Coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do RNA: preparando-se para estudos de linfonodo Transcriptomic de espécies de animais grandes

Resumo

Este protocolo fornece uma visão geral dos procedimentos para o isolamento do RNA para o perfil de transcriptomic do nó de linfa de tecidos de animais de grandes porte, incluindo etapas na identificação e excisão dos gânglios linfáticos do gado e animais selvagens, abordagens de amostragem para fornecer consistência em vários animais e considerações mais resultados representativos para a preservação de pós coleta e processamento para a análise do RNA.

Resumo

Animais de grandes porte (gado e animais selvagens) servem como importantes reservatórios de agentes patogénicos zoonóticos, incluindo Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonellae Escherichia colie são úteis para o estudo da patogênese e/ou propagação das bactérias em hospedeiros naturais. Com a função chave de linfonodos na resposta imune do hospedeiro, linfonodo tecidos servem como uma fonte potencial de RNA para análises de transcriptomic a jusante, a fim de avaliar as mudanças temporais na expressão gênica em células no decorrer de uma infecção. Este artigo apresenta uma visão geral do processo de coleção de nó de linfa, amostragem de tecido e a jusante do RNA processamento em gado, usando bovinos (Bos taurus) como um modelo, com exemplos adicionais provenientes do Bisão-americano (bison Bison ). O protocolo inclui informações sobre a localização, identificação e remoção dos gânglios linfáticos de diversos sites chaves no corpo. Além disso, uma metodologia de amostragem de biópsia é apresentada que permite a uma consistência de amostragem em vários animais. Várias considerações para preservação de amostra são discutidas, incluindo a geração de RNA apropriado para jusante metodologias como a sequenciação do ARN e RT-PCR. Devido os longos atrasos inerentes a estudos de curso de tempo grandes animais vs rato, apresentam-se resultados representativos de bison e tecidos de bovinos do nó de linfa para descrever o tempo de degradação neste tipo de tecido, no contexto de uma revisão da trabalho metodológico anterior na degradação de RNA em outros tecidos. Em geral, este protocolo será útil para ambos os pesquisadores veterinários começando transcriptome projetos em grandes amostras de animais e biólogos moleculares interessados em aprender técnicas para processamento de em vitro e em vivo amostragem de tecido.

Introdução

A sequenciação do ARN da transcriptoma de linfonodos fornece a oportunidade para caracterizar a resposta imune dos animais para uma variedade de agentes patogénicos. Enquanto esta metodologia tem sido utilizada extensivamente em camundongos, análises tem recentemente expandido para maiores mamíferos^1,2. Pecuária/grandes animais linfonodos podem ser usados para caracterizar respostas do hospedeiro a uma infecção, não só para a sua utilização em estudos de susceptibilidade genética ou vacina e para a identificação de alvos para o desenvolvimento de drogas, mas também como sistemas modelo para estudos em humanos em doenças zoonóticas. Por exemplo, no caso da brucelose (uma doença bacteriana zoonótica que impactos meio milhão de pessoas ao redor do mundo cada ano), apesar do aumento significativamente os custos, estudos em ovinos ou caprinos são mais relevantes para a infecção humana e vacina humana desenvolvimento de modelos animais de laboratório. Modelos de infecção mouse recapitular a infecção do sistema reticuloendotelial, mas não os sinais clínicos característicos³_.

Em experimentos com animais grandes em comparação com estudos de animais de laboratório, o processo de tecido colheita necessariamente envolve um atraso maior entre a eutanásia e a coleção de tecido, que apresenta um potencial desafio para a preservação da RNA de alta qualidade. O RNA intacto é essencial para a geração de dados transcriptomic biologicamente relevantes. A geração do RNA de alta qualidade das amostras de tecido é particularmente crítico para estudos de grande patógeno animal realizado em instalações de contenção. Tais estudos são inerentemente mais difíceis de executar, como eles não só exigem aprovado instalações e pessoal altamente treinado, mas também carregam custos financeiros significativos, que, dependendo do trabalho, que podem variar de dezenas a centenas de milhares de dólares. Estes tipos de estudos envolvem também uma colaboração interdisciplinar e o conhecimento interdisciplinar para a sua conclusão, adicionando à sua complexidade. Portanto, formação sobre, desenvolvimento e adesão a um sistema simplificado para a coleta de amostra e preservação fornece benefícios significativos para a jusante estudos moleculares de tecidos de animais infectados.

A coleção de linfonodos maiores apresenta desafios adicionais para a coleta de tecido, em comparação com a amostragem semelhante de murino linfonodos. A preparação para a excisão de amostra exige um conhecimento básico da anatomia do nó de linfa, incluindo as estruturas internas relevantes. A estrutura de um nó de linfa é composta por lóbulos linfoides rodeados por seios cheios de linfa. Estas estruturas são colocadas dentro de uma cápsula fibrosa, resistente. ⁴ um lóbulo linfoide é "anatômica e funcional unidade básica do nó de linfa" e é composto de folículos, uma unidade profunda cortical e cordões medulares e seios⁴ (figura 1A). Linfócitos B e T são home aos folículos e profundo corticais unidades, respectivamente. Essas estruturas fornecem um andaime 3D e facilitam a interação entre os linfócitos e antígeno ou células apresentadoras.

