Summary
Vi præsenterer her, to protokoller til måling af mitokondrie Ca2 + tilstrømning i isolerede mitochondrier og dyrkede celler. For isolerede mitochondrier, vi detalje en plade reader-baserede Ca2 + import analyse ved hjælp af Ca2 + følsomme farvestof calcium grøn-5N. For dyrkede celler beskriver vi en Konfokal mikroskopi metode ved hjælp af Ca2 + farvestof Rhod-2/AM.
Abstract
Ca2 + håndtering af mitokondrier er en kritisk funktion regulering både fysiologiske og patofysiologiske processer i et bredt spektrum af celler. Evnen til at præcist at måle tilstrømning og udstrømningen af Ca2 + fra mitokondrier er vigtige til bestemmelse af rollen mitokondriel Ca2 + håndtering i disse processer. I denne rapport præsenterer vi to metoder til måling af mitokondrie Ca2 + håndtering i både isolerede mitochondrier og dyrkede celler. Vi detalje først en plade reader-baseret platform til måling af mitokondrie Ca2 + optagelse ved hjælp af Ca2 + følsomme farvestof calcium grøn-5N. Plade reader-baseret format omgår behovet for specialiseret udstyr, og calcium grøn-5N farvestof er velegnet til måling af Ca2 + fra isoleret væv mitokondrier. For vores ansøgning beskriver vi måling af mitokondrie Ca2 + optagelse i mitokondrierne isoleret fra mus hjerte væv; men denne procedure kan anvendes til at måle mitokondrie Ca2 + optagelse i mitokondrierne isoleret fra andre væv som leveren, skeletmuskulatur og hjerne. For det andet vil beskrive vi en Konfokal mikroskopi-baseret analyse til måling af mitokondrie Ca2 + i permeabilized celler ved hjælp af Ca2 + følsomme farvestof Rhod-2/AM og imaging ved hjælp af 2-dimensionelle laser scanning mikroskopi. Denne permeabilization protokol eliminerer cytosole farvestof kontamination, giver mulighed for specifikke registrering af ændringer i mitokondrie Ca2 +. Derudover laser scanning mikroskopi giver mulighed for høj billedhastigheder at fange hurtige ændringer i mitokondrie Ca2 + reaktion på forskellige narkotika eller reagenser, der anvendes i den eksterne løsning. Denne protokol kan anvendes til at måle mitokondrie Ca2 + optagelse i mange celletyper, herunder primærelementer som hjertets myocytes og neuroner og udødeliggjort cellelinjer.
Introduction
Mitokondrier er kritiske lokaliteter af intracellulære Ca2 + opbevaring og signalering. Årtiers forskning har vist, at mitokondrier har evnen til at importere og udskille Ca2 + 1,2. Mitokondrier, er imidlertid ikke kun passive websteder af Ca2 + opbevaring. Ca2 + på den mitokondrielle rum udfører grundlæggende signaling funktioner herunder regulering af metaboliske output og aktivering af mitokondrie-medieret celle død veje, som har været gennemgået tidligere3. For metabolisk regulering øger Ca2 + aktiviteten af tre matrix-lokaliseret dehydrogenases tricarboxylic syre cyklus samt respiratoriske kæde komplekser, at øge mitokondriets energi produktion4,5 . Med mitokondrie Ca2 + overbelastning og dysregulated mitokondrie Ca2 + håndtering, Ca2 + udløser mitokondrie permeabilitet overgangen pore (MPTP) åbning, fører til indre membran permeabilization, membran potentielle tab, mitokondriel dysfunktion, hævelse, brud og i sidste ende, celle død6,7,8,9. Således påvirker mitokondrie Ca2 + signalering direkte både cellulært liv og død stier gennem metabolisk kontrol og MPTP-død akse.
