 1 mL de mídia completa por 1 x 106 DC.
    3. Para análises de FACS de experimentos de ativação MoDC, adicionar o tumor-IC na proporção de 1:1 (IC:MoDC) e incubar durante uma noite para 12-16 h.
      Nota: É altamente recomendável para incluir um controle positivo, no qual MoDC são estimulados com 1 μg/mL de LPS ou outras agonistas TLR.
    4. Ativação durante a noite, a seguir, Aspire os sobrenadantes e lavagem de células suavemente três vezes com tampão de isolamento, ou 10 mM, EDTA HBSS.
    5. Para desanexar DC da placa, incubar as células por 2-3 min em 1 mL HBSS contendo 10 mM EDTA e separe as células pipetando vigorosa.
    6. Centrifugar as células no rcf 400 e ressuspender 1 x 106 DC em 90 µ l PBS suplementado com FCS 2%, 5 mM EDTA (tampão de FACS) e 0.5 μg de bloqueio de anticorpos. Incube no gelo por 5-10 min.
    7. Adicionar 10 μL de mistura de anticorpos para as células de coloração e incubar no gelo por 15 min.
    8. Adicione 2 mL FACS de tampão para células e centrifugar a 4 oC 400 rcf por 5-10 min.
  2. Ressuspender as células em buffer de FACS 200 μL.
    1. Adicionar 0,5 - 1 μg/mL de DAPI 1-2 min antes de executar as amostras, para excluir as células mortas de análises. Não excesso incube DAPI, como MoDC vai ocupá-lo dentro de 10-15 min.

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Results

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Inicialmente comparamos a capacidade dos anticorpos de camundongos syngeneic e alogênico de ingênuo para ligar a células tumorais. Para este fim, B16F10 e LMP linhas de células de tumor foram fixadas em paraformaldeído e lavadas extensivamente. B16F10 é uma linhagem de células de melanoma, que foi originalmente isolada de metástases de pulmão em camundongos C57Bl/6. LMP é uma célula de tumor no pâncreas que foi isolada de KrasG12D / +, ratos LSL-Trp53R172H / + e Pdx-1-Cre e cresce progres...

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Discussion

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Dado o grande número de DC necessário para vacinar os ratos (aproximadamente 2-4 x 106 DC por um rato), a maioria da vacinação estratégias em camundongos baseiam-se no isolamento de DC do BM e do baço, seguido por sua ativação ex vivo . No entanto, tenta ativar tumor DC em vivo, usando as mesmas condições para ativar o baço e BM DC, muitas vezes ter sido mal sucedido em produzir imunidade eficaz. Em duas publicações subsequentes, Carmi et al. descobriram que sangue e tumor MoDC difer...

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Disclosures

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Todos os autores declaram que eles têm nenhum conflito de interesses e que eles não têm nada para divulgar.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-Paque PREMIUMGE-Healthcare17-5442-02
OptiPrepStemCell Technologies07820
CD45 MicroBeadsMiltenyi130-052-301
EasySep Kit de Isolamento de MonócitosStemCell Technologies19861
Collagenase IVSigmaC9697-50MGTeste cada lote para endotoxina
DNase ISigmaDN25-10MG
HBSSThermoFisher14025092
FBSThermoFisherTeste 16140071cada lote para endotoxina
PE-CD11cBiolegend117307
APC-CD11bBiolegend101211
Violeta Brilhante 650 MHCIIBiolegend107641
AF48- CD86Biolegend105017
APC/Cy7-Ly-C6Biolegend108423
PE/Cy7-CD15Biolegend135523

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  2. Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
  4. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
  5. Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
  6. Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
  7. Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
  8. Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
  9. Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165(2014).
  10. Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
  11. Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 7 (2001).
  12. Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
  13. Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
  14. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
  15. Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
  16. Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
  17. Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
  18. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
  19. Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
  20. Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
  21. Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
  22. Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
  23. Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
  24. Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
  25. Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020(2016).
  26. Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
  27. Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
  28. Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
  29. Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
  30. Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
  31. Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
  32. Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
  33. Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
  34. Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
  35. Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
  36. Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).

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