Pseudomonas aeruginosa infecção causa morbidade significativa em hosts vulneráveis. A biblioteca de mutantes de inserção transposon não redundante da estirpe de p. aeruginosa PA14, designado como PA14NR definida, facilita a análise da funcionalidade do gene em inúmeros processos. Apresentado aqui é um protocolo para gerar cópias de alta qualidade da biblioteca mutante PA14NR definido.
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Artigo de método
Replicação do requisitado, biblioteca não redundante de estirpe Pseudomonas aeruginosa PA14 Transposon mutantes de inserção
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa fenotipicamente e Leishmania diversificada e adaptável onipresente em ambientes humanos. P. aeruginosa é capaz de formar biofilmes, desenvolver resistência aos antibióticos, produzem fatores de virulência e evoluir rapidamente no decurso de uma infecção crônica. Assim, p. aeruginosa pode causar tanto aguda e crônica, difícil de tratar infecções, resultando em morbidade significativa em certas populações de pacientes. Estirpe de p. aeruginosa PA14 é um humano isolado clínico com uma estrutura de genoma conservada que infecta uma variedade de hospedeiros mamíferos e nonvertebrate fazendo PA14 uma estirpe atraente para estudar este patógeno. Em 2006, uma biblioteca de mutantes de inserção do transposon não redundante contendo 5.459 mutantes correspondente previsto 4.596 PA14 genes foi gerada. Desde então, a distribuição da biblioteca PA14 permitiu a comunidade de pesquisa compreender melhor a função de genes individuais e complexos caminhos de p. aeruginosa. Manutenção da integridade da biblioteca através do processo de replicação requer técnicas adequado manuseio e precisas. Para o efeito, este manuscrito apresenta protocolos que descrevem detalhadamente as etapas envolvidas em replicação de biblioteca, biblioteca de controle de qualidade e armazenamento adequado dos mutantes individuais.
Introdução
Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa fenotipicamente e Leishmania diversificada e adaptável presente no solo, água e ambientes mais humanos, bem como a microflora da pele. Comparado a muitas espécies bacterianas, p. aeruginosa tem um genoma relativamente grande de 5.5-7 Mbp com conteúdo de alto G + C (% de 65-67). Além disso, uma parte significativa dos seus genes estão envolvida na adaptabilidade metabólica e fazem parte de redes de regulação, permitindo uma grande flexibilidade em resposta ao estresse ambiental1. P. aeruginosa expressa uma infinidade de fatores de virulência, apresenta tendência para ....
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Protocolo
Atenção: Utilize padrão BSL-2 medidas de segurança ao manusear a p. aeruginosa, um patógeno humano. Se você é um indivíduo imunocomprometido ou tem qualquer condição médica que aumenta sua susceptibilidade à infecção bacteriana, tome cuidado especial ao trabalhar com P. aeruginosa. Consulte o escritório de biossegurança na sua instituição e obter a aprovação do seu médico antes de trabalhar com o o PA14 NR definido ou bibliotecas mutantes de patógenos bacterianos.
F....
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Resultados
Doze novas cópias da PA14NR Set foram replicadas usando protocolo I e uma avaliação de controle de qualidade das cópias do novas gerado foi realizado utilizando protocolo III.
PA14NR conjunto placas mutantes, juntamente com as placas de controle, que consistem de tipo selvagem PA14 inoculado e não inoculadom poços intercalados em um padrão predefinido (Figura 4A), foram replicadas na sequência metho.......
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Discussão
O P. aeruginosa Conjunto de PA14NR é um recurso valioso para a comunidade científica. De acordo com o conjunto de dados de março de 2017 de banco de dados de indicadores essenciais da ciência de Clarivate do Analytics, et al . Liberati (2006) 37, que descreve a construção de conjunto de PA14NR, é classificado no top 1% das publicações de microbiologia. Google Scholar relata mais de 600 citações da Liberati et al manuscrito original (2006) a partir de agosto de 2.......