I de seneste år, der har hastigt voksende interesse for studiet af mitokondrie Ca2 + dynamics skyldig i stor del til identifikation af molekylære bestanddele af den mitokondrielle Ca2 + uniporter komplekse, en mitokondrie indre membran transporter, der er en primær tilstand af Ca2 + importere ind i mitokondriets matrix 10,11,12. Identifikation af disse strukturelle og regulerende underenheder af uniporter har frembragt muligheden for genetisk målretning mitokondrie Ca2 + tilstrømning til at modulere mitokondrie-funktion og dysfunktion og lettet studiet af den bidrag af uniporter komplekse og mitokondriel Ca2 + tilstrømningen til sygdom13,14,15. Faktisk, mitokondrie Ca2 + signalering har været impliceret i patologier af en bred vifte af sygdomme lige fra hjertesygdomme neurodegeneration og kræft16,17,18, 19,20.
Den grundlæggende betydning af mitokondrie Ca2 + signalering i metabolisme og celledød, og kombineret med den bred rækkevidde af biologiske systemer påvirkninger at mitokondriel Ca2 + signalering, metoder til at evaluere mitokondrie Ca2 + tilstrømning er af stor interesse. Ikke overraskende er blevet udviklet en række teknikker og værktøjer til at måle mitokondrie Ca2 + . Disse omfatter metoder, der anvender værktøjer såsom fluorescerende Ca2 +-følsomme farvestoffer21,22 og genetisk kodet Ca2 + sensorer målrettet til mitokondrier, såsom cameleon og aequorin23, 24. Målet med denne artikel er at belyse forskellige metoder og modelsystemer som mitokondrielle Ca2 + optagelse kan måles. Vi præsentere to eksperimentelle metoder til at vurdere mitokondrie Ca2 + tilstrømning kapacitet. Med hjerte mitokondrier som eksempel, vi detalje en plade reader-baseret platform til måling af mitokondrie Ca2 + optagelse ved hjælp af Ca2 + følsomme farvestof calcium grøn-5N, der er velegnet til isoleret væv mitokondrier14 . Ved hjælp af kulturperler NIH 3T3 celler, beskrive vi også en Konfokal mikroskopi imaging-baseret analyse til måling af mitokondrie Ca2 + i permeabilized celler ved hjælp af Ca2 + følsomme farvestof Rhod-2/AM25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der beskrives i denne protokol er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Emory University.
Bemærk: Den første del er den eksperimentelle procedure til måling af mitokondrie Ca2 + tilstrømning i isolerede hjerte mitokondrier ved hjælp af en Pladelæser.
1. reagenser og løsninger
- Gøre 500 mL af MS-EGTA buffer til mitokondrie isolation: 225 mM mannitol, 75 mM saccharose, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES), 1 mM ethylenglycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic syre (EGTA), pH justeret til 7,4 med KOH. Sterilisere det gennem et 0,22 μm filter og opbevares ved 4 ° C. Sikre, at MS-EGTA buffer pre kølet til 4 ° C før brug.
- Forberede 100 mL KCl Buffer: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 40 μM EGTA og pH indstillet til 7,2 med KOH. Opbevar den ved stuetemperatur.
- Forberede 1 mM calcium grøn-5N lager i dimethylsulfoxid (DMSO). Calcium grøn-5N materiel kan være aliquotted og opbevares ved-20 ° C.
-
Forberede substrater for Ca2 + optagelse.
- Forberede 1 M natrium pyruvat, pH 7,4. Opbevares i alikvoter ved-20 ° C.
- Forberede 500 mM malate, pH 7,4. Opbevares i alikvoter ved-20 ° C.
2. isolering af Cardiac mitokondrier
- Aflive mus efter institutionelle normer.
Bemærk: For vores institutionelt godkendt metode af dødshjælp, mus var bedøvede af isofluorane indånding og ofret af cervikal dislokation. - Indsamle hjertet ved at åbne brysthulen, skære langs hver side af ribberne, flankerer hjertet, skære væk mellemgulvet og udtagelse hjertet væv.
