Descreveremos um protocolo para cirurgicamente expor e estabilizar a glândula salivar submandibular murino para intravital imagem usando microscopia intravital vertical. Este protocolo é facilmente adaptável a outras glândulas exócrinas da cabeça e região do pescoço dos ratos e outros pequenos roedores.
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Artigo de método
Preparação de murino das glândulas salivares Submandibular para microscopia Intravital vertical
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Glândula salivar submandibular (SMG) é uma das três principais glândulas salivares e é de interesse para muitos diferentes campos de pesquisa biológica, incluindo Imunologia, oncologia, odontologia e biologia celular. O SMG é uma glândula exócrina composta de células epiteliais secretoras, miofibroblastos, células endoteliais, nervos e matriz extracelular. Processos celulares dinâmicos no rato e rato SMG anteriormente tem sido fotografados, principalmente utilizando invertido sistemas multi fóton microscópio. Aqui, descrevemos um protocolo simples para a preparação cirúrgica e estabilização da SMG murino em ratos anestesiados para a imagem latente na vivo com sistemas vertical multi fóton microscópio. Apresentamos a moda imagem intravital representativa de endógena e enviaram transferido células fluorescentes, incluindo a rotulagem dos vasos sanguíneos ou dutos salivares e geração segundo harmônica Visualizar fibrillar colágeno. Em suma, nosso protocolo permite a preparação cirúrgica das glândulas salivares de rato em sistemas de microscopia na posição vertical, que são comumente usados para intravital imagem no campo da imunologia.
Introdução
Saliva é secretada pelas glândulas exócrinas para lubrificar o alimento, proteger as superfícies mucosas do trato oral e entregar as enzimas digestivas, bem como substâncias antimicrobianas1,2. Além de glândulas salivares menores intercaladas na submucosa oral, existem três conjuntos bilaterais das glândulas maiores identificados como parótida, sublingual e submandibular, de acordo com sua localização1,2. Células epiteliais em forma de pirâmide, organizados em sacos em forma de balão (ácinos) ou demilunes que são circundadas por células mioepiteliais e....
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Protocolo
Todo o trabalho animal foi aprovado pelo Comité Cantonal de Experimentação Animal e realizado de acordo com as diretrizes federais.
1. anestesiar o Mouse
- Utilize equipamento de protecção pessoal, incluindo luvas e jaleco.
- Misture cetamina, xilazina e soro fisiológico para um trabalho de concentração de 20 mg/mL e 1 mg/mL, respectivamente. Injetar o estoque de trabalho intraperitonealmente (i.p.) em 8-10 µ l/g de rato. Coloque o mouse volta para a jaula.
Nota: Este protocolo foi testado para 6 a 40-semanas os ratos masculinos e femininos com um fundo C57BL/6. - Preparar a solução de acepromazina a 2,5 mg/mL e 3....
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Resultados
Este protocolo permite imagens de quase todo o dorsal ou ventral lado da SMG. O campo de visão tipicamente inclui também a glândula salivar sublingual, que difere ligeiramente da SMG na composição celular4. Ambas as glândulas são encapsuladas por colágeno fibrillar e subdivididas em lóbulos. A maioria das 14:00 sistemas podem produzir uma imagem livre de rótulo de colágeno fibrillar medindo o sinal harmônico 2nd , mas geralmente moléculas fluorescentes s.......
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Discussão
Este protocolo oferece uma abordagem simples para a imagem latente na vivo de murino glândulas salivares submandibulares e sublingual usando microscopia não-linear vertical, muitas vezes usada no campo da imunologia. O método pode ser adaptado para o tratamento de imagens de outras glândulas exócrinas na região da cabeça e pescoço. Por exemplo, nosso laboratório tem realizado de imagem da glândula lacrimal de forma análoga (não mostrada).
Remover o tecido conectivo ao redor a SMG é a .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional Suíço (SNF) projeto concessão 31003A_135649, 31003A_153457 e 31003A_172994 (para joint ventures) e Leopoldina companheirismo semi-submersíveis 2011-16 (a BS). Este trabalho beneficiado ópticas configurações do "Microscopia Imaging Center" (MIC) da Universidade de Berna.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Narketan 10 % (Cetamina) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xilazina) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| NaCl salino 0,9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazina) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Barbeador elétrico | Wahl | 9818L | ou similar |
| Depilação creme | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Fita cirúrgica (2,5 cm x 9,1 m e 1,25 cm x 9,1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Fita cirúrgica (2,5 cm x 9,1 m e 1,25 cm x 9,1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super cola Ultra gel, cola instantânea | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Lâminas de vidro de cobertura de microscópio 20 mm e 22 mm | Menzel-Glä ser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Graxa para laboratórios 60 g glisseal N | Borer (fornecedor VWR) | DECO514215.00-CA15 | |
| Tesoura cirúrgica | Fine Science Tools (F.S.T) | 14090-09 | ou similar |
| Pinça Fina | Fine Science Tools (F.S.T) | 11252-20 | ou similar |
| Cotonete | Migros | 617027988254 | ou similar |
| Gaze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann e Rauscher | 18500 | ou similar |
| Estereomicroscópio | Leica | MZ16 | ou similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Sondas Moleculares | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Sistema de dois fótons | LaVision Biotec | TrimScope I e II | ou similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objetiva | Olympus | n/a | ou outra objetiva de imersão em água |
| Termômetro digital | Fluke | 95969077651 |
Referências
- Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. 101-121 (2005).
- Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 45-60 (2012).
- Masedunskas, A., Weigert, R.
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Reimpressões e permissões
