Método quantitativo e qualitativo para esfingomielina por LC-MS usando dois estável desvendar rotulado esfingomielina espécies

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar e qualificar cada espécie de esfingomielina usando múltiplas reação monitoramento e modo de MS/MS/MS, respectivamente.

Abstract

Apresentamos um método de analisar esfingomielina (SM) qualitativamente e quantitativamente por cromatografia líquida-electrospray espectrometria de massa de ionização-em tandem (LC-ESI-MS/MS). SM é um esfingolipídeos comum, composto por um phosphorylcholine e uma ceramida como o componente hidrofílico e hidrofóbico, respectivamente. Um número de espécies de SM está presente em células de mamíferos devido a uma variedade da esfingoides longa cadeia de base (LCB) e um N-moiety de acila na ceramida. Neste relatório, vamos mostrar um método de estimar o número de carbono e ligações duplas em uma LCB e um N-grupo acila baseia seus íons de produto correspondente em experimentos de MS/MS/MS (MS³). Além disso, apresentamos um método de análise quantitativa para SM usando duas estável desvendar rotulado SM espécies, que facilita a determinação do intervalo utilizado na quantificação da SM. O presente método será útil em caracterizando uma variedade de espécies de SM em amostras biológicas e produtos industriais como cosméticos.

Introduction

Esfingomielina (SM) é um comum esfingolipídeos em células de mamíferos. SM é sintetizada intracelular¹ e presente como um precursor para outros esfingolipídeos como um esfingosina-1-fosfato e uma ceramida, que têm papéis cruciais em imune celular tráfico e homeostase da barreira, respectivamente,^{2, a pele 3}. Assim, a análise precisa do metabolismo SM é importante para elucidar as funções fisiológicas e patológicas de esfingolipídeos.

SM é composto por uma ceramida e um phosphorylcholine que está vinculada ao grupo da ceramida, composto por mais uma esfingosi....

Protocol

Consulte todas as fichas de dados de segurança (MSDS) antes do uso. Use luvas para minimizar a contaminação da amostra por SM derivado de pele. O presente protocolo foi aplicado às células HeLa cultivadas na mínimo essencial suplementado do águia com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, 1.000 U/L penicilina e estreptomicina 100 mg/L.

1. preparação das amostras de lipídios

Nota: É importante que todos os produtos vidreiros, incluindo tubos de ensaio com tampas de rosca Teflon revestido isento de detergente.

1. Extração da fração lipídica total de homogeneizado de célula usando o método....

Results

Sintetizados quimicamente d18:1 / 24:0 SM (Figura 1A) e d18:1 / 24:0 SM em amostras de lipídios extraídas de células HeLa (Figura 1B) foram analisados por LC-ESI-MS³ empregando^– [M + HCOO] e [M-CH₃]^- como íons precursor de primeiro e segundo, respectivamente. Observe que a intensidade de espectro de desmetilado-sphingosylphosphorylcholine (CPE) (m/z.......

Discussion

No presente método qualitativo, obtivemos MS³ íons de produto de um SPC e um N-grupo acila. É fundamental para atribuir adequadamente tanto um SPC e um N-grupo acila. Para este fim, note-se que outras moléculas contendo phosphorylcholine também podem ser detectadas como MS³ íons de produto. Diacil-fosfatidilcolina (PC) e plasmalogen-PC estão abundantemente presentes em células de mamíferos, e sua hidrofobicidade é similar de SM. Portanto, diacil-PC e PC-plasmalogen com um isótopo (.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	ThermoFisher	10010023
placa de cultura de tecidos de 100 mm	IWAKI	3020-100
Raspador de células	IWAKI	9000-220
Tubo siliconizado de 2,0 mL	Fisher Scientific	02-681-321
Tubo de ensaio	IWAKI	TST SCR 16-100
Tampa de rosca revestida de teflon	IWAKI	9998CAP415-15
Tubo de vidro descartável	IWAKI	9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 µ m 1,5 mm I.D. x 100 mm	Shiseido	92223	O cartucho de proteção é inserido no suporte do cartucho e ligado à coluna C18
CAPCELL C18 MGII S-3 2,0 mm x 10 mm CARTUCHO DE PROTEÇÃO	Shiseido	12197
Suporte do cartucho	Shiseido	12415
Acetonitrila	Wako	018-19853
2-Propanol (álcool isopropílico)	Wako	161-09163
Metanol	Wako	134-14523
Ácido fórmico	Wako	066-00466
28% de água de amônia	Wako	016-03146
Sonicador (tipo banho)	SHARP	UT-206H
Misturador de vórtice para tubo de ensaio de vidro	TAITEC	Mix-EVR
frasco de vidro de 1,4 mL	Tomsic	500-1982	As amostras são armazenadas em frasco de vidro de 1,4 mL selado com tampa de rosca e septo de 8 mm a -20° C
8 mm septo	Tomsic	200-3322	Quando as amostras são analisadas, as tampas de rosca são substituídas por tampas de rosca com septo cortado
Tampa de rosca para frasco de vidro de 1,4 mm	Tomsic	500-2762
Tampa de rosca com septo cortado	Shimadzu GLC	GLCTV-803
PVDF 0,22 µ Filtro	Millipore	SLGVR04NL
Espectrometria de massa de armadilha de íons linear triplo quadrupolo e quadrupolo	SCIEX	QTRAP4500
O software para aquisição e análise de dados de espectros de íons de produtos	SCIEX	Analyst
O software para integração de dados em análise quantitativa	SCIEX	MultiQuant
Sistema HPLC	Shimadzu	Garrafa de vidro Nexera
	Sansyo	85-0002
d18:1/24:0 esfingomielina	Avanti Polar Lipids	860592P
Esfingosilfosforilcolina	Merck	567735
Soro fetal bovino	ThermoFisher
L-glutamina	ThermoFisher
Penicilina e estreptomicina	Sigma	P4333
Eagle' s mínimo essencial médio	Sigma	M4655