Hipofunção das glândulas salivares é uma consequência frequente da terapia de radiação e doença auto-imune. Reprodutível avaliação da função da glândula salivar em modelos do rato destas doenças é um desafio técnico. Aqui, um método simples para a medição exata e reproduzível da produção de saliva em camundongos é descrito.
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Artigo de método
Um método para a medição da função da glândula salivar em ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Pacientes com síndrome de Sjögren, uma doença auto-imune que afectam as glândulas exócrinas, desenvolvem a inflamação das glândulas salivares e reduziram a produção de saliva. Da mesma forma, a produção de saliva é severamente comprometida em pacientes recebendo tratamento com radiação para câncer de cabeça e pescoço. Modelos de roedores, desenvolvidos para imitar essas condições clínicas, facilitam uma compreensão da patogênese da doença e permitam o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Portanto, a capacidade de precisão reproducibly e repetidamente medir a função da glândula salivar em modelos animais é crítica. Base em procedimentos previamente descritos na literatura, um método foi desenvolvido que atende a esses critérios e foi utilizado para avaliar a função da glândula salivar em camundongos. Uma vantagem adicional deste novo método é que ele é facilmente dominado e tem pouca variação inter operador. Função da glândula salivar é avaliada como a quantidade (volume ou peso) ou taxa (mL/min) de saliva produzida em resposta à estimulação de pilocarpina. A saliva coletada é uma boa fonte para as análises do teor de proteínas, as concentrações de imunoglobulinas e outras biomoléculas.
Introdução
As glândulas salivares produzem saliva em resposta a uma variedade de estímulos neurológicos e mecânica1. Os estímulos são transportados através do sistema nervoso simpático e parassimpático aos receptores adrenérgicos e colinérgicos na glândula. Pilocarpina é um agente colinérgico, Pará-simpaticomimética que atua predominantemente sobre os receptores muscarínicos. Na glândula salivar, que induz a produção de saliva, agindo sobre os receptores de acetilcolina muscarínicos M31. Produção de saliva, após a administração de pilocarpina é um indicador da capacidade de responder à estimulação das glândulas salivares e é comumente usada como uma medida da função da glândula salivar.
Medição da produção de saliva é fundamental no estudo de doenças das glândulas salivares, incluindo Síndrome de Sjögren2 e lesão de radiação de tratamento de câncer cabeça e pescoço3a seguir. Diversos métodos foram desenvolvidos para medir a produção de saliva em roedores. Estes incluem canulação direta do Ducto excretor salivar4, coleta de saliva da cavidade oral sob vácuo5e coleção usando de capilares de vidro6 ou7,uma micropipeta,8, 9. direto a canulação do ducto salivar fornece saliva mais preciso e puro. No entanto, este é um procedimento tecnicamente desafiador, e o potencial para causar lesão ductal impede a coleções de saliva repetitiva do mesmo animal. Coleta de saliva sob vácuo pode levar a resultados variáveis devido à secagem da saliva do tubo. Esta perda é mais exagerada em camundongos com salivação reduzida. Capilares de vidro permitem a coleta de saliva para análises subsequentes, no entanto, as alterações na viscosidade da saliva secretada no estado doente impede enchimento eficiente do capilar. Além disso, as tentativas de varrer a cavidade oral para coletar saliva residual podem causar ferimentos. O método de pipeta permite a coleção completa, e para o mesmo operador, é notavelmente consistente entre as experiências. No entanto, por razões desconhecidas, esse método mostra uma variação significativa entre os diferentes operadores. Portanto, para permitir comparações apropriadas, torna-se imperativo que o mesmo operador realiza todas as experiências relacionadas a um projeto específico. Claramente, isto representa uma grande desvantagem para um laboratório.
Para superar esses problemas, um procedimento foi desenvolvido que combina métodos de recolha de saliva usada para seres humanos e roedores. O método da zaragatoa, descrito abaixo para medir o volume de saliva induzidas pela pilocarpina é simples, reprodutível, não influenciada pelo operador e pode ser executado repetidamente no mesmo animal. Além disso, permite a coleta de saliva para posteriores análises de proteínas, imunoglobulinas ou outras biomoléculas.