Grosseiramente, folículos e unidades profundo corticais podem ser identificadas na superfície de corte como eles contêm uma malha reticular mais densa e aparecem mais escuros do que os seios, que são compreendidos por uma malha reticular mais delicada e aparecem mais leves (figura 1B). Por convenção, os patologistas referem-se às regiões dos gânglios linfáticos como o córtex superficial (folículos), o paracórtex (fundo corticais unidades) e a medula (cordões medulares e seios). Um exame adequado das três regiões tem sido considerado como a melhor prática em diretrizes de exame patológico de rotina para linfonodos⁵. Observe que há uma variação considerável a consistência, tamanho e cor dos gânglios linfáticos, mesmo dentro de um único animal. Como idade de animais, os gânglios linfáticos tendem a diminuir de tamanho e tornam-se mais firme do que aqueles de animais mais jovens, normalmente devido a um aumento em seu tecido conjuntivo e uma redução do linfoide normal estrutura^6,7.

Figura 1. Anatomia do nó de linfa. (A), esta imagem mostra a anatomia do nó de linfa, representando estruturas chaves. (B) ainda esta imagem mostra um nó de linfa bovina cortado em secção transversal. Destacam-se as estruturas relevantes/camadas que são visíveis a olho nu. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dependendo a questão experimental, linfonodos diferentes será de interesse para a recolha e análise. Linfonodos periféricos são aqueles localizados profundamente no tecido subcutâneo. Nos bovinos, linfonodos periféricos ou superficiais frequentemente utilizados na prática clínica e experimental incluem parótida, submandibular, retrofaríngeos, pré-escapulares, pré-femurais (precrural) e superficial inguinal (supramamários nas fêmeas, escrotal nos machos) ( A Figura 2). Na tabela 1, as propriedades de chaves linfáticos superficiais, conforme descrito no gado sistema⁸, são descritas. Abaixo, alguns planos de recolha de linfonodo potenciais para doenças infecciosas bacterianas, de gado são apresentados como ponto de partida para a investigação.

Brucella abortus/Brucella melitensis: padrão necropsies por b. abortus-infectados de gado e b. melitensis-cabras infectadas no centro nacional de doença Animal recuperar supramamários das, prescapular e tecido de linfonodo parotídeo , tanto para a moagem para a enumeração de bactérias e para a preparação de RNA para o perfil de expressão acolhimento do RNA. B. abortus regularmente podem ser recuperados em cada um destes gânglios linfáticos em bovinos experimentalmente infectados⁹_. A presença de bactérias em cada um desses tipos de nó de linfa pode ser detectada em b. melitensis-infectados cabras até pós-infecção pelo menos nove meses, utilizando as metodologias baseadas em RNA de nossos estudos (Boggiatto et al, inédito). Salmonela SP.: O prescapular, subiliac (pré-femurais), e linfonodos mesentéricos foram úteis durante a criação de perfil de carcaças de gado para uma prevalência de Salmonella ^10,11,12 e seria de interesse potencial para estudos de transcriptomic. Escherichia coli O157: H7: linfonodos mesentéricos (no intestino médio e intestino delgado distal locais) podem ser os sites de uma recuperação ocasional das bactérias em bezerros infectados (mas não em bovinos adultos infectados)¹³. Leptospirose (Leptospira SP.): uma crônica persistência das bactérias tem sido observada em linfonodos drenam a glândula mamária¹⁴. Mycobacterium bovis : Nos bovinos, as bactérias foram recuperada infecção pós-experimental de gânglios linfáticos do mediastino e traqueobrônquica de bezerros¹⁵. Além disso, o linfonodo RNA tem sido utilizado para examinar as respostas de grande animal hospedeiro de vírus, tais como a síndrome respiratória e reprodutiva suína vírus². A Figura 2 mostra a localização de um subconjunto desses principais linfonodos do corpo de bovinos.

Figura 2: Cartoon retratando locais selecionados do nó de linfa no Bos taurus . Os linfonodos numerados são anotados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este documento e o vídeo associado, apresentamos um protocolo para o isolamento de grandes linfonodos animais para estudos de RNA, projetados para ser informativo para biólogos moleculares envolvidos em estudos de transcriptomic de infecções de animais grandes. Primeiro, nós fornecemos uma visão geral do procedimento de isolamento para os gânglios linfáticos, usando amostragem de tecidos bovinos e bison como exemplos. Emparelhado com esta demonstração, conforme exibido no vídeo, é um fluxo de trabalho para uma amostra de tecido pode ser reproduzido para isolamento de RNA. Em seguida, descrevemos considerações importantes para o processamento de um linfonodo infectado, com foco na segurança, consistência e qualidade do RNA.

