Determinação de índice de lipídios pela recuperação de fluorescência líquido no patógeno fungo Ustilago Maydis

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para obter o índice de gotículas lipídicas (índice de LD) para estudar a dinâmica de triglicérides nas células cultivadas em experimentos de alta produtividade. O ensaio de índice de LD é um método fácil e confiável que usa BODIPY 493/503. Este ensaio não precisa de extração de lipídios dispendious ou análise de microscopia.

Resumo

O artigo mostra como implementar o ensaio de índice de LD, que é um ensaio sensível microplacas para determinar o acúmulo de triglicérides (TAGs) em gotículas lipídicas (LDs). Índice de LD é obtido sem extração de lipídios. Permite medir o teor de LDs em experimentos de alta produtividade em condições diferentes, tais como o crescimento em ricos ou mídia de nitrogênio empobrecido. Embora o método foi descrito pela primeira vez estudar o metabolismo de gotículas lipídicas em Saccharomyces cerevisiae, foi aplicado com sucesso para o basidiomiceto Ustilago maydis. Curiosamente, e porque LDs são organelas filogeneticamente conservadas em células eucarióticas, o método pode ser aplicado a uma grande variedade de células, do fermento para células de mamíferos. O índice de LD baseia o ensaio de recuperação de líquidos de fluorescência (LFR) de BODIPY 493/503, sob condições de resfriamento, pela adição de células fixadas com formol_. Iodo de potássio é usado como um quencher da fluorescência. A relação entre a fluorescência e pistas de densidade óptica é chamada índice de LD. Pistas são calculadas a partir de linhas retas obtidas quando BODIPY fluorescência e densidade óptica em 600 nm (OD₆₀₀) são plotados contra adição de amostra. Qualidade de dados ideal é refletida por coeficientes de correlação iguais ou acima de 0,9 (r ≥ 0,9). Múltiplas amostras podem ser lidos simultaneamente, como pode ser implementada em uma microplaca. Desde BODIPY 493/503 é um lipofílico fluorescente tintura que partições para as gotículas lipídicas, pode ser usada em muitos tipos de células que se acumulam LDs.

Introdução

Gotículas lipídicas (LDs) são onipresentes corpos de gordura intracelulares, compostos por um núcleo de lipídios neutros, principalmente de TAGs e ésteres de esterol (SE). O núcleo é rodeado por uma monocamada de fosfolipídios que interage com proteínas como perilipin e enzimas envolvidas na síntese de lipídios neutros, como o diacilglicerol acil-transferase, carboxilase acetil-CoA e acil-CoA sintase¹. Devido a seu comportamento dinâmico, a monocamada de fosfolipídeo também contém lipases triacilglicerol que hidrolisam TAGs e SE². Dependendo do tipo de célula e organismo, lipídios neutros armazenados podem ser usados par....

Protocolo

1. preparação de soluções e Buffers

1. Para preparar 1 L de fosfato, tampão salino (PBS, pH 7), dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄, 0,24 g de KH₂PO₄ em 800 mL de água destilada. Ajustar o pH a 7,0 com HCl e em seguida, adicione água para um volume final de 1 L. PBS pode ser feita como uma solução-mãe de 10x e armazenada à temperatura ambiente.
2. Para preparar 10 mL da solução de fixação, adicione 1 mL de formol 37% para 9 mL de PBS para atingir uma concentração final de 3,7%. Prepare esta solução imediatamente antes da utilização.
   Cuidado: Use luvas para manipular a solução de formaldeíd....

Resultados

LFR, com BODIPY 493/503 como sonda fluorescente é um método confiável e fácil para estudar a dinâmica acumulação de LDs em U. maydis, independentemente das condições de crescimento. Quando as células foram cultivadas em meio YPD, houve um aumento no índice de LD durante a fase exponencial, seguido por um declínio na fase estacionária (Figura 2A). Em contraste, em células cultivadas em fome de nitrogênio, houve um aumento constante no índice LD em amb.......

Discussão

LFR é um novo método que foi aplicado pela primeira vez estudar o metabolismo de lipídios em S. cerevisiae e mais tarde foi com êxito implementado em U. maydis^20,21. Embora o índice de LD não dá um valor absoluto das marcas acumuladas nas células, ele fornece uma ideia rápida do conteúdo lipídico das células, e a interpretação dos dados é direta quando índice LD de duas ou mais condições experimentais são comparados. BODIPY 493/503 é altamente e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Espectrofotômetro	Varioskan Lux microplaca multimodo reade	D5879	Filtro 493/503 ou detector monocromador
Placa costar	Corning Inc.	3615	96 poços de parede preta/fundo transparente
Placa costar	Corning Inc	3598	96 poços placa de cultura de células costar
BODIPY 493/503	Invitrogen/ Thermofisher	D3922	4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno
Solução de formaldeído	Sigma Aldrich	252549	reagente ACS, 37% em peso em H2O, contém 10-15% de metanol para evitar a polimerização
Iodeto de potássio	Sigma Aldrich	60399	BioUltra, ≥ 99,5% (AT)
FB2 Ustilago maydis	ATCC	201384	Basidiomiceto-Levedura
Cloreto de sódio	Sigma Aldrich	746398	Reagente ACS, sal inorgânico
Fosfato de potássio monobásico	Sigma Aldrich	P0662	Reagente ACS
Selecione o extrato de levedura	Sigma Aldrich	Y100	Mistura de amini ácidos, peptídeos, solúveis em água, vitaminas e carboidratos para meios de cultura
N-Z case plus	Sigma aldrich	N4642	Caseína enzimática hidrolisado de leite
Glicose	Sigma Aldrich	G-8270	D (+) glicose
Skaker frasco	Pirex	CLS4450250-6EA	Vidro borosiicado
Shaker	SEV Mé xico	INO650V-7	Agitador orbital
Mesa centrífuga	Eppendorf	5415C	Microtubos de centrífuga
	Sigma Aldrich	Z606340	Eppendorf
Pontas de pipeta	Axygen scientific	T-200-Y	Pontas de pipeta universais com extremidade chanfrada, 200 microlitros, pipeta mLine não estéril
	Biohit	725130	8 canais, faixa de volume 5-100 uL

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