Bemærk: I denne protokol udføres mitokondrie isolation fra en hel hjertet indsamlet fra en voksen mus (ca 120 mg), som bør være tilstrækkelige til 3-4 forsøg. Til mitokondrie isolation fra andre mitokondrier-rige væv som leveren, kan op til 200 mg af væv bruges efter protokollen beskrevet. - Skyl vævet grundigt i 25 mL iskold 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) at sikre, at alle blod er presset ud af hjertekamrene.
Bemærk: Hjertet vil nok skylles når væsken presses ud af hjertet løber klar. - Hakke hjertet i små stykker i 5 mL iskold 1 x PBS ved hjælp af en skarp saks.
- Kassér PBS og overføre hakket hjerte væv til en pre kølet 7 mL glas-teflon dounce homogeniseringsapparat med en 0,10 til 0,15 mm frihøjde.
- Der tilsættes 5 mL iskold MS-EGTA buffer, og homogeniseres prøven indtil væv stykker er ikke længere synlig (ca 11 slagtilfælde).
Bemærk: Ikke over homogeniseres vævet som målet er at opnå intakt og funktionsdygtig mitokondrier. - Overførsel af homogenatet til en 15 mL tube.
- Der centrifugeres homogenatet på 600 x g ved 4 ° C i 5 min at sammenpresse kerner og ubrudt celler.
- Overføre supernatanten til en frisk 15 mL tube og centrifugeres det på 10.000 x g ved 4 ° C i 10 min at sammenpresse mitokondrier.
- Supernatanten og holde den mitokondrielle pellet på is.
- Vaske den mitokondrielle pellet to gange ved hjælp af iskold MS-EGTA buffer. Resuspenderes mitokondrie i 5 mL af MS-EGTA buffer for hver vask, centrifugeres det på 10.000 x g ved 4 ° C i 10 min, og supernatanten.
- Efter den sidste vask, supernatanten og resuspend mitokondrier i 100 μL af is kold MS-EGTA buffer. Hold mitochondrier på is.
Bemærk: Mitokondrier skal bruges til forsøg inden for 1 h. - Foranstaltning mitokondrie proteinkoncentration ved hjælp af en Bradford Protein Assay26.
3. plade Reader-baseret måling af mitokondrie kalcium optagelse
Bemærk: Her er det beskrevet i protokollen for analyse af mitokondriel Ca2 + optagelse ved hjælp af en multimode Pladelæser monteret med injektorer. Nogen plade læseren med evnen til at læse calcium grøn-5N fluorescens (excitation/emission af 506/532 nm) i en kinetisk tilstand med automatiseret reagens injektorer til at holde den reaktion, beskyttet mod lys kan bruges.
- Programmet Pladelæser til at udføre en kinetisk læse af calcium grøn-5N fluorescens med målinger, der foretages hvert sekund i samlede assay tid af 1.000 s. Derudover, programmere reagens injektorer at give afkald på 5 μl af CaCl2 løsning på 30 s, 150 s, 300 s , 480 s og 690 s tid point.
Bemærk: Timingen af CaCl2 injektioner er brugerdefineret, og kan justeres eksperimenterende behov. - Prime reagens injektorer med CaCl2 løsning skal anvendes.
Bemærk: Koncentrationen af CaCl2 løsning er brugerdefinerede, og kan justeres i efterfølgende løber til titreres mængden af Ca2 + kræves for at udløse MPTP åbning. - Tilføje 200 μg af mitochondrier til en individuel godt af en 96 godt plade.
- Tilføje den passende mængde af KCl buffer til brønden, således at den samlede mængde af mitokondrier og KCl buffer kommer til 197 μL.
- Tilsæt 1 μL af 1 M pyruvat og 1 μL af 500 mM malat til mitokondrier blandingen. Med pipette overfoeres forsigtigt at blande, og Inkuber mitokondrier med substrater for 2 min ved stuetemperatur til at tillade mitokondrier at blive fyldt med energi.
- Tilsæt 1 μL af 1 mM calcium grøn-5N lager. Bland forsigtigt af pipettering.
Bemærk: Beskytte reaktionen fra lys efter tilsætning af kalk grønne-5N farvestof. - Start den forprogrammerede kinetic protokol og overvåge calcium grøn-5N fluorescens.
