Um rápido prata coloração protocolo permitindo simples e eficiente deteção de SSR marcadores usando um Gel de Polyacrylamide Non-desnaturação

Summary

Aqui, nós relatamos uma prata simples e de baixo custo que mancha o protocolo que requer apenas três reagentes e 7 min de processamento e é apropriado para a geração rápida de dados do SSR de alta qualidade em análise genética.

Abstract

Repita sequência simples (SSR) é um dos marcadores mais eficazes utilizados na pesquisa genética vegetal e animal e programas de reprodução molecular. Coloração de prata é um método amplamente usado para a detecção de marcadores SSR em gel de poliacrilamida. No entanto, os protocolos convencionais para coloração de prata são tecnicamente exigente e demorado. Como muitos outro laboratório biológico técnicas, prata, protocolos de coloração foram constantemente otimizadas para melhorar a eficiência da deteção. Aqui, nós relatamos um método que reduz custos de reagente e aprimora a clareza de resolução e imagens de deteção de coloração de prata simplificada. O novo método requer duas etapas principais (impregnação e desenvolvimento) e três reagentes (formol, hidróxido de sódio e nitrato de prata) e apenas 7 minutos de processamento para um gel de poliacrilamida não-desnaturação. Comparado com protocolos relatados anteriormente, este novo método é mais fácil, mais rápido e usa menos reagentes químicos para a deteção de SSR. Portanto, esta prata simples, barata e eficaz que mancha o protocolo beneficiará mapeamento genético e reprodução assistida por marcador, por uma geração rápida de dados marcador SSR.

Introduction

O desenvolvimento de marcadores baseados em PCR revolucionou a ciência da genética vegetal e de reprodução¹. Sequência simples repetição (SSR) marcadores são entre os marcadores de DNA mais usados e mais versátil. Sua cobertura ampla do genoma, abundância, especificidade do genoma e repetibilidade são alguns dos méritos de marcadores SSR, além de sua herança codominant para a detecção de genótipos homozigóticos². Vários estudos utilizaram marcadores SSR para investigar a diversidade genética, rastrear ascendência, construir mapas genéticos de ligação e mapear os genes para características economicamente importantes,

Protocol

1. preparação de produtos PCR dos marcadores SSR

1. Preparem-se todos os produtos químicos e reagentes para reações de PCR incluindo modelo DNA (30 ng / µ l), 2 × mistura mestre de PCR (contendo 2 × tampão PCR, 0,4 mM de cada dNTP, 3 mM de MgCl₂, 0,1 U / µ l de Taq DNA polimerase e corantes), 10 µ m de cada um para a frente e reverter as primeiras demão e água destilada ou desionizada (dH₂O).
   Nota: Os marcadores SSR, usados no presente estudo foram PT51333 (encaminhar a sequência da primeira demão: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' e a sequência inversa da primeira demão: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') e PT50903 (encaminhar a sequên....

Results

Os PCR amplicons foram produzidos usando os pares de cartilha SSR correspondentes em repolho chinês de florescência e tabaco. Após a eletroforese, o gel de poliacrilamida foram corado usando a prata acima que mancha o protocolo, que inequivocamente detectado os padrões de bandas de marcadores SSR (Figura 1).

Para comparar a eficiência de deteção de prata diferente protocolos de coloração, produtos P.......

Discussion

A lavagem do gel após a impregnação é uma etapa crítica. Volume de tempo e água de lavagem insuficiente pode causar a remoção incompleta de solução de impregnação na superfície da placa e o gel e resultar em um fundo escuro. O tempo de desenvolvimento adequado é mais um passo chave, desenvolvimento excessivo pode resultar em um fundo marrom escuro com imagem de baixo contraste de fragmentos de DNA. Além disso, a etapa de impregnação afeta significativamente coloração eficiência de fragmentos de DNA. Apesar de estender o .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mistura mestra de PCR (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, China	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, EUA	# 170-8200
DL500 Marcador de DNA	Takara Bio Inc., Japão	#3590A
Base Tris	Sangon Biotech Shanghai, China	# 77-86-1
Ácido bórico	Sangon Biotech Shanghai, China	# 10043-35-3
EDTA-Na2	Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos, China	#6381-92-6
Acrilamida	Sangon Biotech Shanghai, China	#79-06-1
N,N'-metileno-bis-acrilamida	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-26-9
N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-18-9
Persulfato de amônio	Guangzhou Reagente Químico Fábrica, China	# 7727-54-0
Bind-silano	Solarbio Pequim, China	#B8150
AgNO3< / sub>	Sinopharm Reagente Químico Beijing Co., Ltd, China	# 7761-88-8
Formaldeído	Tianjin DaMao Reagente Químico Fábrica, China	# 50-00-0
NaOH	Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos, China	# 1310-73-2
Ácido acético	Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos, China	# 64-19-7
Na2< / sub>CO3< / sub>	Tianjin DaMao Fábrica de Reagentes Químicos, China	# 497-19-8
Etanol	Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos, China	# 64-17-5
HNO< sub>3	Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos, China	#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm Reagente Químico Beijing Co., Ltd, China	#10102-17-7
Eriochrome preto T(EBT)	Tianjin DaMao Reagente Químico Fábrica, China	#1787-61-7
bandeja plástica	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd,	China-TS-1
Shaker	Qilinbeter JiangSu,	China-BenQ
M800 Scanner	BenQ,
Fonte de alimentação	Beijing Liuyi Instrument Factory,	China-High
em sistemas de gel verticais, JY-SCZF	Pequim Tunyi Electroforese Co., Ltd, China	-