A preparação do RNA do tecido com um reagente de isotiocianato de guanidina-fenol acidificado é baseada no método original de Chomczynski e Sacchi^16,17, com uma purificação sobre colunas de rotação silicone-baseado na presença de agentes de caotrópicas baseados no trabalho de Vogelstein e Gillespie¹⁸original. Também examinamos o potencial para a recuperação do RNA para transcriptomics de gado gânglios linfáticos preservados por métodos alternativos. Finalmente, podemos explorar o impacto da variável tempo sobre a qualidade do RNA em necropsias de animais grandes, incluindo uma experiência representativa, retratando o efeito de um aumento no tempo entre a eutanásia e a amostragem no perfil de RNA recuperado de bison e linfonodos de bovinos. Este artigo será útil não apenas para biólogos moleculares, mas também ao veterinários pesquisadores iniciando estudos transcriptomic.

Protocolo

Os procedimentos de necropsia animal retratados aqui abrangidos os protocolos aprovados IACUC no centro nacional de doença Animal, Ames, IA. Todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com as diretrizes aprovadas para cuidados com animais e bem-estar.

1. pré-planejamento antes de necropsia

1. Antes da necropsia, prepare os seguintes materiais para o transporte para a suíte de necropsia:
   1. repleto de 1,5 ou 2 tubos de microcentrifuga mL ~ 1,0 mL da solução de preservação de RNA, em um recipiente de rack ou transporte. Certifique-se de seguir as orientações do fabricante para a proporção do volume da solução de preservação para o volume do tecido.
   2. Bisturis descartáveis e pinça limpa e esterilizada: um conjunto para dissecação da pele e um conjunto diferente de recolha dos gânglios linfáticos (uma para cada nó de linfa, por animal), evitando assim a contaminação da pele e flora ambiental com o nó de linfa tecidos.
   3. 3 mm socar ferramentas de biópsia, necrópsia, facas, um recipiente de objectos cortantes de bisturis usados e ferramentas de biópsia e tábuas de corte ou bandejas descartáveis para uso na dissecção linfonodal.
   4. Use equipamento de protecção pessoal, incluindo os EPI necessário para o trabalho ao nível adequado para o sistema BSL.
   5. Autoclave reutilizáveis ferramentas de metal, incluindo o fórceps, panelas de metal antes da necropsia, utilizando os utensílios/armarinhos configuração.

