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Artigo de método

Cultura de células-tronco pluripotentes humanas em polivinil álcool-Co-itacónico ácido hidrogel com rigidez diferentes condições Xeno-livre

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DOI:

10.3791/57314

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3 de fevereiro de 2018

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1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Um protocolo é apresentado para preparar polivinil álcool-co-itacónico ácido hidrogel com rigidez diferentes, que foram enxertados com e sem oligopeptídeos, para investigar o efeito da rigidez dos biomateriais na diferenciação e proliferação de células-tronco. A rigidez do hidrogel era controlada pelo tempo de reticulação.

Resumo

O efeito de sinais físicos, como a rigidez dos biomateriais de proliferação e diferenciação de células-tronco, foi investigado por vários pesquisadores. No entanto, a maioria destes investigadores utilizaram hidrogel de poliacrilamida para cultura de células-tronco em seus estudos. Portanto, seus resultados são controversos, porque esses resultados podem originar as especificidades da poliacrilamida e não do sinal físico (rigidez) dos biomateriais. Aqui, descrevemos um protocolo para a preparação de hidrogel, que não é baseados em poliacrilamida, onde vários tronco, células, incluindo células-tronco embrionárias humanas (ES) e humanas pluripotentes induzidas (iPS) células, podem ser cultivadas. Hidrogel com rigidez diferentes foram preparados a partir bioinert polivinil álcool-co-itacónico ácido (P-IA), com rigidez controlada pelo grau de reticulação, alterando o tempo de reticulação. O hidrogel de P-IA enxertado com e sem oligopeptídeos derivados de matriz extracelular foram investigados como uma futura plataforma para cultura de células-tronco e diferenciação. A cultura e a passagem de células tronco de líquido amniótico, células-tronco derivadas adiposo, células ES humanas e células iPS humana é descrito em detalhes aqui. O hidrogel de oligopeptídeos P-IA mostrou performances superiores, que foram induzidas por suas propriedades de rigidez. Este protocolo informa a síntese do biomaterial, sua manipulação de superfície, juntamente com controlar as propriedades de rigidez e, finalmente, seu impacto sobre o destino de células-tronco usando as condições de cultura xeno-livre. Com base em estudos recentes, tais substratos modificados podem atuar como futuras plataformas para apoiar e dirigir o destino de linha de células-tronco vários elos diferentes; e mais, regenerar e restaurar as funções do tecido ou órgão perdido.

Introdução

O destino da diferenciação de células-tronco em uma linhagem específica de células e a longo prazo proliferação de células-tronco, células especialmente humano pluripotentes induzidas (iPS) e células-tronco embrionárias humanas (ES), é conhecido por ser reguladas por inibidores, fatores de crescimento, e / ou pequenas moléculas bioativas em meios de cultura. Recentemente, as pistas físicas dos biomateriais, particularmente a rigidez dos biomateriais de cultura de células, têm sido reconhecidas para ser um importante fator para orientar o destino das células-tronco proliferação e diferenciação1,2, 3,4,5,6. Portanto, vários pesquisadores começaram a investigar o destino das células-tronco, que são cultivadas em hidrogel, na diferenciação, principalmente usando hidrogel de poliacrilamida com variação de rigidez.

A rigidez dos biomateriais pode controlar aderências focais, morfologia celular, fenótipo celular e adesão de células-tronco, especialmente em duas dimensões (2D) cultivo1,2,3,5. Mechano-detecção de biomateriais por células-tronco é geralmente controlada pela adesão focal sinalização via receptores integrinas. NMMIIA, miosina nonmuscle contratilidade IIA-dependente do citoesqueleto de actina desempenha um papel crítico no processo de mechanosensing das células-tronco em 2-D célula cultivo sistemas3,4,5, 7,8,9,10,11.

