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Artigo de método

Determinação de índice de lipídios pela recuperação de fluorescência líquido no patógeno fungo Ustilago Maydis

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DOI:

10.3791/57279

⸱

3 de abril de 2018

 ,  ,  , 
1Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, 2Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, 3Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para obter o índice de gotículas lipídicas (índice de LD) para estudar a dinâmica de triglicérides nas células cultivadas em experimentos de alta produtividade. O ensaio de índice de LD é um método fácil e confiável que usa BODIPY 493/503. Este ensaio não precisa de extração de lipídios dispendious ou análise de microscopia.

Resumo

O artigo mostra como implementar o ensaio de índice de LD, que é um ensaio sensível microplacas para determinar o acúmulo de triglicérides (TAGs) em gotículas lipídicas (LDs). Índice de LD é obtido sem extração de lipídios. Permite medir o teor de LDs em experimentos de alta produtividade em condições diferentes, tais como o crescimento em ricos ou mídia de nitrogênio empobrecido. Embora o método foi descrito pela primeira vez estudar o metabolismo de gotículas lipídicas em Saccharomyces cerevisiae, foi aplicado com sucesso para o basidiomiceto Ustilago maydis. Curiosamente, e porque LDs são organelas filogeneticamente conservadas em células eucarióticas, o método pode ser aplicado a uma grande variedade de células, do fermento para células de mamíferos. O índice de LD baseia o ensaio de recuperação de líquidos de fluorescência (LFR) de BODIPY 493/503, sob condições de resfriamento, pela adição de células fixadas com formol. Iodo de potássio é usado como um quencher da fluorescência. A relação entre a fluorescência e pistas de densidade óptica é chamada índice de LD. Pistas são calculadas a partir de linhas retas obtidas quando BODIPY fluorescência e densidade óptica em 600 nm (OD600) são plotados contra adição de amostra. Qualidade de dados ideal é refletida por coeficientes de correlação iguais ou acima de 0,9 (r ≥ 0,9). Múltiplas amostras podem ser lidos simultaneamente, como pode ser implementada em uma microplaca. Desde BODIPY 493/503 é um lipofílico fluorescente tintura que partições para as gotículas lipídicas, pode ser usada em muitos tipos de células que se acumulam LDs.

Introdução

Gotículas lipídicas (LDs) são onipresentes corpos de gordura intracelulares, compostos por um núcleo de lipídios neutros, principalmente de TAGs e ésteres de esterol (SE). O núcleo é rodeado por uma monocamada de fosfolipídios que interage com proteínas como perilipin e enzimas envolvidas na síntese de lipídios neutros, como o diacilglicerol acil-transferase, carboxilase acetil-CoA e acil-CoA sintase1. Devido a seu comportamento dinâmico, a monocamada de fosfolipídeo também contém lipases triacilglicerol que hidrolisam TAGs e SE2. Dependendo do tipo de célula e organismo, lipídios neutros armazenados podem ser usados para gerar energia, ou sintetizam fosfolipídios e moléculas sinalizadoras. Em leveduras e outros fungos, o conteúdo do LDs muda em resposta a variações na proporção de nitrogênio/carbono em meios de cultura, indicando que a disponibilidade de nitrogênio diminuída pode ser a chave para aumentar a produção de lipídios neutros3,4 ,5. A produção de grandes quantidades de TAGs em levedura tem potencial uso em biotecnologia como fonte de biocombustíveis e na indústria alimentar. Alguns lipídeos armazenados contêm altas proporções de ácidos graxos poliinsaturados, como o ômega 3 e ômega 6, com importância nutricional e dietética 6,7,8,9,10 , 11. LDs de células de mamíferos, incluindo células humanas, também contêm TAGs e ésteres de colesterol. A monocamada de fosfolipídeo interage com o homólogo de mamíferos das proteínas descrito no fermento LDs e com uma proteína adicional, perilipin, que está ausente em S. cerevisiae12. Uma proposta que papel para a monocamada de fosfolípidos e suas proteínas associadas é para estabilizar a estrutura de LDs e permitir a interação do LDs com organelas como mitocôndrias, retículo endoplasmático, peroxissomos e vacúolos, principalmente para a troca de lipídios 13,14. Curiosamente, em humanos, LDs parecem estar envolvidos em patologias como a diabetes tipo 2, aterosclerose, esteatohepatite e doença coronariana, em que há um aumento no seu número 15,16,17 . Alguns tipos de vírus usam LDs como plataformas para montar os virions 2,18,19.