2. identificação e amostragem dos gânglios linfáticos no gado e Bison

Figura 3 . Gânglios linfáticos do pescoço e cabeça bovina. (A), esta imagem mostra selecionados linfonodos da cabeça e do pescoço de Bos taurus. (B) esta imagem mostra o linfonodo parotídeo em secção transversal (à esquerda) em comparação com a glândula salivar parótida em secção transversal (à direita). Observe a diferença entre os tipos de duas tecido texturas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Isolamento dos linfonodos pré-escapulares em gado e bison
   1. Eutanásia animal (gado ou bisão de qualquer idade, conforme apropriado para o experimento) baseado no protocolo IACUC local. Confirme a morte por métodos especificamente descritos no protocolo IACUC institucional, incluindo a falta de um batimento cardíaco, a falta de respiração e ausência de reflexo corneal. Mudar o animal para o andar de necropsia.
      Nota: Existem vários métodos de eutanásia humana usados na prática laboratorial de animais de grandes porte. No entanto, a administração intravenosa de solução de sódio pentobarbital de sódio e fenitoína é mais comumente aprovaram e utilizaram de forma. Consulte as diretrizes de AVMA para a eutanásia de animais. ¹⁹
      Atenção: Siga todos os protocolos de biossegurança relevantes para uma necropsia na instituição anfitriã, incluindo as orientações para a eliminação segura de objectos cortantes em um recipiente à prova de punção e a descontaminação de facas de metal reutilizáveis e fórceps. Este protocolo gera resíduos de objectos cortantes do uso de Bisturis descartáveis. Use equipamento de proteção individual conforme ditado pelas orientações institucionais, incluindo botas, macacão, luvas e óculos de proteção.
   2. Identifica 3 participantes para trabalhar sobre os tecidos animais.
      Nota: Aqui, Dissecador 1 vai ser encarregado em grande escala de corte dos tecidos animais desejados, Dissecador 2 irá se recuperar dos gânglios linfáticos as seções diferentes de animais e Dissecador 3 vai funcionar em uma tabela separada para isolar as secções de cada nó de linfa e transferi-los para tubos com uma solução de conservante.
   3. Comece colocando o animal em prostração lateral.
   4. Estender o ombro ao mover o membro da frente de volta ao nível do joelho (carpo); Este movimento irá trazer de volta o ombro e permitir uma mais fácil palpação do nó de linfa. Sentir a presença do nó de linfa "caroço".
      Nota: Durante condições de doença, linfadenopatia pode estar presente, que facilita a identificação dos linfonodos, mas esse processo também pode afetar a arquitetura do linfonodo, composição e consistência.
   5. Uma vez localizado e com o ombro ainda estendido, use uma faca bisturi ou necropsia tornar-se uma incisão na pele ao longo do contorno do ombro.
      Nota: Não restringir o tamanho da incisão, mesmo se o linfonodo foi localizado através da palpação. Uma incisão maior fornece fácil acesso aos tecidos mais profundos e facilita a excisão do nó de linfa para o Dissecador.
   6. Usando um par de pinças, retrai a pele para revelar o ponto do ombro e a musculatura do pescoço.
      Nota: Os linfonodos pré-escapulares é frequentemente encontrado na gordura subcutânea, especialmente em animais overconditioned.
   7. Mais uma vez, palpe a localização do nó de linfa (Figura 3A).
      Nota: Ao contrário da gordura subcutânea, o linfonodo manterá sua forma quando palpados. Além disso, linfonodos não são contíguos com qualquer tecido circundante, como eles são delimitados por uma fina cápsula fibrosa.
   8. Depois de localizar o linfonodo pré-escapulares, cuidadosamente dissecar a gordura subcutânea, usando um bisturi e uma pinça e isolar o nó de linfa.
      1. Olha para a presença de uma cápsula fibrosa fina, conforme representado na figura 1B, para distinguir entre o nó de linfa e tecido adiposo; gânglios linfáticos não são contíguos com qualquer tecido circundante.
   9. Transferência do nó de linfa para a mesa de dissecação do nó de linfa, usando uma bandeja plástica para a transferência de tecido, para cortar ainda mais.
      Nota: A aparência destes gânglios linfáticos no bison é semelhante. O associado vídeo retrata a aparência do nó de linfa pré-escapulares como dissecados fora o ombro direito de um Bisão-americano.
2. Isolamento dos linfonodos parotídeos em gado e bison
   1. Comece colocando o animal em prostração lateral no chão necropsia. Localize a articulação temporomandibular (ATM).
      1. Se isto é difícil de localizar, mover a mandíbula lentamente e determinar o local em que a mandíbula anexa ao crânio; Esta é a TMJ.
   2. Usando um bisturi ou necropsia faca, cuidadosamente fazer uma incisão na pele. Iniciar a incisão dorsal para a articulação e estendê-lo ventralmente/verticalmente ao longo do queixo.
   3. Disse a pele fora para revelar o tecido subcutâneo. Glândula salivar parótida será visível em primeiro lugar, devido ao seu grande tamanho, aparência de superfície lobulada e coloração vermelha.
   4. Usando fórceps e um bisturi, mova a glândula salivar parótida lado para encontrar o linfonodo parotídeo sentado só craniana e medial à glândula salivar (Figura 3A). Examine o tecido do linfonodo parotídeo para textura antes de processamento adicional.
      Nota: gânglios linfáticos do rosto (parótido e submandibular) estão associados com as glândulas salivares, que pode confundir o isolamento do nó de linfa. Em comparação com os gânglios linfáticos, as glândulas salivares são muito maiores e têm uma aparência de superfície lobulada. Além disso, na superfície de corte, as glândulas salivares são homogêneas na natureza e não exibem o clássico padrão arquitetural cortical e medular dos gânglios linfáticos (Figura 3B).
   5. Impostos especiais de consumo a glândula com um bisturi. Transferi-lo para a mesa de dissecação do nó de linfa, usando uma bandeja plástica para a transferência de tecido, para cortar ainda mais.
3. Isolamento dos linfáticos supramamários em gado feminino e bison
   1. Coloque o animal em prostração lateral.
   2. Levante as pernas traseiras para expor a região inguinal e localizar o úbere.
      Nota: Em um animal saudável, não lactantes, palpação destes gânglios linfáticos pode não ser possível. Em um animal em lactação, estes linfonodos pode ser palpáveis na borda caudal da base do úbere.
   3. Usando um bisturi, fazer uma incisão dorsal só para o úbere, correndo ao longo da parte superior da coxa, para expor as supramamários das glândulas.
   4. Dissecar o tecido subcutâneo e localizar o nó de linfa supramamários das incorporado em uma fina camada de gordura subcutânea. Se não é visualmente diferenciável, palpe o tecido exposto a presença de uma estrutura firme dentro da gordura subcutânea.
   5. Usando fórceps e um bisturi, disse cuidadosamente para fora do nó de linfa de gordura. Transferi-lo para a mesa de dissecação do nó de linfa, usando uma bandeja plástica para a transferência de tecido, para cortar ainda mais.