Engler e seus colegas desenvolveram uma noção interessante que células-tronco adultas, como as células-tronco (BMS) medula óssea cultivadas em biomateriais de cultura de células com uma rigidez semelhante ao de tecidos específicos, tendem a se diferenciar em células originadas-se tecidos específicos5. Células BMS incubadas em hidrogel de poliacrilamida macio 2-D, revestido com colágeno tipo I (com uma rigidez comparável de tecidos cerebrais) em meios de expansão foram induzidas espontaneamente para diferenciar em linhagens de neurônio precoce, Considerando que as células BMS cultivadas na Hidrogel com uma rigidez semelhante do músculo ou tecidos ósseos colágenas foram encontrados para induzir a diferenciação em linhagens iniciais de miócitos e osteoblastos, respectivamente, em hidrogel de poliacrilamida de 2-D3,5. Muitos pesquisadores têm investigado o destino de células-tronco de diferenciação cultivadas na poliacrilamida hidrogel imobilizada com colágeno tipo I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. no entanto, deve-se mencionar que alguns contraditório relatórios1,18,22,23,24 existem para a conhecida ideia sugerida por Engler et al. 5 é porque ideia5 do Engler foi desenvolvido exclusivamente em hidrogel de poliacrilamida e seus resultados têm originado de características específicas do biomaterial (poliacrilamida) e não unicamente do cue físico (rigidez) de o biomaterial. Portanto, é importante desenvolver um outro tipo de hidrogel, dos quais a rigidez pode ser controlada por reticulação do hidrogel. Para este efeito, foram desenvolvidas bioinert hidrogel, que foram preparados de polivinil álcool-co-itacónico ácido (P-IA), com uma rigidez diferente, que foi controlada pelo grau de reticulação com uma mudança reticulação tempo25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. as células-tronco podem ser cultivadas em hidrogel de P-IA nonmodified, bem como P-IA hidrogel enxertado com matrizes extracelulares (ECMs) e oligopeptídeos. Em um estudo anterior25, hematopoiéticas células estaminais humanas (hHSCs) do sangue do cordão umbilical foram cultivadas sobre P-IA hidrogel com valores de rigidez diferentes que variam de um kPa 3 módulo de armazenamento 30 kPa onde fibronectina ou um oligopeptídeos derivados fibronectina (CS1, EILDVPST) foi enxertada o hidrogel P-IA. Alta ex vivo expansão dobra de hHSCs foi observada no hidrogel P-IA enxertado com CS1 ou fibronectina, que exibido um intermediário rigidez variando de 12 kPa a 30 kPa25.

IPS de humana e células ES não podem ser cultivadas na cultura de tecidos convencionais poliestireno (TCP) pratos33,34 porque ES humano e células iPS requerem ligação específica para ECMs, tais como vitronectina ou laminina para manter sua pluripotência durante a cultura a longo prazo. Portanto, várias estruturas de oligopeptídeos-enxertados P-IA hidrogel com características de rigidez ideal foram projetadas e preparadas em formações de uma cadeia única, uma única cadeia com um segmento comum, uma cadeia dupla com um segmento comum e um tipo ramificado Cadeia de32. Oligopeptídeos sequências foram selecionadas entre domínios de integrina e glicosaminoglicano-vinculação de ECMs. O hidrogel de P-IA enxertado com oligopeptídeos derivados vitronectina com uma dupla cadeia ou segmento comum, que tem um módulo de armazenamento em aproximadamente 25 kPa, com suporte a cultura a longo prazo do ES humano e células iPS para mais de 12 passagens sob livre de xeno e química condições definidas32. O segmento comum e corrente dupla com moléculas de adesão celular sobre o hidrogel facilitaram a proliferação e células de pluripotência humana ES e iPS32. Aqui, um protocolo para a preparação de P-IA hidrogel (com um módulo de armazenamento de 10 kPa a 30 kPa, que foi medido sob condições de chuva no ar) enxertadas com e sem oligopeptídeos ou ECMs é descrito. Como a cultura e a passagem de várias células-tronco (incluindo células tronco de líquido amniótico, células-tronco derivadas adiposo, células ES humanas e células iPS de humanos) é mostrado.

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Protocolo

As experiências neste estudo foram aprovadas pelos comités de ética do Hospital Landseed Formosa (IRB-13-05) e a Universidade Central Nacional. Todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com os regulamentos e diretrizes governamentais e institucionais relevantes e aplicáveis durante este estudo.