Devido as implicações de LDs em patologias humanas e seu potencial uso biotecnológico, a exata determinação experimental da formação de LDs é uma tarefa importante. Este artigo descreve um ensaio confiável baseado na recuperação da fluorescência (LFR) de BODIPY 493/503 (4, 4-diflúor-1, 3, 5, 7, 8-pentametil-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), para obter um valor relativo do teor de lípidos neutros nas células. Com este ensaio, é possível acompanhar a dinâmica da acumulação de lípidos neutros em fungos como U. maydis e S. cerevisiaee também em células de mamíferos, sem a necessidade de extração de lipídios 20. O método foi aplicado pela primeira vez em S. cerevisiae para identificar as fosfatases da proteína e quinases envolveram na regulação do metabolismo lipídico. Isso foi possível sem extração de lipídios ou proteínas purificação21,22. LFR também tem sido utilizada para estabelecer a dinâmica da formação de LDs em macrófagos peritoneais23. O uso de BODIPY 493/503 tem algumas vantagens sobre outros corantes de lipídios neutros como Nilo vermelho. BODIPY 493/503 é altamente específico para lípidos neutros e tem um estreito espectro de emissão, facilitando a detecção simultânea de sinais de corantes como proteína fluorescente vermelha ou Mito-tracker, quando as amostras são analisadas por microscopia confocal. Infelizmente, BODIPY 493/503 é sensível ao fotobranqueamento, mas este processo pode ser evitado usando um reagente antiquenching durante a exposição à luz24.

Para realizar o ensaio LFR em células de levedura, que são cultivadas nas condições nutricionais desejadas e alíquotas sejam revogadas em momentos diferentes. Em seguida, as células são fixadas com formol, que preserva a integridade do LDs há meses, quando as células são armazenadas a 4 ° C. Outras técnicas de fixação devem ser evitadas, especialmente aqueles que utilizam metanol ou acetona gelada, uma vez que levam à degradação do LDs dentro das células,24. Para medir o índice de LD, em células fixadas em formol são suspensas em água para obter uma concentração definida. Então, eles são adicionados a uma solução contendo o fluoróforo BODIPY 493/503 saciada por KI, e quando o fluoróforo entra na célula e o associa com o LDs, há uma recuperação de sua fluorescência. Concomitante à medição de fluorescência (485 nm/510 nm), a concentração de células é quantificada através da medição da densidade óptica em 600 nm. Cada amostra é ler quatro vezes adicionando subsequentes 5 alíquotas de µ l de uma suspensão de células de formaldeído-fixo para o mesmo bem. Espaços em branco de fluorescência e absorção são adquiridos antes da adição de células. A qualidade de fluorescência e os dados de absorbância são avaliadas determinando a linearidade das medições: se r < 0.9, dados são descartados. O valor de r é importante porque basicamente a intensidade de fluorescência deve produzir uma resposta linear ao aumento das concentrações de célula. Se a concentração de células é muito alta, a linearidade é perdida. O ensaio LFR fornece um método rápido, simples e econômico para selecionar o fenótipo desejado do LD em experimentos de alta produtividade. Depois de selecionar as condições desejadas, o conteúdo do LD de células individuais pode ser estudado pela microscopia confocal, usando as mesmas células fixadas em formaldeído manchadas com BODIPY, fornecendo uma imagem de LDs na célula. Suas TAGs e conteúdo SE podem agora mais analisados por cromatografia em camada fina.

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Protocolo

1. preparação de soluções e Buffers

  1. Para preparar 1 L de fosfato, tampão salino (PBS, pH 7), dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4 em 800 mL de água destilada. Ajustar o pH a 7,0 com HCl e em seguida, adicione água para um volume final de 1 L. PBS pode ser feita como uma solução-mãe de 10x e armazenada à temperatura ambiente.
  2. Para preparar 10 mL da solução de fixação, adicione 1 mL de formol 37% para 9 mL de PBS para atingir uma concentração final de 3,7%. Prepare esta solução imediatamente antes da utilização.
    Cuidado: Use luvas para manipular a solução de formaldeído.
  3. Para preparar a solução têmpera (500 mM), dissolva 8,3 g de KI em 100 mL de água destilada. Preparar esta solução antes do uso e armazená-lo em temperatura ambiente.
  4. Para preparar a solução-mãe BODIPY 10 mM, dissolvem-se 10 mg de BODIPY 493/503 em 3,8 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO). Manter 100 alíquotas µ l no escuro a-70 ° C.
  5. Para preparar a solução de BODIPY 5 µM-têmpera, adicione 1 µ l de 10mm BODIPY 493/503 para 2 mL de solução que extingue a 500 mM. Para o ensaio LFR, uma concentração final de 5 µM de BODIPY é necessária.
  6. Para preparar a solução mineral, adicione 0,06 g de H3BO3, 0,14 g de MnCl2-4 H2O, 0,4 g de ZnCl2, 0,04 g de Na2MoO4-2 H2O, 0,1 g de FeCl3-6 H2O e 0,4 g de CuSO 4-5 H2O para 1 L de água destilada.
  7. Para preparar a solução de sal, adicione 16 g de KH2PO4, 4G de at2para que4, 8 g de KCl, 2 g de MgSO4, 1 g de CaCl2e 8 mL de solução mineral para 1 L de água destilada.
  8. Para preparar o meio mínimo sem uma fonte de nitrogênio para U. maydis FB2 (a2b2), adicionar 10 g de glicose e 62,5 mL de solução de sal para 1 litro de água destilada, de acordo com o Holliday, et al 31. ajustar o pH a 7,0 e então dispense 100 mL dos meios de comunicação em frascos de 250 mL e esterilizá-los. Esterilização autoclave por 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) no ciclo de líquido ou filtro.
  9. Para preparar o meio de levedura peptona dextrose (YPD), adicione 5 g de fermento extrato, 2,5 g de peptona, e 5 g de glicose para 1 L de água destilada. Dispense a 100 mL de solução em frascos de 250 mL e esterilizá-los. Esterilização autoclave por 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) no ciclo de líquido ou filtro.