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Protocolo
O protocolo descrito abaixo foi aprovado pelo Comitê de uso e cuidado institucional do Animal e segue as diretrizes éticas estabelecidas pelos institutos nacionais de saúde. Todos os dados apresentados neste relatório foram gerados usando ratos fêmeas que eram 10-12 semanas de idade. Foram utilizadas as seguintes cepas de ratos: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S e F1 (B6XA/J). Todos os ratos foram alojados em gaiolas de barreira (5 animais por gaiola) em condições específicas isentos de organismos patogénicos e fornecidos a ração e água ad libitum.
1. preparação
- Para preparar uma solução de cloridrato de pilocarpina, pesa 10 mg do composto e dissolvê-lo em 1,776 mL de solução salina isotônica estéril vortexing, para dar uma solução stock de 5,63 mg/mL. Não há nenhuma necessidade para esterilizar esta solução. Mas, se desejado, filtrá-la através de um filtro de 0,2 µM. Loja desta solução em alíquotas múltiplas em um freezer-80 oC por até 3 meses. Cada estoque congelado é para uso individual. Uma vez descongelado, não volte a congelar a solução pilocarpina.
- Levar a 0,6 mL tubos de microcentrífuga e cuidadosamente um buraco pequeno na parte inferior de cada tubo com uma agulha de calibre 18 aquecida. Defina esses tubos para tubos de 2 mL. Os tubos não precisam ser estéril.
- Usando uma lâmina de barbear afiada, estéril, corte cilíndricos cotonetes absorventes em cerca de 2 cm de comprimento. Corte cada pedaço de 2 cm na diagonal para dar 2 cotonetes em forma cônicas. Coloque um cotonete em cada um dos tubos de microcentrífuga de 0,6 mL.
- Pese o tubo de microcentrífuga de 0,6 mL contendo o swab seco.
- Transferi os ratos para ser estudado em uma nova gaiola limpa com garrafas de água. Manter os ratos sem comida pelo menos 2 h antes do início da coleta de saliva para impedir que partículas de comida que está contaminando a saliva coletada.
Nota: Não é necessário manter o 1 rato por gaiola para este procedimento. No entanto, o número de ratos colocados em cada gaiola depende da instituição específica de regras e regulamentos para uso de animais. - Pouco antes do fim de 2h, prepare a solução de trabalho de pilocarpina (0,0563 mg/mL) diluindo a solução-mãe de 100x em soro fisiológico estéril. Não é necessário mais filtro esterilizar esta solução. Mantenha sempre a solução pilocarpina no gelo.
Nota: A tabela 1 dá a quantidade de pilocarpina deve ser injetado para uma gama de pesos de corpo do mouse para dar uma dose final de 0,375 mg/kg de peso corporal.
2. o procedimento
- Pesar cada rato e determinar a dose da mistura anestésica para cada mouse usando a tabela 1. Injete o primeiro rato com o volume adequado da mistura anestésica por via intraperitoneal. Defina o temporizador para 2 min (maioria das cepas de rato testado neste protocolo ir para dormir por 2 min). Certifique-se de que o mouse é devidamente anestesiado pela falta de andar quando colocado sobre uma superfície plana. Se o mouse ainda está andando, espere 2min adicional antes de prosseguir para a próxima etapa. Aplique uma gota de lubrificante pomada oftálmica de ambos os olhos para impedir a secagem.
Nota: Na tabela 1, a dose da mistura anestésica é 0,007 mL/g de massa corporal. O intervalo ideal para este procedimento é 0,006 a 0,008 mL/g de massa corporal. No entanto, após 4 min, se o mouse ainda é andar ou exibindo movimentos espasmódicos, consulta com o veterinário institucional para adequadamente, aumentando a dose de anestésico. - Determinar a dose de pilocarpina para o mouse usando a tabela 1 e injetar a quantidade adequada por via intraperitoneal. Definir o timer por 2 min e colocar o mouse no tubo de retenção de 50 mL até a cabeça e orelhas fica fora do corte final. Coloque o tubo em um ângulo de 45 graus, com a cabeça para baixo e a superfície ventral virada para cima. Fita do tubo para a placa de procedimento para mantê-lo de se mover.