4. reagenser og løsninger
Bemærk: Den anden del er eksperimentel procedure for Konfokal billeddannelse af mitokondrie Ca2 + i kulturperler celler
- Gøre Tyrodes løsning (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glukose, og 10 mM HEPES, pH 7,2 med KOH). Opbevares ved 4 ° C. Varm det til stuetemperatur før anvendelse.
- Forberede vaskeopløsning (100 mM kalium acetat, 15 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM Mg-ATP, 0,35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl2, 0,75 mM MgCl2, 10 mM fosforkreatin, 10 mM HEPES, pH 7,2 med KOH). Opbevares ved 4 ° C. Varm det til stuetemperatur før anvendelse.
- Forberede Permeabilization løsning, der indeholder 0,005% saponin i vaskeopløsning. Forberede det friske dagligt.
- Forberede 0 Ca2 + intern løsning (100 mM kalium acetat, 15 mM KCl, 0,35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH indstillet til 7,2 med KOH). Opbevares ved 4 ° C. Varm det til stuetemperatur før anvendelse.
- Forberede indre opløsning indeholdende Ca2 +. Tilføje CaCl2 til den interne løsning ovenfor for at nå den ønskede koncentration af frie Ca2 +. Mængden af CaCl2 tilføje beregnes ved hjælp af programmet MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).
- Forberede 1 mM Rhod-2/AM lager i DMSO og opbevar den ved-20 ° C indtil brug.
- Forberede 1 mM MitoTracker grøn stock i DMSO og opbevar den ved-20 ° C indtil brug.
5. plating celler til billedbehandling
- Vaske 22 x 22 cm2 glas coverslips med 100% ethanol og tillade coverslips til luft tørre.
- Placer glas coverslips i individuelle brønde på en 6-godt vævskultur parabol.
Bemærk: Coverslips kan være belagt med laminin, poly-L-lysin eller lignende matrix til at fremme celle vedhæftet fil. - Trypsinize og plade celler over på coverslips sigter efter ca 70% sammenløbet på dagen for billeddannelse.
6. læsning celler med Rhod-2/AM og MitoTracker grøn
- Forberede Rhod-2/AM-MitoTracker grøn brugsopløsning. Tilsæt 20 μL Rhod-2/AM 1 mM stock, 0,2 μL af MitoTracker grønne 1 mM lager og 2,5 μL af 20% pluronic F-127 til 1 mL af Tyrodes løsning. Den endelige koncentration af Rhod-2 i brugsopløsning er 20 µM og den endelige koncentration af MitoTracker green er 200 nM.
- Forsigtigt fjerne vækst medier fra coverslip.
Bemærk: En vask trin er ikke nødvendig, inden farvestof løsning tilsætning. - Tilføje Rhod-2/AM-MitoTracker grøn løsning i en dråbevis mode på coverslip indtil coverslip er blot dækket (ca 3-4 dråber pr. coverslip).
- Der inkuberes i 30 min. ved stuetemperatur beskyttet mod lys til at tillade cellerne til at indlæse med farvestoffer.
- De esterify Rhod-2/AM. Forsigtigt fjerne Rhod-2/AM-MitoTracker grøn løsning, erstatte det med friske stuetemperatur Tyrode løsning, og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur beskyttet mod lys.
7. Konfokal billeddannelse af mitokondrie Rhod-2/AM og MitoTracker Green fluorescens
- Overførsel af coverslip til mikroskop imaging kammer og fylde salen med vaskeopløsning.
- Juster fokus under indstillinger for observere celler i fasekontrast på 40 X, indtil celler er synlige og i fokus.
-
Permeabilize plasma membran af Rhod-2/AM-MitoTracker grøn indlæst celler til at fjerne cytosol-lokaliseret Rhod-2, samtidig bevare mitokondrier-lokaliseret farvestof.
- Fjerne Vaskeopløsningen fra coverslip.
- Erstatte det med Permeabilization løsning for ca 1 min.