2. cultura do estado e fixação da pilha

Nota: Preserve a estrutura de LDs, fixando as células mais rapidamente possível. A fixação pode ser feita em tubos de microcentrifuge. Fixo de células podem ser mantidas a 4 ° C por até um mês se desidratação é evitada deixando uma fina camada de água.

  1. U. maydis células sob condições de cultura cresce relevantes para o estudo. Comece a cultura com uma OD inicial600 de 0,05 (1,15 × 106 células / mL). Incube as células a 28 ° C, 180 rpm por 24 h. Uma OD600 de 1 corresponde a 2,3 × 107 células / mL.
  2. No selecionado vezes, retirar uma alíquota de células. Para U. maydis, Retire 5 mL cada 2 h durante as primeiras 8 horas. Após 8 h de crescimento, alíquotas de 2 mL são suficientes.
  3. Medir a densidade óptica em 600 nm de cada alíquota.
  4. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 14.000 x g por 1 min a 4 ° C, utilizando uma centrífuga do tabletop. Desprezar o sobrenadante.
  5. Suspenda o sedimento das células em 1 mL de tampão de 3,7% de PBS-formaldeído. Incube as células durante 15 minutos à temperatura ambiente.
  6. Após a incubação, centrifugar a suspensão de eritrócitos a 14.000 x g por 1 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
  7. Lave o pellet de células duas vezes com um volume semelhante de água destilada (1ml). Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 14.000 x g por 1 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante após cada etapa de lavagem.
  8. Ajustar o centrifugado a 5 OD600 (1,15 x 108 células / mL) com água destilada, água (equação 1).
    figure-protocol-1    Equação 1.
  9. Manter a amostra em 4 ° C até à sua utilização.

3. ensaio de recuperação de fluorescência líquido (LFR)

  1. Ligar o espectrofotômetro e abra o software de Skanlt. Clique na nova sessãoe escolha Iniciar e, em seguida, Varioskan Lux. Selecione o protocolo de árvore de sessão, digite as configurações para os comprimentos de onda de fluorescência (excitação 485 nm/emissão 510 nm; densidade óptica 600 nm) e escolha ganho automático fotomultiplicador. Para largura de banda de excitação, selecione 12 nm. Na ótica, selecione superior (excitação da amostra é de cima do poço).
  2. Insira uma agitação suave e contínua (300 rpm). Selecione Executar placa para forae Pausa até que a ação do usuário (tempo utilizado para a adição da amostra aos poços). Repeti o protocolo cinco vezes. Clique em salvar e escreva um nome para a sessão sobre o Campo de nome de sessão. O protocolo está agora pronto para as análises de amostras.
  3. Adicione 200 µ l do BODIPY 5 µM - saciada solução a cada poço um 96 bem preto-desobstruídos da placa de base.
  4. Coloque a placa dentro da câmara de espectrofotômetro e incubar 5 min à 30 ° C. A partir deste ponto, protege a placa de luz, tanto quanto possível.
  5. Clique no botão Iniciar e lê a fluorescência (485 excitação/emissão 510) e o OD600 correspondentes para os espaços em branco.
  6. Adicione 5 µ l de suspensão de célula de formaldeído-corrigido nos poços durante o tempo de pausa. Misture as amostras cuidadosamente com pipeta. Colocar a placa dentro do espectrofotómetro e clique em continuar. Em seguida, as amostras serão processadas de acordo com o protocolo projetado acima.
  7. Repita três adições sucessivas de 5 µ l de suspensão de células. Certifique-se que as células não se precipitar. (Figura 1).