3. corte e armazenamento dos gânglios linfáticos

1. Passe os linfonodos isolados do Dissecador 2 para dissector 3 numa mesa de dissecação adjacente ao espaço principal de necropsia. Coloque cada linfonodo em uma seção fresca de uma placa de corte. Pre-rotule as tábuas de corte em seções por nó de linfa, para facilitar o recebimento de múltiplos linfonodos em sucessão. De amostras infecciosas, use bandejas descartáveis.
2. Usando fórceps e uma faca descartável de bisturi ou necropsia, remova uma seção do nó de linfa. Usando uma faca afiada, fazer um corte sagital de abrir o nó de linfa.
3. Examinar o interior do linfonodo, especialmente em espécimes de animais infectados, à procura de assimetria, lesões, as diferenças de cor, etc. registar as observações.
4. (Opção 1) Pequenos cortes histologicos
   1. Use Bisturis descartáveis para excisar as partes de cada nó de linfa que são menos de 5 mm de espessura e cada pedaço de transferência para um tubo com uma solução de preservação de RNA com pinça limpa.
5. (Opção 2) Metodologias de biópsia ou seccionamento de linfonodo
   Nota: Biópsias ou corte metodologias, quando aplicada às secções paralelas do nó de linfa através de diferentes nós e os animais, fornecem consistência do tecido amostrado para uma análise de RNA em massa.
   1. Cunha, método de seccionamento
      1. Depois de examinar a seção sagital para capturar células através do perfil do nó de linfa, impostos especiais de consumo uma cunha em forma de torta do nó de linfa, do centro para a cápsula externa. Para um nó de 2 cm de largura (tamanho padrão; ver tabela 1), uma cunha de corte para o centro que é de 4 mm de comprimento de arco exterior e 5 mm de espessura, terá um peso molhado de ~ 100 mg.
      2. Usando o bisturi, corte da Cunha em pedaços pequenos, não mais espessas do que 5 mm e aproximadamente 50-100 mg cada no peso do tecido molhado.
         Nota: Para obter consistência, processe todas as peças da cunha de um único nó de linfa ou em um lote ou em tubos separados seguido de RNA pool para fornecer um perfil representativo do RNA a partir do nó de linfa de interesse.
      3. Coloque os pedaços de tecido com pinça para tubos contendo pelo menos 10 volumes de solução de preservação de RNA, em comparação com o volume do tecido.
   2. Método de biópsia do perfurador
      1. Se o objectivo é recolher seções específicas, tais como folículos específicos do nó, selecione uma ferramenta de biópsia do perfurador. Selecione uma ferramenta consistente com o tamanho da amostra desejada por coleção. Soco biópsia ferramentas estão disponíveis em uma variedade de tamanhos, de 1 a 8 mm de diâmetro.
      2. Localize visualmente as regiões de interesse para amostra no nó de linfa.
      3. Use a ferramenta de biópsia do perfurador para excisar as seções de interesse, pressionando e girando a ferramenta no tecido para criar o núcleo. Transferi o pedaço de tecido com fórceps para um tubo contendo pelo menos 10 volumes de solução de preservação de RNA. Se mais espessa do que 5 mm, use fórceps e um bisturi para dividir ainda mais o tecido em pedaços menores.
6. Uma vez que as amostras foram transferidas para a solução de preservação (EG., RNALater), transportá-los para o laboratório à temperatura ambiente.
7. Armazene as amostras em 4 ° C durante a noite para permitir a penetração do tecido.
8. No dia seguinte, decantar a solução conservante de RNA em excesso e armazenar as amostras a-80 ° C. Remova o conservante tanto quanto possível antes de congelar as amostras. Use uma ponta de micropipeta P1000 e/ou P200 para uma eficiente remoção de solução conservante de RNA.
   Cuidado: Descarte a solução de preservação decantada apropriadamente, baseada nas propriedades infecciosas do agente patogénico utilizados bem como os riscos químicos e ambientais da solução conservante conforme especificado na ficha de segurança.
   Nota: As orientações fornecidas aqui são fornecidas para a solução de preservação de RNA descrita na Tabela de materiais. Consulte as orientações do fabricante se usando soluções alternativas de preservação.

4. processamento de RNA linfonodos

Atenção: Use um jaleco, luvas e protecção ocular adequada para as etapas de processamento.

Nota: O reagente fenol-base usado aqui é descrito na Tabela de materiais (e o protocolo baseia-se sobre as orientações do fabricante)²⁰. O uso de reagentes alternativos baseados em fenol pode necessitar de uma modificação do procedimento, com base em recomendações do fabricante para o produto específico adquirido.

