Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de ponta-cultivo de células vegetais em espaços extremamente pequenos

Naoki Yanagisawa; Nagisa Sugimoto; Tetsuya Higashiyama; Yoshikatsu Sato

doi:10.3791/57262

Method Article

Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de ponta-cultivo de células vegetais em espaços extremamente pequenos

DOI:

10.3791/57262

⸱

May 22nd, 2018

Naoki Yanagisawa¹ , Nagisa Sugimoto² , Tetsuya Higashiyama¹^,² , Yoshikatsu Sato²

¹Division of Biological Science, Graduate School of Science, Nagoya University, ²Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Nagoya University

Summary

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Nós descrevemos um método para investigar a capacidade de crescimento dica células de vegetais, incluindo tubos de pólen, pelos radiculares e musgo protonemata, para alongar através de aberturas muito estreitas (~ 1 µm) em um dispositivo microfluidic.

Abstract

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In vivo, células de planta ponta-crescendo precisam superar uma série de barreiras físicas; no entanto, os pesquisadores faltam a metodologia para visualizar o comportamento celular em tais condições restritivas. Para resolver esse problema, nós desenvolvemos câmaras de crescimento para células vegetais crescimento dica que contêm uma série de aberturas estreitas, microfabricada (~ 1 µm) em um substrato de poli-dimetilssiloxano (PDMS). Este material transparente permite que o usuário monitorar processos de alongamento de ponta em células individuais durante a penetração de microgap pela imagem latente de lapso de tempo. Usando esta plataforma experimental, observamos mudanças morfológicas em tubos de pólen como penetraram o microgap. Nós capturamos as mudanças dinâmicas em forma de um núcleo vegetativo fluorescente etiquetada e espermatozoides em um tubo de pólen durante este processo. Além disso, temos demonstrado a capacidade dos cabelos de raiz e musgo protonemata para penetrar a 1 µm lacuna. Esta plataforma em vitro pode ser usada para estudar como individual células respondem aos espaços fisicamente restrito e pode fornecer insights sobre mecanismos de ponta-crescimento.

Introduction

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Depois de grãos de pólen germinam em um estigma, cada grão produz um único tubo de pólen que transporta os espermatozoides para a célula-ovo e a célula central no óvulo para fertilização dupla. Tubos de pólen alongar através do estilo e eventualmente atingir o óvulo por sensoriamento várias pistas de orientação ao longo de seu caminho¹. Durante o alongamento, tubos de pólen encontram uma série de barreiras físicas; a faixa de transmissão está repleto de células, e tubos de pólen deve entrar a abertura micropylar minuto do óvulo para chegar a seu destino (figura 1A)². Portanto, tubos de pólen....

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Protocol

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1. fabricação do Microdevice PDMS para examinar crescendo tubos de pólen e musgo Protonemata

Nota: Usamos um instrumento photolithography maskless preparar moldes PDMS em pastilhas de silício. Os detalhes sobre a operação do sistema são omitidos neste manuscrito. Uma técnica de fotolitografia padrão⁹ usando uma Fotomáscara também pode ser usado para criar os moldes PDMS descritos neste manuscrito.

Despeje a 11 g de mistura de pré-polímero PDMS (elastômero base: cura agente na proporção de 10:1) em cada molde de 4 polegadas.
Desgaseifica o molde preparado no passo 1.1 por 20 min em uma câmara de vá....

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Results

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Conforme ilustrado na Figura 1, células de planta ponta-crescendo encontram uma série de barreiras físicas ao longo de seus caminhos de crescimento em vivo. As microfluidic em vitro celular cultura plataformas apresentadas neste estudo permitiu o exame a cultura dica do processo em três tipos de células vegetais (tubos de pólen, pelos radiculares e musgo protonemata) através de aberturas artificiais de 1 µm (Figura 3

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Discussion

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Vários passos críticos no protocolo precisam ser seguido precisamente para obter os resultados apresentados acima. Em primeiro lugar, as superfícies PDMS camada e vidro fundo prato devem ambos ser tratadas com plasma para uma quantidade suficiente de tempo antes de ligação. Caso contrário, a camada PDMS localmente pode desanexar da superfície de vidro enquanto ponta crescimento células estão atravessando o microgaps. Mais um passo crucial no protocolo de protonemata de pelos radiculares e moss é a esterilização do microd.......

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Disclosures

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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgements

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Agradecemos Tsutsui H. e m. Kurihara fornecendo-nos com plantas transgénicas, incluindo o T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato e a linha do UBQ10pro::H2B-amor da. thaliana , respectivamente. Este trabalho foi financiado pelo Instituto de transformadora Bio-moléculas de Universidade de Nagoya e a rede de ciência avançada planta Japão. Apoio financeiro para este trabalho foi fornecido por subvenções do Japão de ciência e tecnologia agência (projeto ERATO conceder n. JPMJER1004 por T.H.), um subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (n º s. JP16H06465 e JP16H06464 por T.H.) e da sociedade para a promoção da ciência (JSPS) Grants-in-Aid par....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
Murashige & Skoog Medium	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
Sucrose	Wako Pure Chemical	196-00015
Prato com fundo de vidro de 50 mm	Matsunami Prato	com
35 mm	Iwaki	3971-035
Lâmina cirúrgica	Feather	No.11
perfuradores de biópsia	Harris		Uni-Core
Gel dicas de carregamento	Bio-Bik	124-R-204
Microscópio Invertido	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		Não O número de catálogo está disponível para este microscópio personalizado
Software de imagem MetaMorph	Molecular Devices

fundo de vidro D210402

References

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Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. Obermeyer, G., Feijó, J. , Springer. 65-85 (2017).....

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