Aqui, nós relatamos uma prata simples e de baixo custo que mancha o protocolo que requer apenas três reagentes e 7 min de processamento e é apropriado para a geração rápida de dados do SSR de alta qualidade em análise genética.
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Artigo de método
Um rápido prata coloração protocolo permitindo simples e eficiente deteção de SSR marcadores usando um Gel de Polyacrylamide Non-desnaturação
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Repita sequência simples (SSR) é um dos marcadores mais eficazes utilizados na pesquisa genética vegetal e animal e programas de reprodução molecular. Coloração de prata é um método amplamente usado para a detecção de marcadores SSR em gel de poliacrilamida. No entanto, os protocolos convencionais para coloração de prata são tecnicamente exigente e demorado. Como muitos outro laboratório biológico técnicas, prata, protocolos de coloração foram constantemente otimizadas para melhorar a eficiência da deteção. Aqui, nós relatamos um método que reduz custos de reagente e aprimora a clareza de resolução e imagens de deteção de coloração de prata simplificada. O novo método requer duas etapas principais (impregnação e desenvolvimento) e três reagentes (formol, hidróxido de sódio e nitrato de prata) e apenas 7 minutos de processamento para um gel de poliacrilamida não-desnaturação. Comparado com protocolos relatados anteriormente, este novo método é mais fácil, mais rápido e usa menos reagentes químicos para a deteção de SSR. Portanto, esta prata simples, barata e eficaz que mancha o protocolo beneficiará mapeamento genético e reprodução assistida por marcador, por uma geração rápida de dados marcador SSR.
Introdução
O desenvolvimento de marcadores baseados em PCR revolucionou a ciência da genética vegetal e de reprodução1. Sequência simples repetição (SSR) marcadores são entre os marcadores de DNA mais usados e mais versátil. Sua cobertura ampla do genoma, abundância, especificidade do genoma e repetibilidade são alguns dos méritos de marcadores SSR, além de sua herança codominant para a detecção de genótipos homozigóticos2. Vários estudos utilizaram marcadores SSR para investigar a diversidade genética, rastrear ascendência, construir mapas genéticos de ligação e mapear os genes para características economicamente importantes,3,4.
Produtos PCR dos marcadores SSR comumente são separados usando electroforese de agarose ou gel de poliacrilamida e depois visualizadas com coloração de prata ou sob luz UV, após coloração com brometo de etídio. Coloração prata de fragmentos de DNA em gel de poliacrilamida é mais sensível do que a outra coloração métodos5,6 e tem sido amplamente utilizada para detectar os fragmentos do ADN como marcadores SSR7.
Como muitas técnicas de laboratório biológico, prata coloração dos géis de poliacrilamida constantemente melhorou desde o seu primeiro sendo relatado como uma técnica de visualização do fragmento em 19798. A técnica foi modificada inicialmente para a deteção de fragmentos de DNA por Bassam et al 6 em 1991 e depois aperfeiçoado por Sanguinetti e colegas de trabalho9 em 1994. O método foi otimizado ainda mais no passado poucas décadas6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. no entanto, a maioria dessas versões atualizadas dos protocolos ainda tem alguns inconvenientes como alta demanda técnica e longo tempo para fixação de processamento e montagem de6, que limitam a aplicação destes protocolos7, 11. Um protocolo ideal que combina baixo custo com alta eficácia da detecção de fragmento de DNA é urgentemente necessária para aplicação rotineira de prata coloração em pesquisas biológicas.
Além disso, gel de poliacrilamida podem ser dividido em gel de poliacrilamida desnaturação e não-desnaturação, e ambos podem ser usados para a detecção de marcadores SSR, usando o método de coloração de prata. O efeito e a resolução dos quais não diferem significativamente, mas não-desnaturação géis de poliacrilamida são mais fáceis de processo e tomar menos tempo16.
Com base na pesquisa anterior15, do atual estudo tem como objetivo descrever uma otimizado prata que mancha o protocolo em detalhe para a deteção rápida, fácil e baixo custo de marcadores SSR em gel de poliacrilamida não-desnaturação.