1. Antes de acessar as amostras, pre-alíquota o reagente de fenol-base refrigerada (4 ° C) para tubos de homogeneização (1,5 mL/tubo), usando uma pipeta.
   Atenção: O fenol é tóxico, corrosivo e um perigo para a saúde. Clorofórmio é tóxico e um perigo para a saúde. Complete etapas de processamento 4.1-4,9 em uma capa das emanações químicas e usar luvas para evitar qualquer contacto com os produtos químicos. Nos Estados Unidos, o clorofórmio é um resíduos perigosos; Elimine os tubos contendo resíduos perigosos de acordo com as directrizes locais e institucionais. Processo de amostras de tecido de animais infectados com patógenos sob a BSL-2 correspondente, BSL-3 ou diretrizes de BSL-4.
2. Uma vez que uma amostra pode ser solta dos tubos de microcentrifuga com pinça limpa, imediatamente transferi aproximadamente 50-100 mg do tecido preservado para o tubo de homogeneização contendo o reagente fenol-baseado.
   1. Limite a descongelar antes da adição de reagente fenol-baseado. Use armazenamento em gelo seco quando múltiplas amostras são removidas do congelador para processamento.
3. Firmemente o tubo do tampão, coloque-o sobre o homogenizador e homogeneizar a amostra com um homogeneizador de rotor-estator no reagente fenol-baseado. Complete o processamento em temperatura ambiente. Quando terminar, verifique para uma aparência turva garantir que a amostra foi homogeneizada com êxito; o tecido deve ser disperso em uma suspensão turva.
   Nota: Uma configuração de extração de 2 min do RNA é usada (a configuração de RNA_02_1 pré-estabelecidos para o homogeneizador descrito na Tabela de materiais; projetado para tecidos congelados). O rotor-estator especificado no presente protocolo (ver a Tabela de materiais) é grande-dentado e adaptada para a homogeneização de uma gama de tipos de tecido, incluindo o material fibroso. A configuração de RNA_02_01 é projetada especificamente para congelados (ao contrário de frescos) tecidos. Como linfonodos tem componentes de tecido conjuntivo fibroso, recomenda-se um homogeneizador de rotor-estator do mesmo modo otimizado para alcançar uma dissociação eficaz. Consulte o Instituto Nacional de Ciências de saúde ambiental²¹ para obter informações adicionais sobre as recomendações de homogeneização.
   1. Se grandes pedaços de tecido permanecem após a homogeneização, repita o procedimento de homogeneização. A fim de recuperar com eficiência o RNA, o tecido deve ser bem dissociado.
   2. Para peças de linfonodo mais fibrosas, use pinças e tesouras pré-cortar o pedaço do nó de linfa em vários pedaços menores, antes da transferência para o tubo de homogeneização. Conforme descrito na introdução, linfonodo tecidos de animais mais velhos podem ser mais fibrosos.
      Nota: Se uma dupla análise do hospedeiro e patógeno RNA é desejada, tratamento adicional (como homogeneização do grânulo) pode ser necessário para a recuperação do RNA bacteriano, especialmente se patógenos gram-positivos estão presentes nos tecidos.
4. Imediatamente Retire os tubos de amostra homogeneizada e transferi-lo para livre de RNase microcentrifuga tubos (2,0 mL no tamanho) com uma micropipeta P1000.
5. Centrifugar a amostra por 5 min a 12.000 x g a 4 ° C para remover quaisquer resíduos da amostra. Usando uma ponta de micropipeta P1000, transferi o sobrenadante para um tubo de microcentrifugadora fresco, deixando a pelota.
6. Incube o sobrenadante por 5 min à temperatura ambiente. Dividi cada amostra entre microcentrifuga dois 1.5 tubos.
7. Adicionar 0,2 mL de clorofórmio por 1 mL do reagente fenol-base (ou seja, 0,3 mL de uma amostra de 1,5 mL); invertê-lo à mão por 1-2 min misturar as fases, mas não o vórtice da amostra. -Incube por 2 min à temperatura ambiente.
8. -Centrifugar por 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
9. Remova cuidadosamente a fase superior, aquosa clara, com uma ponta de micropipeta (P1000 ou P200) que formará a camada superior, sem interromper a intérfase ou camada de vermelho de fenol-clorofórmio. Transferi-lo para um novo tubo de microcentrifugadora.
10. Misturar com igual volume de etanol 100%; homogeneiza por inversão do tubo de 4 - 5 vezes. O tubo vai aparecer muitas vezes nublado.
11. Com uma ponta da micropipeta, transferi o líquido para uma coluna de rotação comercial baseada em sílica, purificar e eluir o RNA, seguindo instruções^{22 as indicações do fabricante}. Eluir o RNA gerado a partir de ~ 50 mg de tecido em 50-100 µ l de água livre de RNase.
    Nota: Enquanto a extração de reagente fenol-base remove DNA na fase orgânica, para o uso a jusante do RNA em qRT-PCR e/ou aplicações de sequenciação do ARN, é recomendado um tratamento adicional de amostras do RNA com DNase.
12. Alíquota do RNA eluted para separar os tubos para uso em uma avaliação de quantificação e de qualidade, para reduzir qualquer congelamento-descongelamento da amostra principal do RNA. Transferi os tubos a-80 ° C para armazenamento.
13. No caso de linfonodo amostras provenientes de animais infectados com patógenos zoonóticos, sobretudo a nível de contenção a BSL-3, validar a amostra de RNA resultante da ausência de patógenos se a amostra será movida para uma área de contenção nível de biossegurança inferior para análise da qualidade, RT-PCR, e/ou elaboração de biblioteca-a sequenciação do ARN.
    Nota: É fundamental considerar os regulamentos locais, e no caso das diretrizes de inactivação do CDC (centros de controle e prevenção de doenças) para trabalho com agentes selecionados, é necessário validar todos os procedimentos de inativação no site local do pesquisador.
    1. Remova volume 1/10^th de cada amostra de RNA eluted da etapa 4.12 (ou seja, 5 µ l de 50 µ l de RNA total). Usando uma técnica estéril, misture a amostra com 100 µ l de caldo de crescimento bacteriano em um tubo de microcentrifugadora estéril 1,5 mL. Usando um difusor de plástico estéril, espalhe a mistura de caldo-RNA através da superfície de uma placa de ágar.
       Nota: Selecione uma caldo tipo ágar placa e consistente com o crescimento do patógeno com o qual os animais foram desafiados.
    2. Incube a placa de ágar-ágar em condições específicas para o crescimento do patógeno com o qual os animais foram desafiados. Verifique a ausência de bactérias recuperadas antes de retirar as amostras a contenção BSL-3.
       Nota: O RNA eluted resultante, após a quantificação e testes de integridade, é adequado para aplicações a jusante, incluindo uma análise de RT-PCR e sequenciamento de RNA.
14. Avalie a recuperação de RNA e pureza usando um espectrofotômetro. Para avaliar a qualidade do RNA, carrega 1-2 µ l da amostra eluted RNA para o espectrofotômetro para uma análise. Grave um espectro da amostra na faixa ultravioleta (UV).
    1. Do espectro UV, gravar a uma₂₆₀/A₂₈₀ ratio, a uma₂₆₀/A₂₃₀ ratio e o valor para a amostra₂₆₀ (A = absorvância).
    2. Como single-stranded do RNA em uma concentração de 40 µ g/mL tem uma absorvância de 1.0 em 260 nm, calcular a concentração de RNA (µ g/mL), multiplicando-se o A₂₆₀ x 40 para as amostras purificadas.
15. Como um método rápido de avaliação da integridade do RNA, para excluir qualquer amostras degradadas de uma análise mais aprofundada, misture 2 µ l de cada amostra de RNA com 4 µ l de 1,5 x formamide de carregamento corante [95% desionisada formamida, 0.025% (p/v) de bromofenol, 0.025% (p/v) xileno cianol, 5 mM EDTA (pH 8.0), 0.025% (p/v) SDS] em 1,5 mL microcentrifuge tubos de^23,24.
16. Aqueça os tubos a 70 ° C por 1 min e depois transferir os tubos em gelo por 1 min.
17. Carregar as amostras de um gel de agarose 1% preparada em 1 x TBE (para uma descrição completa de uma eletroforese em gel de agarose nativo para o RNA, veja Rio, Ares Jr., Hannon e Nilsen)²⁴. Separar as amostras por métodos de eletroforese de gel de padrão e confirmar a presença de bandas de RNA ribossomal 28S e 18S.
18. Acompanhar a eletroforese em gel com métodos de análise quantitativa para a determinação de integridade do RNA [por exemplo, uma análise (número de integridade do RNA) Bioanalyzer e RIN] conforme descrito nos Resultados de representante e no Mueller, O. et al. ²⁵ e Schroeder, a. et al. ²⁶.