1. solução e preparação de meios de comunicação

  1. Purificação do polímero
    1. Purificar o P-IA com um grupo ácido carboxílico com um grau de hidrólise de > 96,5% lavando P-IA com o etanol. Coloque 20 g de P-IA em 200 mL de etanol num copo de Erlenmeyer de 500 mL e agitar um agitador magnético para 24-30 h troca o etanol com etanol fresco cada 8-10 h.
    2. Remova P-IA o etanol por filtração usando um funil de Büchner.
    3. P-IA seco por secagem a vácuo à temperatura ambiente por 24 h.
      Nota: Recomenda-se limpar a armadilha no sistema de secagem a vácuo (com a remoção do etanol) com frequência, especialmente durante a inicial de algumas horas, porque a armadilha tende a ficar obstruídos após a remoção de uma grande quantidade de etanol a partir de P-ia
  2. Preparação da solução P-IA
    Nota: Adicione o polímero muito lentamente para o solvente (água). É recomendável levar pelo menos 15 min para adicionar o P-IA para o solvente. Se o solvente é adicionado para o polímero, o polímero não iria ser dissolvido completamente. Tenha cuidado para não gerar ebulição explosiva da solução P-IA. Use óculos de proteção durante a preparação da solução P-IA. O processo de aquecimento da solução P-IA é essencial para dissolver o P-ia cristalino É sugerido (e preferível) para preparar a solução de P-IA em uma sala experimental relativamente limpo, se possível.
    1. Dissolver o P-IA em água pura a uma concentração de peso 0,050% para o experimento de cultivo celular ou uma concentração de peso 0,50% para a medição de rheometer: por exemplo, dissolver 50 mg de P-IA em 100 mL de água pura para cultura de células e 500 mg de P-IA em 100 mL de água ionizada (DI) para as medições de rheometer.
    2. Agite a solução de P-IA por 1h na chapa quente.
      Nota: Para evitar a ebulição explosiva, não aqueça a solução acima de 95 ° C. Explosivo de ebulição da solução de polímero em alta temperatura, pode provocar queimaduras na pele. Portanto, realizar o aquecimento do P-i muito cuidadosamente e monitorar a temperatura da solução P-IA durante o aquecimento.
    3. Quando a solução de P-IA foi arrefecida à temperatura ambiente, agitar a solução de P-IA em temperatura ambiente por 48 h. solução de P-IA deixar quente na chapa quente sem aquecimento e depois deixá-lo sem agitação à temperatura de 20-24 h assegurar que as bolhas de ar Não presente na solução P-IA.
  3. Preparação da solução de reticulação
    1. Fazer a composição da reticulação solução 1.0 peso % de glutaraldeído da solução aquosa glutaraldeído 25%, peso de 20,0% Na2então4 usando 99% > pureza e 1.0% H2de peso então4. Por exemplo, para um 6 ou 12 bem, placa de cultura de células, adicionar 100 µ l de solução de glutaraldeído, 2 g de sulfato de sódio e 100 µ l de ácido sulfúrico em 10 mL de água pura.
  4. Meios de cultura de células ES/PS humano
    Nota: Uso DMEM/F12 mídia mídia 6 essencial e mídia 8 essenciais para a cultura de células.
    1. Retorno congelado 50 suplemento essencial x8 lentamente à solução durante a noite pelo degelo na geladeira a 4 ° C.
    2. Adicione uma garrafa de 50 suplemento essencial 8 X dentro de um frasco de mídia basal 8 essenciais. Separar os meios de comunicação em pequenas alíquotas (50ml cada) em tubos de centrifugação de 100 mL e, em seguida, armazenar a mídia a-20 ° C.

2. P-IA Hydrogel prato preparação

  1. Preparação de filme P-IA
    1. Injectar uma alíquota de 1 mL da solução de P-IA por um prato TCP de 35 mm e o prato em um forno de 45 ° C por 2 dias para produzir um filme P-IA de uma bancada limpa a seco.
  2. Reticulação dos pratos P-IA hidrogel
    1. Mergulhe os filmes P-IA em uma solução aquosa de reticulação para 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 e 48 h.
      Nota: ' P-IA -X' (por exemplo, P-IA-12 h) refere-se a um reticulado de hidrogel P-IA para h X (por exemplo, 12 h).
    2. Após a reticulação, enxágue o hidrogel P-IA com água pura, à temperatura ambiente e ficar com hidrogel em água pura, à temperatura ambiente em uma bancada limpa.
    3. Esterilizar o hidrogel P-IA por imersão em uma solução de etanol 75,0 volume/volume% por 1 min, enxaguar o hidrogel P-IA em água pura seis vezes e depois manter o hidrogel P-IA em água pura até utilizado para cultivo de células.
  3. Preparação de pratos de hidrogel P-IA enxertado com oligopeptídeos ou ECM
    1. Ativar o hidrogel P-IA através de imersão em 1 mL de solução aquosa contendo 10 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl) -N'- ethylcarbodiimide cloridrato (EDC) e 10 mg/mL de N- Hidroxisuccinimida (NHS) para 1 h a 37 ° C ou 4 h a 4 ° C.
    2. Enxágue o hidrogel P-IA com 1 mL de fosfato tampão salino (PBS, pH 7,2) 3 vezes e mergulhe o hidrogel P-IA em uma solução de PBS contendo 1 mL de oligopeptídeos (100-1.500 µ g/mL) ou ECM (10-100 µ g/mL) por 24 h a 4 ° C.
      Nota: As sequências de oligopeptídeos e ECMs usados para cultura de células-tronco estão resumidos na tabela 1.
    3. Após a enxertia a oligopeptídeos ou ECM, lave o P-IA hidrogel com água pura 3 vezes.
      Nota: O hidrogel P-IA enxertado com Y µ g/mL de oligopeptídeos ou ECM (Z) é adiante designados P-IA -Xh -Z ouP-IA-Xh -Z-Y, onde X refere-se a tempo de reticulação (h), Y indica a concentração dos oligopeptídeos ou ECM, e Z indica uma diferente oligopeptídeos ou ECM.