- Visuelt overvåge plasmamembran morfologi i hele permeabilization processen. Permeabilized celler vil udvikle en ru overflade.
- Når permeabilization er færdigt, straks fjerne Permeabilization løsning og erstatte det med 0 Ca2 + intern løsning.
- Samtidigt billede Rhod-2 fluorescens (excitation ved hjælp af 559 nm laser linje og emission indsamlet ved bølgelængder mellem 575-675 nm) og MitoTracker grønne fluorescens (excitation ved hjælp af 488nm laser linje og emission indsamlet ved bølgelængder mellem 505-525 nm). Fokus på permeabilized celler viser en klar colocalization af Rhod-2 og MitoTracker grøn.
- Formindske mikroskop laser og få indstillinger, sådan at den mitokondrielle Rhod-2 Fluorescens er svagt og kun synlige.
- Vælg mikroskop for at erhverve 2-dimensionelle scanninger på en passende indramme sats og tid kursus for den konkrete anvendelse. En rammehastighed på mindst 30 rammer/s anbefales at præcist indfange kinetik af ændringer i mitokondrie Ca2 +.
- Fjerne den 0 Ca2 + intern løsning uden at forstyrre celler eller mikroskop fokus.
- Start billede erhvervelse.
- Tilføje Ca2 +-fyldt intern løsning på 10 s tid pege enten manuelt eller med en perfusion system.
- Vælg regioner af interesse (ROIs) til at omfatte regioner af colocalization mellem mitokondriel Rhod-2 og MitoTracker grønne signal i image erhvervelse software.
Bemærk: Vilkårlige fluorescens (F) værdier for hver gang optagelsen er opnået for hver ROI. Disse værdier er baggrunden trækkes og normaliseres til den indledende fluorescens (før Ca2 + tilføjelse; F0) og afbildet som F/F0 over tid til præsentation af data og kvantificering af amplituden af ændringen af mitokondrie Ca2 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser mitokondrie Ca2 + optagelse målinger i isolerede hjerte mitokondrierne bruger plade reader-baseret platform og Ca2 + farvning af calcium grøn-5N. Betingelser kontrol (figur 1A), cardiac mitokondrier blev suspenderet i KCl buffer indeholdende calcium grøn-5N og derefter udfordret med sekventiel pulser af CaCl2 (5 μl af en 0,6 mM CaCl2 løsning) tilføjet på 30 s, 150 s, 300 s, 480 s, og 690 s tid point. Timing og række CaCl2 tilføjelser kan justeres af brugeren til at give mulighed for komplet mitokondrie optagelsen af tilsat Ca2 + før senere tilføjelser. I denne analyse afspejle stigninger i calcium grøn-5N signal forhøjede buffer Ca2 + niveauer. Som mitokondrier importerer Ca2 +, aftager Ca2 + er fjernet fra bufferen og calcium grøn-5N fluorescens. Vigtigere, på den tredje tilføjelse af Ca2 +, calcium grøn-5N fluorescens kurve gennemgår en pludselig og kraftig bøjning opad, i stedet for fortsat at fjerne Ca2 + fra bufferen og er angivet med en rød pil i figur 1A . Denne pludselige stigning i fluorescens afspejler mitokondrie Ca2 + overbelastning og MPTP åbning. Det samlede beløb af Ca2 + taget op af mitokondrier før MPTP aktivering afspejler den mitokondrielle Ca2 + kapacitet, og kan udtrykkes som μmol Ca2 +/mg protein. Ved at foretage tilpasninger til timing og koncentrationen af calcium tilføjet, mængden af Ca2 + kræves for at udløse kan permeabilitet overgangen bestemmes. I figur 1B, mitokondrier var forbehandlet i 10 min. ved stuetemperatur med 10 μM Ru360, en vel karakteriseret hæmmer mitokondrie Ca2 + uniporter komplekse27. Ru360 hæmmer uniporter-afhængige mitokondrie Ca2 + optagelse, og dette fremgår af en trinvis stigning i calcium grøn-5N fluorescens efter hver Ca2 + tilføjelse.