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Protocolo
1. preparação de produtos PCR dos marcadores SSR
- Preparem-se todos os produtos químicos e reagentes para reações de PCR incluindo modelo DNA (30 ng / µ l), 2 × mistura mestre de PCR (contendo 2 × tampão PCR, 0,4 mM de cada dNTP, 3 mM de MgCl2, 0,1 U / µ l de Taq DNA polimerase e corantes), 10 µ m de cada um para a frente e reverter as primeiras demão e água destilada ou desionizada (dH2O).
Nota: Os marcadores SSR, usados no presente estudo foram PT51333 (encaminhar a sequência da primeira demão: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' e a sequência inversa da primeira demão: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') e PT50903 (encaminhar a sequência da primeira demão: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' e inverter a sequência da primeira demão: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') para o tabaco e CX-43 (encaminhar a sequência da primeira demão: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' e inverter a sequência da primeira demão: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') e CX-157 (encaminhar a sequência da primeira demão: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' e inverter a sequência da primeira demão: 5 '- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') de repolho chinês de florescência. - Prepare-se 10 µ l de mistura PCR para amplificação adicionando 2 µ l do modelo de DNA, 5 µ l de 2 × mistura mestre de PCR, 0,2 µ l de cada primer para diante e reverso da primeira demão e 2,6 µ l de dH2O.
- Realizar a reação de amplificação do PCR em um thermocycler com uma etapa inicial de 94 ° C por 5 min, siga por 38 ciclos de 45 s a 94 ° C para desnaturação, 45 s a 55 ° C para recozimento da primeira demão e 1 min a 72 ° C para a extensão e uma etapa da extensão final de 10 min 72 ° C; em seguida, armazene os produtos de PCR a 4 ° C para uso posterior.
2. preparação de soluções de Polyacrylamide gel de fundição
- Preparar 1 L de amortecedor de TBE 5 × 54g de Tris base e ácido bórico 27,5 g dH2O de dissolução, adicionando 20 mL de EDTA 0,5 M (pH 8.0) e ajustar a solução para um volume final de 1 000 mL com dH2O.
Nota: Amortecedor de TBE pode ser armazenado em temperatura ambiente por meses. - Prepare 2 L de amortecedor de TBE 0,5 × adicionando-se 200 mL de amortecedor de TBE × 5 para dH2O até um volume final de 2 L e armazenar à temperatura ambiente.
- Preparar uma solução de gel de poliacrilamida 6% não-desnaturação dissolver 29 g de biologia molecular grau acrilamida e 1g de biologia molecular grau N, N'-methylenebisacrylamide no amortecedor de TBE 0,5 × até um volume final de 500 mL. Cobrir o frasco de solução com folha de alumínio e loja a 4 ° C para uso posterior.
Cuidado: Acrilamida é considerada uma potente neurotoxina e deve ser manipulada com cuidado. Use sempre luvas quando pesando pó e manipulação de soluções que contêm-lo. - Prepare uma solução de (APS) de persulfato de amónio 20% pela dissolução de 2 g de APS com dH2O até um volume final de 10 mL. Pode ser armazenado a-20 ° C durante meses.
Nota: Para sua conveniência, 10 mL da solução APS 20% pode ser aliquotada em 1,5 mL ou 2 mL de tubos de centrífuga de armazenamento-20 ° c. Descongelar e misture bem antes de usar. - Prepare uma solução diluída vincular-silano dissolvendo 3 µ l de vincular-silano em 0,997 mL de etanol a 95% contendo 0,5% de ácido acético. Pode ser armazenado a 4 ° C durante semanas.
Cuidado: Bind-silano é tóxica, use luvas quando manusear a solução e manter o quarto ventilado.
3. preparação de géis de poliacrilamida para eletroforese
- Lavagem de um conjunto de placas de vidro e espaçadores com detergente em água da torneira, seguida por uma lavagem completa com dH2O. ar seco as placas por configuração-los em um prato de cavalete.
- Disperse a 1 mL de solução de vincular-silano na superfície interna de uma placa de vidro retangular e seca por 5 min.
Nota: Se a solução vincular-silane não é espalhada uniformemente sobre a superfície da placa, o gel pode ser destacado durante coloração e resultar em um efeito de coloração satisfatório. - Dispersar a 1 mL de repelir-silano na superfície interna de uma placa de vidro entalhado com um cotonete, limpe o excesso de repelir-silano com papel absorvente e ar seco por 5 min.