4. os cálculos do índice de LD

  1. Para cada amostra em microplate, traça a curva de fluorescência e absorvância contra o volume de cada adição sucessiva (5 pontos, incluindo o espaço em branco). Neste estudo, use o software Microsoft Excel para os cálculos. Para plotar os dados, insira o volume, fluorescência e dados de absorbância na primeira, segunda e terceira coluna da folha de dados, respectivamente. Em seguida, selecione os dados com o cursor, clique em inserir e selecione dispersão (XY).
  2. Selecione os pontos para cada linha no gráfico e insira a respectiva Linha de tendência com a caixa Mostrar equação selecionada. Anote os valores das inclinações das duas linhas retas, de acordo com a equação 2:
    figure-protocol-2    Equação 2
    Onde y = fluorescência ou densidade óptica, x = volume de amostra (0, 5, 10, 15, 20 µ l), m = inclinação da fluorescência ou linha de densidade óptica e b = intercepção de y.
  3. Divida o declive da linha de fluorescência pelo declive da linha de densidade óptica para obter o índice de LD, equação 3.
    figure-protocol-3    Equação 3
    O índice de LD corresponde ao quociente da fluorescência e densidade óptica pistas.

5. análise de qualidade de dados

  1. Calcular o coeficiente de correlação de cada reta: clique sobre o Assistente de função (fx) e escolha CORREL. Se r < 0.9, descartar os dados e repetir as leituras. Se r ≥ 0,9, as leituras é confiável.

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Resultados

LFR, com BODIPY 493/503 como sonda fluorescente é um método confiável e fácil para estudar a dinâmica acumulação de LDs em U. maydis, independentemente das condições de crescimento. Quando as células foram cultivadas em meio YPD, houve um aumento no índice de LD durante a fase exponencial, seguido por um declínio na fase estacionária (Figura 2A). Em contraste, em células cultivadas em fome de nitrogênio, houve um aumento constante no índice LD em amb...

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Discussão

LFR é um novo método que foi aplicado pela primeira vez estudar o metabolismo de lipídios em S. cerevisiae e mais tarde foi com êxito implementado em U. maydis20,21. Embora o índice de LD não dá um valor absoluto das marcas acumuladas nas células, ele fornece uma ideia rápida do conteúdo lipídico das células, e a interpretação dos dados é direta quando índice LD de duas ou mais condições experimentais são comparados. BODIPY 493/503 é altamente e...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgação

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por doações Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(Universidad Nacional Autónoma de México UNAM,) e o Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP e 256520-GGS). Fundação de Amparo a Pesquisa Rio de Janeiro (FAPERJ-Cientistas do Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Nós graças a QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo para o Visão geral esquemático. Dr. Miguel Tapia Rodríguez Agradecemos a ajuda valiosa na microscopia confocal de LDs. Gostaríamos de agradecer o Dr. Bruno Bozaquel Morais por seu trabalho pioneiro no desenvolvimento da técnica em S. cerevisiae que adaptamos para U. maydis.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
EspectrofotômetroVarioskan Lux microplaca multimodo readeD5879Filtro 493/503 ou detector monocromador
Placa costarCorning Inc.361596 poços de parede preta/fundo transparente
Placa costarCorning Inc359896 poços placa de cultura de células costar
BODIPY 493/503Invitrogen/ ThermofisherD39224,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno
Solução de formaldeídoSigma Aldrich252549reagente ACS, 37% em peso em H2O, contém 10-15% de metanol para evitar a polimerização
Iodeto de potássioSigma Aldrich60399BioUltra, ≥ 99,5% (AT)
FB2 Ustilago maydisATCC201384Basidiomiceto-Levedura
Cloreto de sódioSigma Aldrich746398Reagente ACS, sal inorgânico
Fosfato de potássio monobásicoSigma AldrichP0662Reagente ACS
Selecione o extrato de leveduraSigma AldrichY100Mistura de amini ácidos, peptídeos, solúveis em água, vitaminas e carboidratos para meios de cultura
N-Z case plusSigma aldrichN4642Caseína enzimática hidrolisado de leite
GlicoseSigma AldrichG-8270D (+) glicose
Skaker frascoPirexCLS4450250-6EAVidro borosiicado
ShakerSEV Mé xicoINO650V-7Agitador orbital
Mesa centrífugaEppendorf5415CMicrotubos de centrífuga
Sigma AldrichZ606340Eppendorf
Pontas de pipetaAxygen scientificT-200-YPontas de pipeta universais com extremidade chanfrada, 200 microlitros, pipeta mLine não estéril
Biohit7251308 canais, faixa de volume 5-100 uL
bovino

Referências

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