Nota: A tabela 1 fornece dosagem para ratos, mais de 17 g, como este procedimento não tem sido tentado em ratos com peso abaixo de 17 g. - No final de 2 min, gentilmente Insira um par fechado de micro pinça de dissecação na boca e levantar a mandíbula inferior para cima para abrir a boca. Empurre a pinça 1-2 milímetros mais dentro da boca, certificando-se de que a língua é vista descansando no braço superior da pinça. Com outro par de pinças bem, segure o cotonete seco pré-pesados perto de sua ponta cônica.
- Deslize suavemente a ponta cónica do cotonete na boca. Retire a pinça, deixando a ponta do swab na cavidade oral.
- Segure a ponta mais larga da zaragatoa estendendo-se fora da boca e girá-lo para permitir a máxima área de contato com a boca. Fique com o cotonete nesta posição por 15 min.
Nota: Isso garante que o swab permanece na boca para a duração da coleção. Note que a ponta cónica do cotonete atua como um pavio, e a maior parte do swab permanece fora da boca. - No final de 15 min, delicadamente gire o swab para coletar qualquer saliva que não foi absorvido e coloque o cotonete molhado no tubo de microcentrífuga de 0,6 mL. Fechar o tubo e configurá-lo no tubo 2 mL colocado no gelo.
Nota: Neste momento, a mucosa oral aparecerá completamente seca. O mouse pode agora ser voltou para sua gaiola para a recuperação da anestesia. - Transferi o rato na gaiola. Coloque o alimento umedecido pelotas na gaiola após a coleta de saliva para ajudar a reidratação mais rápida.
Nota: Os ratos acordar dentro de 10 min após o final da coleção. Injeção subcutânea de salina isotônica pré-aquecido de 0,2 mL também pode ser dada para acelerar a recuperação. - Prossiga para o próxima do mouse. Todos os ratos devem ser monitorizados até que tenham completamente recuperados e são ambulatoriais.
3. as medições
- No final de todas as coleções, pese os tubos de 0,6 mL com o cotonete molhado. Calcule a diferença entre o peso molhado e seco para obter o peso da saliva produzida. Coloca o tubo de 0,6 mL saliva de volta no tubo de 2 mL.
- Corte as tampas dos tubos de 2 ml. Em seguida, centrifuga os tubos de 2 mL por 2 min a 7500 x g, em 4oC em uma centrífuga micro para recuperar a saliva. Medir o volume de saliva obtido utilizando uma micropipeta.
- Expressar os resultados como saliva peso (mg)10 a mais de 15 min, ou como uma relação do peso de saliva (mg) / peso corporal (g) de rato.
Nota: Se o volume de saliva extraído fora o swab foi medido, expressar os resultados como o volume de saliva recuperado (mL) ou a proporção do volume de saliva (mL) / peso corporal (g) de rato.
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Resultados
Nos sistemas de modelo experimental do mouse, a capacidade de produzir saliva em resposta à estimulação de pilocarpina é usada como um indicador da função das glândulas salivares. Produção de saliva era medida em ratos fêmeas de C57BL/6 de 11 semanas de idade pelo método cotonete. Na figura 1A, os resultados são expressos como a quantidade de saliva (mg) coletado após doses crescentes de pilocarpina. Com a dose de 1 mg/kg de peso corporal, alguns dos ratos co...
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Discussão
Produção de saliva é um processo complexo e é influenciada por muitos fatores. Portanto, medir a função da glândula salivar em animais de laboratório pode ser um desafio. Um desafio adicional é que medidas repetidas da função das glândulas salivares no mesmo animal são necessárias para estabelecer o início da doença ou para demonstrar a recuperação após o tratamento.
O método da zaragatoa descrito neste relatório é tecnicamente simples para realizar com várias opções para representar os dados....