Nota: Se o repel-silane não revestir a superfície da placa de vidro uniformemente, pode danificar o gel parcialmente descascando. - Montar as placas de vidro com espaçadores com a placa entalhada no topo e prenda os dois lados da assembleia com braçadeiras de fundição.
- Despeje a quantidade adequada (40 mL) de solução de gel de poliacrilamida 6% não-desnaturação para um copo para o conjunto de placa de largura de 33 cm × 10 cm de altura e espaçador espessura de 1,5 mm, adicionar 20 µ l de tempted (TEMED) e 200 µLfresh 20% APS e misture delicadamente.
Nota: A quantidade adequada (40 mL) de solução de gel foi calculada a partir do volume interno das duas placas com espessura de espaçadores (30 cm x 8,5 cm × 0.15 cm). Quanto a quantidade de TEMED e APS para a polimerização do gel, há uma relação padrão de solução de gel TEMED e APS, com base na referência17. A solução de gel descrita acima é armazenada em 4° C. Se a solução de gel é armazenada à temperatura ambiente, 20 µ l de TEMED e 100 µ l de 20% a APS deve ser usado. Misture delicadamente a mistura de solução de gel com uma vara de vidro para evitar bolhas de ar na solução. - Despeje a solução imediatamente e cuidadosamente para as placas de vidro montado ao longo da borda da placa entalhada, preencher o espaço quase ao topo e inserir o pente. Adicione um pequeno volume de solução de gel sobre o pente.
Nota: Mantenha as placas de vidro horizontal para evitar que o gel vazando. Remova quaisquer bolhas com um gancho de bolha, se necessário. - Permitir que o gel definir por 30 min à temperatura ambiente.
Nota: O tempo de polimerização pode mudar com temperaturas de solução de gel e ambiente. - Depois que o gel é totalmente polimerização, remova os grampos de fundição e posicione a placa de conjunto da unidade do tanque de eletroforese com a placa entalhada virada para o reservatório superior amortecedor, e uso de grampos grandes para anexar a placa definida como a unidade do tanque.
- Despeje 1 litro de amortecedor de TBE 0,5 × em cada um da parte superior e as câmaras inferiores. Retirar o pente e lave todos os poços completamente com buffer usando uma pipeta ou seringa.
Nota: Certifique-se que o sanduíche de gel na parte inferior da placa é completamente embebido na reserva sem quaisquer bolhas.
4. correr géis
- Carrega cerca de 1 µ l de produto PCR em cada poço do gel de polyacrylamide. Carrega uma escada de tamanho de DNA de ambos os lados do gel juntamente com amostras de produtos PCR. Fixe a tampa de segurança para a câmara superior do amortecedor.
- Ligar os fios à fonte de alimentação, combinando o código de cores para vermelho e preto para preto. Funcione o gel em uma constante tensão de 110 V, até que a tintura atinja uma posição definida, normalmente para ~ 70 min.
Nota: O tempo de tensão e funcionando pode ser ajustado de acordo com o tamanho dos produtos do PCR.
5. prata coloração para a detecção de marcadores SSR em um não-Gel de poliacrilamida
- Após a electroforese, drene o buffer da câmara superior em um copo grande através da válvula. Separar as pinças de lado, retirar as placas do aparelho, cuidadosamente separe a placa de vidro entalhado ao longo de um lado com uma espátula e certifique-se que o gel que permanece ligado à placa de vidro revestido com ligação silano.
- Fazer 1 L de solução de impregnação fresco dissolvendo-se 1,5 g de AgNO3 em 1 L de dH2O. preparar 1 L de solução de desenvolvimento fresco pela dissolução de 10 g de NaOH em 900 mL de dH2O, adicione 1 mL de formol 37% e ajustar até um volume final de 1 L com dH2O.
Nota: Usar luvas e lidar com os produtos químicos acima e soluções com cuidado. Não é necessário manter as soluções e as etapas correspondentes com as soluções no escuro. - Lave cuidadosamente a placa de gel e vidro com amplo dH2O para remover o tampão de eletroforese, em seguida, coloque a placa com o gel virado para cima em uma bandeja de plástico e mergulhe o gel em 1 L de solução de impregnação. Coloque a bandeja em uma coqueteleira.
- Agite a bandeja no 60 r/min. para 3-4 min.