3. cultura de pilha humana ES/iPS

  1. Método de passagem e de manutenção do ES humano indiferenciadas e células iPS
    1. Manter ES humanas (por exemplo, WA09 ou H9) células ou iPS humana (por exemplo, HS0077) células na Matrigel em media 8 essencial em pratos de 6cm, usando o padrão humano ES/iPS celular cultura protocolos28,32.
    2. Incubar as células humanas de ES/iPS perto confluente com dispase de 2,0 mg/mL II em mídia DMEM/F-12 a 37 ° C por 8-10 min e depois enxaguar células humanas de ES/iPS duas vezes com mídia DMEM/F12.
    3. Após a adição de 2 mL de DMEM/F-12 mídia para pratos de cultura de células ES/iPS humanas, desanexar fracamente aderentes colônias com uma espátula de célula ou pipetando.
    4. Coletar as células humanas de ES/iPS em tubos de centrifugação de 15 mL e centrifugar células humanas de ES/iPS em 160 × g por 5 min a 37 ° C.
    5. Após a centrifugação, descartar o DMEM/F12 e suspender as células humanas de ES/iPS em 1 mL de mídia E8 e então contar a densidade celular usando um contador de célula.
    6. Inocule as células ES/iPS após o ajuste de densidade adequada (1-5 x 104 células por cm2 para passagem ou como indicado) em novos pratos de cultura (P-IA hidrogel enxertado com os oligopeptídeos ou ECM).