5. método de extração alternativa de fixada em formol, tecidos de parafina (FFPE)

Nota: Embora a preservação de tecidos FFPE não representa o método mais robusto de preservação de ácido nucleico, o protocolo apresentado abaixo pode ser uma maneira de estudar algumas alterações transcricionais quando outros tecidos preservados estão indisponíveis.

1. Prepare reagentes de formalina para a preservação do tecido pela dispensação formalina em recipientes de plástico. Os tecidos devem ser conservados em formol, com uma relação de peso/volume de formalina: tecido de 20:1, respectivamente.
   Atenção: O formol é um conhecido carcinógeno humano e embora não agudamente tóxicos, exposição crônica (normalmente através de vapores inalados) pode representar um risco significativo para a saúde. Ventilação adequada e PPE (ou seja, o uso de luvas de nitrilo, para ser alterado dentro de 15 minutos após a exposição inicial) são necessárias para minimizar os riscos de saúde. Referem-se à norma formaldeído OSHA (29 CFR 1910.1048) para obter informações adicionais sobre a exposição de monitoramento e avaliação de riscos.
   Nota: Usar muito pouco formol pode afetar a capacidade do tecido de tornar-se totalmente preservada quando submerso em conservante.
2. Após o isolamento do tecido de interesse, apare cuidadosamente o tecido a menos de 5 mm de espessura.
   1. Usando a pinça, cuidadosamente mergulhe o tecido aparado formalina para minimizar qualquer espirro.
      Nota: Os tecidos devem ser completamente mergulhados em formol para permitir uma completa fixação. É fundamental que todas as superfícies do tecido são completamente cobertas com formalina.
3. Uma vez que os tecidos têm sido submersa em formol, permitem a fixação de tecidos ocorra para pelo menos 24 horas à temperatura ambiente.
   Nota: Formol penetra tecidos lentamente, a uma taxa de 1 mm por hora de todas as superfícies^27,28. Portanto, mantendo a espessura das secções de tecido para menos do que os resultados de 5 mm em uma fixação rápida do tecido inteiro.
4. Após a fixação, transferi os tecidos para um reagente adequado para a incorporação de parafina.
   Nota: por exemplo, os tecidos examinados neste manuscrito foram transferidos para etanol a 70% antes da incorporação.
5. Incorpore os tecidos em parafina. ²⁹
6. Secção do tecido para 80-10 µm de espessura (uso 10-20 µm se miRNA é desejado a ser extraído)²⁹.
7. Usando o bisturi e pinça, retire um pedaço de tecido de 40 mg de cada amostra a ser processada e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga estéril, livre de nuclease.
8. Utilize um kit comercial projetado para deparaffinization e recuperação de ácidos nucleicos de amostras de tecido FFPE para extrair o RNA das amostras preservadas.
   Nota: O kit referenciado na Tabela de materiais utiliza xileno e etanol lava para remover a parafina, uma etapa de tratamento de protease e um filtro de fibra de vidro para purificar o RNA.

