Descreveremos um protocolo de cirurgia estereotáxica com um dispositivo caseiro de cabeça-corrigido para reagentes microinjecting para o corpo estriado do cérebro do rato neonatal. Esta técnica permite a manipulação genética em células neuronais de regiões específicas do cérebro de rato neonatal.
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Artigo de método
Cirurgia estereotáxica para manipulação genética em células estriadas de cérebro de rato Neonatal
Neste artigo
Resumo
Resumo
Muitos genes são expressos no cérebro embrionário, e alguns deles são continuamente expressas no cérebro após o nascimento. Para tais genes persistentemente expressos, eles podem funcionar para regular o processo de desenvolvimento e/ou função fisiológica no cérebro neonatal. Para investigar as funções neurobiológicas de genes específicos no cérebro, é essencial para inativar genes no cérebro. Aqui, descrevemos um método simples estereotáxica para inactivar a expressão gênica no corpo estriado de ratos transgênicos em janelas de tempo neonatal. O vírus AAV-eGFP-Cre foram injetado para o corpo estriado de ratos de gene repórter Ai14 em dia pós-natal (P) 2 por cirurgia cerebral estereotáxica. A expressão do gene repórter tdTomato foi detectada no corpo estriado de P14, sugerindo um sucesso Cre-loxP mediada por recombinação de DNA em células transfectadas-AAV striatal. Nós validado ainda mais esta técnica por microinjecting o vírus AAV-eGFP-Cre em camundongos P2Foxp2fl/fl . Dupla rotulagem de GFP e Foxp2 mostrou que as células GFP-positivo faltavam Foxp2 imunorreatividade no corpo estriado P9, sugerindo que a perda de proteína Foxp2 em AAV-eGFP-Cre transfectada striatal células. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram uma exclusão genética eficaz por stereotaxically microinjected vírus AAV-eGFP-Cre em específicas populações neuronais no cérebro neonatal de floxed ratos transgénicos. Em conclusão, nossa técnica estereotáxica fornece uma plataforma simples e fácil para manipulação genética em cérebro de rato neonatal. A técnica não pode somente ser usada para excluir genes em regiões específicas do cérebro neonatal, mas também pode ser usada para injetar drogas farmacológicas, marcadores neuronais, optogenetics geneticamente modificados e chemogenetics proteínas, indicadores de atividade neuronal e outros reagentes para o corpo estriado do cérebro do rato neonatal.
Introdução
Estudos modernos da estrutura e função do cérebro normalmente requerem manipulação genética de genes específicos nas células neuronais. Para sondar as funções dos genes diferentes, ratos transgénicos carregando alelos mutantes, incluindo foram rotineiramente gerados nocaute e bater-em alelos. Cirurgia cerebral estereotáxica para roedores adultos é um método padrão para localmente entregar drogas, vírus, marcadores e outros reagentes para regiões específicas do cérebro de roedor1,2. Aplicando a cirurgia estereotáxica cerebral de ratos transgénicos permite um de manipular geneticamente a função dos genes e a ati....
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Protocolo
Os protocolos de animais descritos aqui foram aprovados pelo cuidado Animal e uso comissões da Universidade Nacional de Yang-Ming.
1. preparação do titular para filhotes Neonatal no aparato estereotáxica
- Fazer a cabeça da bandeja: cortar o fundo de um tubo de centrífuga de 1,5 mL (15 mm de comprimento) na forma que se encaixa a cabeça dos filhotes neonatais através da remoção de 1/5 da parede do tubo.
- Pegue uma caixa de ponta de pipeta com o tamanho certo que se encaixa com o pedestal de aparelhos estereotáxicos e remover a tampa superior. Fixe a cabeça bandeja preparada no passo 1.1 e um estojo de incorporação de tecido....
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Resultados
Para o primeiro conjunto de experiência, nós injetadas 200 nL de AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 vírus (AAV-eGFP-Cre, diluição de 1/10 em solução salina de tampão fosfato de Dulbecco) que expressam a recombinase Cre DNA fundidos com GFP em P2 corpo estriado de ratos Ai14. Os ratos Ai14 expressam tdTomato gene repórter sobre exclusão Cre-mediada de loxP-flanqueado (floxed) STOP gaveta (Figura 2F). Os cérebros foram colhidos no P14 para imunocoloração de G.......
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Discussão
No presente estudo, vamos demonstrar um método simples e confiável de estereotáxica para injetar o vírus AAV para o corpo estriado do cérebro do rato neonatal. Nós injetadas vírus AAV-eGFP-Cre para o corpo estriado de ratos de repórter Ai14 em P2 e então analisados a expressão do gene repórter no P14. Nós encontramos que AAV transfectadas células GFP-positivo em todo o corpo estriado em níveis rostrocaudal. Além disso, quase todas as células GFP-positivo co expressaram o gene do repórter de tdTomato nas células estriadas.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Ministério da ciência e tecnologia concede MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, os institutos de pesquisa de saúde nacional conceder INDH-EX106-10429NI e programa de centro de pesquisa de áreas Indicados: concessão de o Ministério da educação, através do centro de pesquisa do cérebro, National Yang-Ming University, em Taiwan, e pós-doutorado concede MOST106-2811-B-010-031 (S.-Yc), MOST105-2811-B-010-036 e MOST106-2811-B-010-030 (YK-H.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agulha PrecisionGlide 30G | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Clorofórmio | Seringa MICROLITRO JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton Hamilton | 80300 | 30G agulha adequada para tubo PE10; a agulha 26G precisa de um adaptador PE20 | |
| Tubo de polietileno PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Tubo de polietileno PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Bomba de seringa de taxa de fluxo | Bomba de precisão mais longa Co. | Seringa TJ-2A (Controlador) e L0107-2A (Unidade de Acionamento) | |
| 25G | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Instrumentos Estereotáxicos Padrão | RWD Ciências da Vida | 68037 | Sem usar 68030 Adaptador de Rato/Rato Neonatal Anticorpo |
| Abcam | ab16046 | Coelho policlonal para FOXP2, 1:4.000 | |
| Anticorpo anti-RFP | Abcam | ab65856 | Monoclonal de camundongo para RFP, microscópio 1:1.000 |
| BX63 | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
| Cabra anti-coelho conjugado Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lote # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Instituto de Ciências Biomédicas, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1x1014 (GC/ml) |
| B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | O Laboratório Jackson | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | O Laboratório Jackson | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato | Corning cellgro | 21-030-CVR |
Referências
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1
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Reimpressões e permissões