4. Caracterização da caracterização de célula humana ES/iPS

  1. Avaliação da atividade da fosfatase alcalina (AP)
    1. Medir a atividade da fosfatase alcalina (AP) de células humanas de ES/iPS usando uma fosfatase alcalina padrão de coloração ao vivo.
  2. Immunostaining
    1. Execute imunocoloração de Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 e Oct3/4 em células hES e quadris para investigar pluripotência seguindo o protocolo convencional28,32.
    2. Adicione um volume de 0,5 mL de paraformaldeído 4% (volumétrica) em cada prato bem 24 em que as células ES/iPS humanas foram cultivadas, em posteriormente, incubam a louça por 15 min a 4 ° C para reparar as células.
    3. Aspire a solução de paraformaldeído de cada poço. Em seguida, adicionar 1 mL de PBS por bem e Aspire PBS para lavar as células. Execute o processo de lavagem 3 vezes.
    4. Permeabilize das membranas celulares, adicionando 0,5 mL de 0,3% (volume/volume) de solução de Triton X 100 em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
    5. Aspirar a solução Triton X 100 e adicionar 300 µ l de 2% (peso/volume) albumina de soro bovino (BSA) em PBS (tampão de bloqueio) em cada poço e incube por 30 min à temperatura ambiente.
    6. Retire o tampão de bloqueio por pipetagem e posteriormente, adicionar os anticorpos primários desejados (Oct3/4 (1: 200), Sox2 (1: 200), SSEA-4 (1: 200) e Tra-1-81(1:200) com uma pipeta, ver tabela 2) em cada poço, onde 1: 200 indica que os anticorpos foram diluídos com PBS 200-fold e incubados por um dia a 4 ° C.
    7. Aspirar a solução de anticorpo primário e lavam-se as células com 300 µ l de 0,05% Tween 20 em solução de PBS 3 vezes à temperatura ambiente.
    8. Adicione 300 µ l de anticorpos secundários (1: 200, ver tabela 2), que são específicos para o principal subtipo de IgG, em solução a 2% (peso/volume) BSA em cada bem e incubar por 1h à temperatura ambiente no escuro.
    9. Lavar as células com 300 µ l de 0,05% Tween 20 em solução de PBS 3 vezes à temperatura ambiente no escuro.
    10. Analise as células coradas por microscopia de fluorescência ou microscopia confocal.
  3. Formação do corpo do embryoid
    1. Investiga a pluripotência das células humanas ES/iPS pela formação do corpo do embryoid (EB) em passagens de 10 e 20.
      Nota: Perto de 80% confluência em placas boas 6 é suficiente para a preparação de formação de EB.
    2. Enxágue ES humano ou células iPS com 2 mL de DMEM/F-12 mídia duas vezes e em seguida, mergulhe as células em 1,5 mL de mídia essencial 6.
    3. Corte perto de 80% humano ES ou iPS confluentes em aproximadamente 32 pedaços usando 200 µ l dicas. Em seguida, separe as células desde os pratos usando um raspador de célula.
    4. Colete células humanas ES/iPS e transferência em um prato de fixação ultralow 6-poços.
    5. Troca de 6 mídia essencial pipetagem mídias antigas e adicionando mídia fresca cada 2 dias.
      Nota: Cultura de células em suspensão por 2 semanas a 37 ° C com 5% de CO2.
    6. Depois o EBs homogênea foram suspensos em meios essenciais 6, transferir EBs para cultura em pratos TCP 24-poço revestidos com gelatina de % peso 0.1 e cultura de células em mídia 6 essencial para mais uma semana.
    7. Manchar as células com anticorpos contra marcadores de células derivadas de três camadas embrionárias germline [AFP (endoderme), GFA (ectoderme), β (ectoderme) III-tubulina e SMA (mesoderme)] e avaliar as células pelo método de imunocoloração descrito acima.
  4. Formação de teratoma
    1. Investiga a pluripotência das células humanas ES/iPS por formação de teratoma em passagens de 10 e 20.
      Nota: 5 pratos de perto de 80% de confluência em placas 6 boas são suficientes para a formação de teratoma (pelo menos 3 x 106 células são necessárias para as experiências de formação de teratoma).
    2. Enxagúe as células com 2 mL DMEM/F-12 mídia duas vezes e em seguida, adicionar 1,5 mL DMEM/F-12 meios de comunicação para os pratos de cultura de células.
