Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca2 +-imagens e ensaios de degranulação

Volodymyr Tsvilovskyy; Alejandra Solis-Lopez; Kathrin Öhlenschläger; Marc Freichel

doi:10.3791/57222

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Artigo de método

Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca^{2 +}-imagens e ensaios de degranulação

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DOI:

10.3791/57222

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4 de julho de 2018

Volodymyr Tsvilovskyy¹ , Alejandra Solis-Lopez¹ , Kathrin Öhlenschläger¹ , Marc Freichel¹

¹Institute of Pharmacology, Ruprecht-Karls Heidelberg University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar os mastócitos peritoneais murino. Também descrevemos dois protocolos para a sua caracterização funcional: uma imagem fluorescente de enciclopédia Ca^{2 +} concentração intracelular e um ensaio de degranulação baseado na quantificação colorimétrica de β-hexosaminidase a liberado.

Resumo

Mastócitos (MCs), como parte do sistema imunológico, um papel fundamental na defesa do hospedeiro contra vários patógenos e no início da resposta imune alérgica. A ativação de MCs através do cross-linking de superfície IgE ligado ao receptor de IgE de alta afinidade (FcεRI), bem como através da estimulação de vários outros receptores, inicia a ascensão do livre intracelular Ca^{2 +} nível ([Ca^{2 +}]_eu) que promove a liberação de mediadores inflamatórios e alérgicos. A identificação dos constituintes moleculares envolvidos nessas vias de sinalização é crucial para a compreensão da regulação da função MC. Neste artigo, descrevemos um protocolo para o isolamento do tipo murino tecido conjuntivo MCs pela lavagem peritoneal e cultivo de MCs peritoneais (EPM). Culturas de MCs de vários modelos de rato nocaute por esta metodologia representam uma abordagem útil para a identificação das proteínas envolvidas na MC vias de sinalização. Além disso, podemos também descrever um protocolo para unicelulares Fura-2 de imagens como uma técnica importante para a quantificação de Ca^{2 +} sinalização no MCs. baseada em fluorescência monitoramento de [Ca^{2 +}] é um confiável e comumente usado abordagem estudo de Ca^{2 +} sinalização de eventos, incluindo a entrada de cálcio operada a loja, que é de extrema importância para a ativação do MC. Para a análise de MC degranulação, descrevemos um ensaio de liberação de β-hexosaminidase. A quantidade de β-hexosaminidase lançado no meio de cultura é considerada como um marcador de degranulação para todos os três diferentes secretoras subconjuntos descrito no MCs. β-hexosaminidase facilmente pode ser quantificado pela sua reação com um substrato de colorigenic em um ensaio colorimetric da placa da microplaca. Esta técnica altamente reprodutível é cost-effective e exige nenhum equipamento especializado. No geral, o protocolo fornecido demonstra um alto rendimento de MCs expressando marcadores de superfície típicas MC, exibindo características fenotípicas e morfológicas típicas da MCs e demonstrando respostas altamente reprodutíveis para secretagogues de Ca^{2 +}- ensaios de imagem e degranulação.

Introdução

MCs desempenham um papel proeminente durante respostas de imune inatas e adquiridas. Especificamente, MCs participarem na morte de patógenos, como bactérias e parasitas e também degradam peptídeos endógenos potencialmente tóxicos ou componentes de venenos (para revisão, consulte Galli et al . 2008¹). O papel fisiológico de MCs na inata e imunidade adaptativa é objecto de debate acalorado. Portanto, as inúmeras discrepâncias de dados nos estudos realizados com diferentes modelos de rato MC-deficientes exigem uma reavaliação sistemática de funções imunológicas de MCs além de alergia². MCs maduros são localizadas p....