For Konfokal billeddannelse af mitokondrie calcium ved hjælp af Rhod-2/AM, viser vi de repræsentative resultater fra NIH 3T3 celler. MitoTracker green er en mitokondrier-selektiv farvestof, der fortrinsvis pletter mitokondrie netværket (figur 2A). Efter saponin-medieret permeabilization af plasma membran, cytosole Rhod-2 er vasket væk, forlader en Rhod-2 farvet mitokondrie netværk, som co lokaliserer med MitoTracker grøn (figur 2A). Rhod-2 kan også ophobes i ikke-mitokondrie strukturer, så ROI's skal analyseres, bør fokus for regioner i co lokalisering mellem de MitoTracker grønne og Rhod-2. I kontrol celler, tilsætning af en Ca2 +-fyldt intern løsning indeholdende 2 μM gratis Ca2 + medfører en hurtig stigning i Rhod-2 fluorescens, som er hæmmet når uniporter komplekse hæmmes med 10 μM Ru360 (figur 2B).
Figur 1: Mitokondrie Ca2 + optagelse i isolerede hjerte mitokondrier. (A) grafer af relative calcium grøn-5N fluorescens kontrol hjerte mitokondrier og (B) mitokondrier forbehandlet med 10 μM Ru360 i 10 min ved stuetemperatur, udfordret med 5 μl af 0,6 mM CaCl2 (sorte pile). Mitokondrie Ca2 + overbelastning-induceret permeabilitet overgangen er angivet med den røde pil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative analyse af mitokondriel Ca2 + i permeabilized celler. (A) repræsentative fluorescens billede af 3T3 celler fyldt med rhod-2 (rød) og MitoTracker green (grøn) og flettede billeder af rhod-2 og MitoTracker grøn (gul) efter permeabilization med saponin. (B) Rhod-2 fluorescerende spor fra en enkelt 3T3 celler under anvendelse af 2 µM gratis Ca2 + intern løsning under kontrol betingelser (sort trace) eller efter 10 µM Ru360 før behandling (røde spor). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi to forskellige tilgange til at måle mitokondrie Ca2 + tilstrømning. Plade reader-baserede calcium grøn-5N metode skærme extramitochondrial Ca2 + niveauer og er en Ca2 + optagelse assay, er velegnet til målinger i isolerede mitochondrier. Mens vi har vist repræsentative resultater fra isolerede murine hjerte mitokondrier, kan dette assay tilpasses let til mitokondrier isoleres fra væv med høj mitokondrie overflod herunder leveren, skeletmuskulatur og hjerne. Derudover kan læser pladesystem være en ideel mulighed for laboratorier hvor specialiseret udstyr traditionelt brugt for Ca2 + målinger, ligesom fluorometers, ikke måske er umiddelbart tilgængelige. Begrænset maksimal tidsrummet at en Pladelæser kan scanne og behovet for at pre program reagens tilføjelser kan være en svaghed ved denne teknik i forhold til fluorometers, men omkostningerne og tilgængeligheden af fluorometers kan opveje denne fordel. Ved at variere koncentrationen af Ca2 + i reagens injektorer, kan mængden af Ca2 + at mitokondrier er i stand til at udskille før udløser MPTP åbning (den mitokondrielle Ca2 + kapacitet) bestemmes.
