Artigo de método

Um sistema de Microbiomechanical para estudar a formação de varizes e a recuperação no axônio do neurônio Central

DOI:

10.3791/57202

⸱

30 de abril de 2018

 ,  , 
1Molecular, Cellular, and Developmental Biology Program, The Ohio State University, 2Department of Biological Chemistry and Pharmacology, The Ohio State University, 3Biogen

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve uma abordagem fluida pressurizada, fisiologicamente relevante para a indução rápida e reversível de varizes nos neurônios.

Resumo

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Varizes axonal são estruturas alargadas dos poços de axônios com um alto grau de heterogeneidade. Eles estão presentes não só no cérebro com doenças neurodegenerativas ou ferimentos, mas também no cérebro normal. Aqui, descrevemos um sistema recém-criada Micromecânico para rápida, confiável e reversível induzir axonal varicosidades, permitindo-na compreender os mecanismos que regem a formação de varizes e composição de proteínas heterogêneas. Este sistema representa um romance meio para avaliar os efeitos do estresse de compressão e cisalhamento em diferentes compartimentos subcellular de neurônios, diferentes de outros sistemas em vitro que concentram-se principalmente sobre o efeito de alongamento. Importante, devido as características únicas do nosso sistema, recentemente fizemos uma descoberta romance, mostrando que a aplicação do fluido pressurizado pode rapidamente e reversivelmente induzir varicosidades axonal através da ativação de um canal potencial transiente do receptor. Nosso sistema biomecânico pode ser utilizado convenientemente em combinação com perfusão de drogas, célula viva de imagem, imagem de cálcio e gravação de braçadeira do remendo. Portanto, esse método pode ser adotado para o estudo de canais de íon mechanosensitive, regulamento de transporte axonal, dinâmica do citoesqueleto axonal, sinalização de cálcio e alterações morfológicas relacionados ao traumatismo crânio-encefálico.

Introdução

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Formação de varizes ou inchaço/perolização, ao longo do axônio, é uma característica proeminente de neurodegeneração observada em muitos distúrbios ou lesões do sistema nervoso central, incluindo esclerose múltipla, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e traumáticas 1,de lesão cerebral2. Apesar dos impactos fisiológicos significativos de varicosidades axonal na propagação do potencial de ação e transmissão sináptica3, como as varizes são geradas permanece desconhecida. Recentemente, usando um ensaio microbiomechanical recém-criada em neurônios hippocampal culturas de roedores, desco....

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Protocolo

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Todos os métodos descritos a seguir foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Ohio State University.

1. preparação lamela

  1. Coloque uma ou mais caixas de lamelas de 12 mm ou 25 mm para um copo de vidro contendo 70% de ácido nítrico e incubar as lamelas à temperatura ambiente durante a noite.
    Nota: Não lave as lamelas de 25 mm na mesma medida como as lamelas de 12 mm. É melhor lavá-las separadamente.
  2. Transferir todas as lamelas para um copo de 4L preenchido com 2,5 L de DDQ2O e agitar o béquer contendo as lamelas para 1 h a 100 rpm. Use elásticos para segurar o co....

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Resultados

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Antes de soprar, axônios normalmente mostram pouca formação de varizes. Seguir fumando com nosso padrão de pressão (190 mmH2O altura), o início de axônios para desenvolver varizes de grânulo, como muitas. A formação de varizes é parcialmente reversível, conforme mostrado pelas regiões do axônio retornando ao seu estado pré-inchado após um período de recuperação de 10 min (Figura 2A-B). Após um longo período de recuperação (> 20 .......

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Discussão

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O procedimento de ensaio este microbiomechanical é para a frente. Produzirá resultados fiáveis, se todos os seus passos são cuidadosamente realizados. Existem várias etapas-chave que, se incorrectamente executados, vão dificultar a coleta de dados bem sucedida. Os passos críticos começam a montante da aplicação real do sopro estímulo. Dissecção cuidadosa, cultivo e cuidados da cultura neurônio primário são primordiais. Se os neurônios cultivados não são saudáveis, não reagirão consistentemente, desde que eles podem ter j.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com os institutos nacionais de Saúde Animal uso orientações. Este trabalho foi financiado em parte por concessões do National Institutes of Health (R01NS093073 e R21AA024873) para C. Gu.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
lamínulas de 12 mm Warner Instruments 64-0702para placa de 24 poços 
lamínulas de 25 mm Fisher Scientific 12-545-102 para placa de 6 poços 
Ácido acéticoFisher Scientific A38-212
Poli-D-lisinaSigma P6407
Colágeno de cauda de rato Roche 11 179 179 001 
10X PBS Diagnósticos Nacionais CL-253
Na2SO4Fisher Scientific S373-500
K2SO4Fisher Scientific P304-500
HEPES Fisher Scientific BP410-500
D-glicose Fisher Scientific D16-500
MgCl2Fisher Scientific BP214-500
NaOHFisher Scientific Enzima protease SS255-1
Sigma P4032
FBSGibco 26140
Piruvato de sódio Gibco 11360-070
L-glutaminaGibco 
Penicilina/Estreptomicina 100x (P/S)Gibco 
Sais de MEM Earle Gibco Suplemento 11090
B27Gibco 17504-044
Neurobasal Gibco 21103-049
Arabinosilcitosina (Ara-C)Sigma 147-94-4
Mídia Opti-MEM Gibco 31985-070
Lipofectamine 2000Invitrogen 1854313reagente de transfecção 
Hastes de borossilicato World Precision Instruments Inc. PG52151-4para pipeta de sopro 
tubulação de borracha Fisher Scientific 14-169-1A
10ccBecton Dickinson 
micromanipulador Instrumentos Sutter
NaCl Fisher Scientific S640-3
KCl Fisher Scientific BP366-500
CaCl2Fisher Scientific C70-500
Placa de cultura de células (35 mm x 10 mm)Corning 3294
Fluo-4 AMSondas MolecularesF14201para imagens de cálcio 
Construção Mito-YFP Takara Bio Inc. para transfecção celular 
Construção YFP-N1Takara Bio Inc. para transfecção celular 
Modelo P-1000 Extrator de Micropipeta Flamejante/Marrom Instrumentos Sutter
Eclipse TE2000-U Mcroscope Lente Nikon
Plan Fluor ELWD 20x   Objetivo 062933 da Nikon
Lente a óleo Apo TIRF 100x/1.49 Objetivo MRD01991 da Nikon
2503008115140122Seringa e êmbolo de plástico

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
  2. Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration....

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