Nota: Apertar o tempo pode ser ajustado de acordo com a espessura do gel e a concentração de nitrato de prata na solução de impregnação. - Mova a placa fora da solução de impregnação e colocá-lo em outra bandeja. Enxágue a solução de impregnação residual fora da superfície da placa e o gel usando amplo dH2O dobro para 3-5 s cada.
- Coloque a placa com o gel para cima, em outra bandeja, mergulhe a placa em 1 L de solução de desenvolvimento, então agite a bandeja em 50 r/min ~ 3 min.. Monitor a aparência do DNA fragmentos e parar o desenvolvimento quando o rácio mais elevado do sinal do DNA de fragmentos para o ruído de fundo é observado (esta etapa leva ~ 3 min).
- Lave a placa e o gel com amplo dH2O duas vezes e secar a placa de gel com um papel absorvente.
- Digitalize o gel usando um scanner apropriado. Uma resolução de 300 dpi dá uma clara visualização dos fragmentos de DNA. O gel também pode ser fotografado usando uma câmera.
- O padrão de bandas de marcadores SSR pode ser marcou com base nos fragmentos de DNA na imagem.
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Resultados
Os PCR amplicons foram produzidos usando os pares de cartilha SSR correspondentes em repolho chinês de florescência e tabaco. Após a eletroforese, o gel de poliacrilamida foram corado usando a prata acima que mancha o protocolo, que inequivocamente detectado os padrões de bandas de marcadores SSR (Figura 1).
Para comparar a eficiência de deteção de prata diferente protocolos de coloração, produtos P...
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Discussão
A lavagem do gel após a impregnação é uma etapa crítica. Volume de tempo e água de lavagem insuficiente pode causar a remoção incompleta de solução de impregnação na superfície da placa e o gel e resultar em um fundo escuro. O tempo de desenvolvimento adequado é mais um passo chave, desenvolvimento excessivo pode resultar em um fundo marrom escuro com imagem de baixo contraste de fragmentos de DNA. Além disso, a etapa de impregnação afeta significativamente coloração eficiência de fragmentos de DNA. Apesar de estender o ...
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Fundação de ciências naturais de Guangdong de China (2015A030313500), a plataforma pesquisa cooperativa internacional chave Provincial e o Major científico pesquisa projeto de Guangdong ensino superior (2015KGJHZ015), a ciência e Plano de tecnologia da administração de monopólio de tabaco de Guangdong (201403, 201705), a ciência e a tecnologia plano de Guangdong de China (2016B020201001), o projecto de formação nacional de inovação para alunos de graduação (201711078001). Menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é exclusivamente com o propósito de fornecer informações específicas e não implica em recomendação ou endosso pelo departamento de agricultura. USDA é um provedor de igualdade de oportunidades e o empregador.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Mistura mestra de PCR (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, EUA | # 170-8200 | |
| DL500 Marcador de DNA | Takara Bio Inc., Japão | #3590A | |
| Base Tris | Sangon Biotech Shanghai, China | # 77-86-1 | |
| Ácido bórico | Sangon Biotech Shanghai, China | # 10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos, China | #6381-92-6 | |
| Acrilamida | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-metileno-bis-acrilamida | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Persulfato de amônio | Guangzhou Reagente Químico Fábrica, China | # 7727-54-0 | |
| Bind-silano | Solarbio Pequim, China | #B8150 | |
| AgNO3< / sub> | Sinopharm Reagente Químico Beijing Co., Ltd, China | # 7761-88-8 | |
| Formaldeído | Tianjin DaMao Reagente Químico Fábrica, China | # 50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos, China | # 1310-73-2 | |
| Ácido acético | Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos, China | # 64-19-7 | |
| Na2< / sub>CO3< / sub> | Tianjin DaMao Fábrica de Reagentes Químicos, China | # 497-19-8 | |
| Etanol | Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos, China | # 64-17-5 | |
| HNO< sub>3 | Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Reagente Químico Beijing Co., Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome preto T(EBT) | Tianjin DaMao Reagente Químico Fábrica, China | #1787-61-7 | |
| bandeja plástica | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, | China-TS-1 | |
| Shaker | Qilinbeter JiangSu, | China-BenQ | |
| M800 Scanner | BenQ, | ||
| Fonte de alimentação | Beijing Liuyi Instrument Factory, | China-High | |
| em sistemas de gel verticais, JY-SCZF | Pequim Tunyi Electroforese Co., Ltd, China | - |
Referências
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Reimpressões e permissões