Konfokal imaging protokollen, som vi beskriver for Rhod-2/AM målinger af mitokondrie Ca2 + er ideel til kulturperler celler og kan også tilpasses til primærelementer. I denne metode, er plasma membran permeabilized med saponin, som giver mulighed for udvaskning af cytosole farvestof. Kun farvestof indesluttet i organeller er fortsat efter denne procedure, giver mulighed for præcis og specifik måling af mitokondrie fluorescens. Desuden, denne permeabilized celle analyse giver mulighed for eksperimenterende kontrol over extramitochondrial Ca2 + niveauer samt bruger-definerede betingelser hvorunder mitokondrier er udsat. Rhod-2/AM Konfokal billeddannelse af mitokondrie Ca2 + kan bruges i intakt, ikke-permeabilized celler, men dette kræver optimering af farvestof lastning og nedtrapning esterificering at sikre en mitokondrier-specifikke Rhod-2 lokalisering28. Styrkerne ved Rhod-2/AM metoden er at Rhod-2/AM er kommercielt tilgængelige og farvestoffet let kan anvendes på en lang række celletyper. Lokalisering af farvestoffet Rhod-2 er imidlertid en begrænsning skal tages i betragtning. For at sikre måling af mitokondrier-specifikke Rhod-2 fluorescens, kan en anden spektralt særskilte farvestof, som MitoTracker green, bruges til at plette mitokondrier før billeddannelse. Genetisk kodet Ca2 + sensorer målrettet til mitokondrier kan omgå dette problem, men cellerne skal transfekteret/transduced med sensor konstruktion og har tid nok til at udtrykke proteinet. Det er ikke altid ideelt til primærelementer med begrænset overlevelsestid og farvestof lastning kan være et tidsbesparende proces.
I begge protokoller brugte vi den uniporter komplekse hæmmer Ru360 til at illustrere effekten mitokondrie Ca2 + tilstrømning hæmning. Ru360 er guld standard for uniporter hæmning og til dato, det er den eneste kendte specifik hæmmer af denne tranporter29. Alternativt, ruthenium røde kan også bruges, men ruthenium rød er en uspecifik uniporter-hæmmer, der har vist sig at også hæmme Ca2 + release fra sarcoplasmic reticulum30. Nedsat mitokondriel Ca2 + håndtering kan være et tegn på mitokondriel dysfunktion, som uniporter kompleks-afhængige Ca2 + transport er mitokondrielle membran potentiale, afhængige, og i forlængelse heraf, dette er afhængig af respiratorisk kæde funktion . Således kan mitokondrie uncouplers, såsom carbonyl cyanid -4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP) og carbonyl cyanid m- chlorphenyl hydrazone (CCCP) som spreder mitokondrielle membran potentiale, også bruges som kontrol forbindelser for at hæmme mitokondrie Ca2 + tilstrømning. Da mitokondrier er websteder af intracellulære Ca2 + opbevaring, kan mitokondrier fungere som Ca2 + buffere i den intracellulære rum. Således, ændringer i mitokondrie Ca2 + håndtering kan påvirke formen af det cytosole Ca2 + landskab. I betragtning af det voksende antal sygdomstilstande hvor mitokondrie Ca2 + dynamics kan spille en rolle, de metoder, der er illustreret her kunne anvendes til undersøgelse af mitokondrie Ca2 + tilstrømning i dyremodeller og cellulære modeller af den sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger til rapport.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra American Heart Association (J.Q.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
| Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
| 22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
| 96 well plate | Corning | 3628 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
| MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
| Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E8145 | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| L-malic acid | Sigma | M1125 | |
| Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
| Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Ru360 | Calbiochem | 557440 |
References
- Deluca, H. F., Engstrom, G. W. Calcium uptake by rat kidney mitochondria. P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).
- Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria. Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).
- Kwong, J. Q. The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond. J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).
- Denton, R. M. Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).
- Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming. P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).
- Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).
- Hunter, D. R., Haworth, R. A. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).
- Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).
- Luongo, T. S., et al. The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability. Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).
- De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Pan, X., et al. The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter. Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).
- Kwong, J. Q., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart. Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).
- Luongo, T. S., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition. Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).
- Logan, C. V., et al. Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling. Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).
- Lewis-Smith, D., et al. Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood. Neurol Genet. 2 (2), e59 (2016).
- Tosatto, A., et al. The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha. EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).
- Cardenas, C., et al. Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria. Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).
- Dedkova, E. N., Blatter, L. A.
- Florea, S. M., Blatter, L. A. The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans. Front Physiol. 1, 141 (2010).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Bonora, M., et al. Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes. Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).
- Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms. J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).
- Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).
- Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake. J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes. J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles. J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).