Resultados

O uso das considerações apresentadas neste artigo (passos 1-4 do protocolo) vai ajudar na recuperação do RNA de grandes amostras de animais que é adequada para uma análise a jusante em estudos de expressão de gene de anfitrião. A qualidade do RNA para aplicações a jusante é avaliada através de várias medidas padrão. Por espectrofotometria, a uma₂₆₀/A₂₈₀ ratio fornece uma medida da contaminação da proteína, e a uma₂₆₀/A₂₃₀ ratio fornece um outro meio de avaliação de pureza que i...

Discussão

A maioria dos estudos de transcriptomic e os protocolos associados concentrar em amostras humanas, rato, rato ou post-mortem. No entanto, investigações em animais e animais selvagens fornecem uma ampla gama de oportunidades para a caracterização da resposta imune à doença, tanto como aplicáveis à medicina veterinária e, no que diz respeito a doenças zoonóticas, a saúde pública. Este protocolo fornecido um resumo das considerações-chave para extração de RNA de alta integridade de tecidos de animais de grandes porte, tais ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de preservação de RNA (usamos RNALater para todos os experimentos)	ThermoFisher	AM7020
tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 ml ou 2 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Bisturis descartáveis	Daigger Scientific	EF7281
Pinça de tecido, dente de rato	Fisher Scientific	12-460-117	Outras pinças de tecido disponíveis, incluindo ponta curvada, borda cônica, etc., dependem da preferência do usuário
Agulhas de biópsia por punção de 3 mm	Fisher Scientific	NC9949469
Recipiente para objetos cortantes (pequeno e transportável para necropsia)	Stericycle	8900SA	1 qt. tamanho mostrado aqui
Tábuas de corte ou bandejas descartáveis	Fisher Scientific	09-002-24A	Disponível em uma variedade de tamanhos, depende da preferência do usuário
Equipamento			Varia com o patógeno (luvas, máscaras respiratórias, óculos, etc.)
Reagente de extração de RNA à base de fenol (usamos o reagente TRIzol para todos os experimentos)	ThermoFisher	15596026
kit de extração de RNA baseado em coluna de sílica (usamos o kit PureLink RNA Mini para todos os experimentos)	ThermoFisher	12183018A	Projetado para até 100 mg de
tecido 100% etanol (200 provas para biologia molecular)	Sigma-Aldrich	E7023
Homogeneizador de tecidos com tubos de homogeneização fechados (usamos o dissociador gentleMACS para todos os experimentos)	Miltenyi Biotec	130-093-235
Agarose (Geral, para eletroforese em gel)	Sigma-Aldrich	A9539
1X	TBE Fisher Scientific	BP24301	Também pode fazer do zero em laboratório Formamida
deionizada	EMD Millipore	S4117
Dodecil sulfato de sódio	Sigma-Aldrich	L3771
Azul de bromofenol	Sigma-Aldrich	114391
Xileno cianol	Sigma-Aldrich	X4126
EDTA (ácido etilenodiaminotetracético)	Espectrofotômetro Sigma-Aldrich	EDS
UV-Vis (usamos o espectrofotômetro NanoDrop)	Dispositivo ThermoFisher	ND-2000
para avaliação quantitativa de RNA (usamos o Bioanalyzer, com componentes e protocolos associados)	Agilent	G2939BA
Kit de extração de RNA FFPE (usamos o Kit de Isolamento de Ácido Nucleico Total RecoverAll para Tecido Fixado em Formalina, Embebido em Parafina)	ThermoFisher	AM1975
Espalhador de plástico (espalhador em forma de L)	Fisher Scientific	14-665-231	Necessário apenas para testes de esterilidade para amostras de animais infectados
Facas de necropsia	Livestock Concepts	WI-0009209