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Divulgações
Os autores relatam que não há conflitos de interesses financeiros. Eliana Drenkard e Frederick Ausubel participaram da criação biblioteca mutante PA14 transposon não redundante. Bryan Hurley e Lael Yonker atualmente casa e distribuem a biblioteca mutante como parte do departamento de Pediatria do hospital geral de Massachusetts.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Lisa Philpotts da MGH Treadwell Biblioteca Virtual para sua orientação na busca de dados. Este trabalho foi financiado pela Fundação de fibrose cística (YONKER16G0 e HURLEY16G0) e NIH NIAID (BPH e ADE: R01 A1095338).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Materiais para Replicação de Biblioteca | |||
| Estéril 96-well Tissue-culture tratado, caso de 50 | Corning Life Sciences | 353072 | via Fisher Scientific |
| Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μ L Deep Well Plates, caixa de 25 | Corning Life Sciences | 3960 | via Fisher Scientific |
| Nunc OmniTray (placas retangulares), caixa de 60 | Thermo Scientific Rochester | 242811 | via Fisher |
| Scientific Rectangular Ice Pan, Midi (4L) | Corning Life Sciences | 432104 | via Fisher Scientific |
| Secure-Gard Cone Mask, caixa de 300 | Cardinal Health | AT7509 | via Fisher Scientific |
| AluminaSeal, embalagem de 100 | Diversified Biotech | ALUM-100 | via Fisher Scientific |
| Membrana Breathe-Easy, embalagem de 100 | Diversified Biotech | BEM-1 | via Sigma-Aldrich |
| Sterile, embalada individualmente, 50mL de calha de solução/reservatório de reagente, caixa de 100 | Sorenson | S50100 | via Westnet Incorporated |
| Rolo de placa | VWR | 60941-118 | via VWR |
| Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2,64" x 0,277", embalagem de 16 folhas | GA International | RCL-11T1-WH | via Labtag.com (modelo para impressão também disponível a partir de Labtag.com) |
| Replicador de 96 poços | V & P Científico, Inc. | Personalizado 407C, diâmetro do pino de 3,18 mm, 57 mm de comprimento | via V & P Científico, Inc. |
| Multitron Pro, incubadora vibratória de 3mm | Infors HT | l10003P | via Infors HT |
| Picus 12 Canais 50-1200μ L Pipeta Eletrônica | Sartorius | 735491PR | via Sartorius |
| Filter Tips 50-1200μ L, pacote de 960 | Biohit | 14-559-512 | via Fisher Scientific; use pontas eletrônicas compatíveis com multicanal |
| Dry Ice | Fornecedor específico do usuário | ||
| Materiais para Armazenamento Mutante Individual | |||
| Fisherbrand Tubos de Microcentrífuga Premium: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-130 | via Fisher Scientific |
| Pipetas (P1000, P200, P20, P2) | Gilson | F167370 | via Gilson |
| Materiais para Controle de Qualidade PCR | |||
| Fisherbrand Tubos de Microcentrífuga Premium: 1,5mL | Fisher Scientific | 05-408-130 | via Fisher Scientific |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | via ThermoFisher |
| PCR Thermocycler | |||
| Tubos de PCR Omnistrips com tampas abobadadas | Thermo Scientific | AB0404 | via Fisher Scientific |
| ART Barreiras ponteiras de pipeta de baixa retenção (10 uL, 100 uL, 1000 uL) | Molecular BioProducts, Inc. | Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) | via Pipetas Sigma-Aldrich |
| (P1000, P200, P20, P2) | Gilson | F167370 | via Gilson |
| Fisherbrand Tubos de Microcentrífuga Premium: 1,5 mL | Fisher Scientific | 05-408-130 | via Fisher Scientific |
| MasterKit de purificação de DNA puro | Epicentre | MCD85201 | via Epicentre Technologies Corp |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, pronto para uso | Thermo Scientific | SM1333 | via ThermoFisher |
| RediLoad Loading Buffer | Invitrogen | 750026 | via ThermoFisher |
| Chemicals< | |||
| em>Chemicals for Library and Individual Mutant Storage | |||
| Glycerol MB Grade, 1L | Sigma Aldrich | G5516 | via Sigma-Aldrich |
| LB Caldo | por 1L dH2O: 10g de triptona, 5g de extrato de levedura, 5g de NaCl, 1ml de NaOH 1N (Protocolos Atuais em Biologia Molecular. Wiley, 1994.) | ||
| Triptona | Sigma Aldrich | T7293 | via Sigma-Aldrich Extrato de |
| Levedura | Sigma Aldrich | Y1625 | via Sigma-Aldrich |
| Cloreto de Sódio | Sigma Aldrich | S7653 | via Sigma-Aldrich |
| Hidróxido de Sódio | Sigma Aldrich | S8045 | via Sigma-Aldrich |
| LB ágar | Veja a preparação acima, adicione 15g de Ágar Bacto | ||
| Bacto Agar | Sigma Aldrich | A5306 | via sulfato de gentamicina Sigma-Aldrich |
| , 10g | BioReagent | 1405-41-0 | via sulfato de |
| canamicina | Gibco | 11815024 | via ThermoFisher |
| Ethanol, 190 prova | Decon | 04-355-221 | via Fisher Scientific |
| Chemicals for Quality Control PCR | |||
| Primers | Fornecedor preferencial do usuário | Consulte os primers listados na Tabela 3 | |
| Corning cellgro Molecular Biology Grade Water | Corning | 46000CV | via Fisher Scientific |
| Taq Polymerase Buffer | Invitrogen | 10342020 | via ThermoFisher |
| Taq DNA Polimerase, | Invitrogen | 10342020 | via ThermoFisher |
| dNTPs | Invitrogen | 10297018 | via ThermoFisher |
| Agarose | Sigma | A9539 | via Sigma-Aldrich |
Referências
- Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39(2017).
- Bleves, S., et al. Protein secretion sy....
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Reimpressões e permissões