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Divulgações
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
O estudo foi suportado por um fundo do National Institutes of Health, Instituto Nacional de dentária e Craniofacial Research (DE025030).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Produtos químicos para coleta de saliva | |||
| pilocarpina | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, EUA | B21410 | Diluir em solução salina isotônica estéril. Armazene alíquotas de uso único de estoque 100X em -80oC |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Solução de mistura de anestesia | Misture 1 mL de cloridrato de cetamina + 0,5 mL de xilazina + 8,5 mL de solução salina isotônica estéril em um frasco estéril. Pode ser usado por 3 meses. | ||
| Vetamina (cloridrato de cetamina) | Vet One, Boise, Idaho, EUA | C3N VT1 | O estoque é de 100 mg / mL |
| Anased (xilazina) | Med-Vet International, Mettawa, IL, EUA | RXANASED-20 | O estoque é de 20 mg / mL |
| Solução salina estéril isotônica | Vet One, Boise, Idaho, EUA | 501032 | Usado como diluente |
| Lágrimas artificiais (pomada oftálmica lubrificante) | Henry Schien, Dublin, OH, EUA | 48272 | Usado para evitar que os olhos sequem durante o procedimento |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Materiais para coleta de saliva | |||
| SalivaBio Cotonete infantil | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, EUA | N/A | Cotonetes embalados individualmente |
| Tubos de polipropileno de 50 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Corte a parte inferior de 1 cm do tubo. Certifique-se de que a borda cortada esteja lisa. |
| Tubos de microcentrífuga de 0,6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Faça furos no fundo do tubo com agulhas aquecidas de calibre 18 |
| Tubos de microcentrífuga de 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Seringas de insulina com agulhas permanentemente fixadas | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| agulhas chanfradas regulares de calibre 18 | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EUA | 305195 | |
| Lâmina de bisturi estéril #11 | Integra York Inc PA, EUA | 4-311 | |
| Pinça de microdissecação | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Ponta angular serrilhada de 0,8 mm, comprimento de 4" |
| Fita adesiva | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA | sc-224487 | |
| Temporizador de 3 canais | Amazon.com, Seattle, WA, EUA | B06W2KCYVN | |
| Balança Analítica | Mettler Toledo, Columbus OH, EUA | ||
| strong>Nome | Empresa | Número de Catálogo< | strong>Comentários |
| Chemicals/ reagentes para induzir disfunção salivar | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, EUA | tlrl-b5lps | Dissolva em água livre de endotoxinas e armazene a solução de estoque a 5 mg / mL. diluir em HBSS estéril 100 ug / mL - injetar 100 uL / moue ip |
| Imject Alum adjuvante | Thermo Scientific | 77161 | Diluir 1: 1 em solução salina estéril. Injetar intraperitonealmente 0,1 mL / camundongo |
| Coelho anti-soro anti-Ro52 | Gerado em laboratório | Imunização de coelhos com camundongo recombinante Ro52 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Chemicals/ Kits para análises de saliva | |||
| Estimativa de lisozima salivar | |||
| EnzChek Kit de Ensaio de Lisozima | Sondas Moleculares, Eugene, OR, EUA | E-22013 | Usado conforme as instruções do fabricante |
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| Estimativa de IgA salivar por sanduíche ELISA | |||
| Camundongo IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, EUA | 0106-01 | Padrões para sanduíche ELISA - faixa de 30 ng/mL a 0,5 ng/mL |
| IgA anti-camundongo de cabra não rotulada | Southern Biotech, Birmingham, AL, EUA | 1040-01 | Revestimento a 1 ug/mL em tampão de bicarbonato |
| Cabra anti-camundongo IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, EUA | 1040-05 | Anticorpo de detecção usado em substrato TMB de diluição 1:4000 |
| Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EUA | 555214 | Usado de acordo com as instruções do fabricante | |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 placas de poços | Thermo Scientific, Rochester, NY, EUA | 3855 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Estimativa de proteína salivar | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 Para estimativa de proteína de acordo com as instruções do fabricante |
Referências
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Reimpressões e permissões