    3. Corte quase 80% humano ES ou iPS confluentes em cerca de 32 peças por uso de 200 µ l dicas. Em seguida, separe as células desde os pratos usando um raspador de célula.
    4. Coletar células humanas ES/iPS em um tubo de centrifugação 15 mL e centrifugar as células a 160 × g por 5 min a 37 ° C.
    5. Após a centrifugação, suspender as pelotas de célula em 100 µ l DMEM/F12 e então misture a célula pelotas com 100 µ l Matrigel (relação de volume de 1:1).
    6. Transferi a suspensão de células em uma seringa pre-cooled de-20 ° C. Injetar, no total, pelo menos 3 × 106 células por via subcutânea no masculino NOD-SCID (assentimento. CB17 -Prkda/JNarl descid) ratos (5-8 semanas).
    7. Depois de 5-8 semanas, dissecar os teratomas, corrigir com solução de paraformaldeído 4,0% (peso/volume) e em seguida armazenar a 4 ° C.
    8. Corrigir o teratoma com parafina, Fatie os teratomas parafina e manchar com hematoxilina e eosina (H & E) usando um protocolo padrão de28,32.
      Nota: Pesquisadores podem enviar tecido teratoma fixo para a empresa para corrigir os teratomas com parafina, os teratomas fatia a parafina e mancha a amostra com H & E, que normalmente é usada no departamento de patologia em hospitais.
  5. Cultura de células tronco adiposo-derivado humano (anúncios)
    1. Meios de cultura quente (DMEM contendo 1% antimicótico antibiótico e 10% fetal de soro bovino (FBS)), 0,25% de tripsina-EDTA e PBS a 37 ° C em um antes do banho de água de usar.
    2. Lave células humanas de anúncios por pipetagem 10 mL de PBS em cada prato de 6 cm de cultura onde as células são cultivadas.
    3. Adicionar 1 mL de solução de tripsina-EDTA (0,25%) para os pratos de cultura de 6 cm e incubar a solução a 37 ° C por 5 min.
    4. Observe as células os pratos de cultura de 6 cm sob microscopia para confirmar que as células são desanexadas.
    5. Coletar as células em um tubo de centrífuga de 15 mL e adicionar um volume igual de meios de cultura (DMEM contendo antibiótico antimicótico 1% e 10% FBS) no tubo de centrífuga para neutralizar o tripsina-EDTA.
    6. Centrifugar as células a 250 × g por 5 min a 37 ° C.
    7. Após a centrifugação, desprezar o sobrenadante, cuidadosamente, pipetando, sem perturbar o centrifugado.
    8. Ressuspender as células nos meios de cultura e então propagar as células a densidade adequada (5-10 x 103 células por cm2 para passagem ou como indicado) em novos pratos de cultura (P-IA hidrogel enxertado com e sem oligopeptídeos e ECM).
  6. Cultura de células (AFS)-tronco amniótico humano
    1. Aquecer meios de cultivo (DMEM/MCDB 201 (2:3) contendo 20% soro fetal bovino (FBS), 5 ng/mL bFGF e 1% de antibiótico antimicótico), 0,25% de tripsina-EDTA e PBS a 37 ° C em um antes do banho de água de usar.
    2. Lave células humanas AFS por pipetagem 10 mL de PBS em cada prato de 6 cm de cultura onde as células são cultivadas.
    3. Adicionar 1 mL de solução de tripsina-EDTA (0,25%) em pratos de cultura de 6 cm e incube as celulas a 37 ° C por 5 min.
    4. Observe as células em pratos de cultura de 6 cm sob microscopia para confirmar as células são desanexadas.
    5. Coletar as células em um tubo de centrífuga de 15 mL e adicionar um volume igual de meios de cultura (DMEM/MCDB 201 (2:3) contendo 20% fetal de soro bovino (FBS), 5 ng/mL bFGF e 1% de antibiótico antimicótico) no tubo de centrífuga para neutralizar o tripsina-EDTA.
    6. Centrifugar as células a 250 × g por 5 min a 37 ° C.
    7. Após a centrifugação, desprezar o sobrenadante, cuidadosamente, sem perturbar o centrifugado por pipetagem.
    8. Ressuspender as células em meios de cultivo e sementes em seguida as células a densidade adequada (5-10 x 103 células por cm2 para passagem ou como indicado) em novos pratos de cultura (P-IA hidrogel enxertado com e sem oligopeptídeos e ECM).

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Resultados

P-IA hidrogel enxertado com ECM-derivado oligopeptídeos (oligoECM) ou ECM com diferentes elasticidades foram preparados seguindo o esquema de reação, como pode ser visto na figura 1A, utilizando diferentes tipos de oligoECM (figura 1B). As elasticidades do hidrogel eram reguladas pela intensidade aplicada reticulação (tempo) (Figura 1). P-IA hidrogel enxertado com oligopeptídeos derivados vitronectin...

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Discussão

P-IA-oligoECM e P-IA-ECM hidrogel com rigidez diferentes foram desenvolvidos para a expansão a longo prazo do ES humano e células iPS, mantendo sua pluripotência para mais de dez passagens em condições xeno-livre, bem como para a cultura de células humanas de AFS, células de anúncios, e células-tronco hematopoiéticas25,28,32. P-IA hidrogel imobilizada com oligoECM é um excelente candidato para materiais de cultivo celular para i...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi parcialmente apoiada pelo Ministério da ciência e tecnologia, Taiwan sob concessão números 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 e 104-2221-E-008-107-MY3. Esta pesquisa foi também apoiada pelo projecto Hospital Landseed de Taiwan (NCU-LSH-105-A-001). Um subsídio para investigação científica (número 15K 06591) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia do Japão também é reconhecido. R. Higuchi gostaria de reconhecer para o programa de parceria científica internacional (ISPP-0062) Vice reitoria de pós-graduação e pesquisa, King Saud University, Riyadh 11451, Reino da Arábia Saudita.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
GTPGPQGIAGQRGVVPH JapãonenhumEspecificação: Oligopeptídeo
Abreviatura: Cíclico RGD, cRGD
GACRGDCLGAPH JapãonenhumEspecificação: Oligopeptídeo
Abreviatura: FN1
KGGAVTGRGDSPASSPH JapãonenhumEspecificação: Oligopeptídeo
Abreviatura: CS1
EILDVPSTPH JapãonenhumEspecificação: Oligopeptídeo
Abreviatura: VN1
KGGPQVTRGDVFTMPPH JapãonenhumEspecificação: Oligopeptídeo
Abreviatura: HBP1
GKKQRFRHRNRKGPH JapãonenhumEspecificação: Oligopeptídeo
Abreviatura: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKGPH JapãonenhumEspecificação: Oligopeptídeo
Abreviatura: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMPPH JapãonenhumEspecificação: Oligopeptídeo
Abreviatura: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMPPH JapãonenhumEspecificação: Matriz extracelular
Abreviatura: rVN
VitronectinaThermo Fisher scientificA14700Especificação: Matriz extracelular
Abreviatura: FN
FibronectinaSigma-AldrichF2006Especificação: Material de revestimento comercialmente disponível
Abreviatura: Synthemax II
Synthemax IICorning3535Especificação: Polímero
Polivinilálcool-ácido co-itacônicoJapão VAM & PovalAF-17Especificação:
GlutaraldeídoSigma-AldrichG5882Especificação: Químico
Na2SO4Sigma-Aldrich239313Especificação: Químico
H2SO4Sigma-Aldrich339741Especificação: Química
Abreviatura: EDC
N-(3-Dimetilaminopropil) -N'-etilcarbodiimida cloridratoSigma-AldrichE7750Especificação: Químico < br / > Abreviatura: NHS
N-hidroxisuccinimidaSigma-Aldrich56480Especificação:
ParaformaldeídoSigma-AldrichP6148Especificação: Químico
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Especificação: Consumível de cultura de células
Raspador de célulasCorning3008Especificação: Consumível de cultura de células
Dispase IISigma-AldrichSI-D4693Especificação: Meio de cultura de células
Essential 6Thermo Fisherscientific A1516401Especificação: Meio de cultura de células
Essential 8Thermo Fisher scientificA1517001Especificação: Meio de cultura celular
DMEM/F12Thermo Fisher scientific11330-032Especificação: Meio de cultura celular
DMEMThermo Fisher scientific12800-017Especificação: Meio de cultura celular
MCDB 201Sigma-AldrichM6770Especificação: Célula ES
Célula ES humanaWiCell Research Institute, Inc..WA09Especificação: célula iPS
Célula iPS humanaRiken Cell BankHS0077Especificação: 35 mm
Abreviatura:
Placa TCP TCPCorning353001Especificação: 60 mm
Abreviatura: Placa TCP
TCP Corning353002Especificação: Prato de 24 poços
Prato de 24 poçosCorning353047Especificação: Bloqueio agente
Albumina de soro bovinoSigma-AldrichA8806Especificação: Reagente de detecção
Fosfatase alcalina mancha vivaThermo Fisher científicoA14353Especificação: Reagente de detecção
Hematoxilina e eosinaSigma-Aldrich1.05175Especificação: Prato de formação EB
6 poços ultrabaixo prato de fixaçãoCorning3471Especificação: Material de revestimento
gelatinaSigma-AldrichG9391Especificação: Material de revestimento
MatrigelCorning354230Especificação: Camundongos
Camundongos NOD-SCIDApplied Research LaboratoriesNenhumEspecificação: Soro
Fetal bovinoBiological Industries04-001-1AEspecificação: Antibiótico
antibiótico antimicóticoThermo Fisher scientific15240-062Especificação: Anticorpo
Anticorpo para NanogInvitrogenMA1-017Especificação: Anticorpo Anticorpo
para SSEA4Abcamab16287Especificação: Anticorpo Anticorpo
para OCT3/4InvitrogenPA5-27438Especificação: Anticorpo Anticorpo
para Sox2Invitrogen48-1400Especificação: Anticorpo
Anticorpo para Músculo Liso ActinInvitrogenPA5-19465Especificação: Anticorpo Anticorpo
para AFPInvitrogenPA5-21004Especificação: Anticorpo
Anticorpo GFAPInvitrogenMA5-15086Especificação: Anticorpo
Alexa Fluor 555 - anticorpo conjugado para cabra anti-ratoInvitrogenA-21422Especificação: Anticorpo
Alexa Fluor 488 - anticorpo conjugado anti-coelho de cabraInvitrogenA-11008Especificação: Anticorpo
Químico Químico National

Referências

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