Artigo de método

Iluminando os caminhos para a ativação de Caspase usando fluorescência Bimolecular complementação

DOI:

10.3791/57316

⸱

5 de março de 2018

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Baylor College of Medicine, 2Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology and Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve caspase Bimolecular complementação de fluorescência (BiFC); um método baseado em imagens que pode ser usado para visualizar induzida proximidade das caspases de iniciador, que é o primeiro passo para sua ativação.

Resumo

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A família de caspase de proteases desempenham um papel essencial na apoptose e imunidade inata. Entre estes, um subgrupo conhecido como iniciador caspases são os primeiros a ser ativado nestes caminhos. Este grupo inclui caspase-2, -8 e -9, bem como as caspases inflamatórias, caspase-1, -4 e -5. As caspases iniciador são todos ativadas por dimerização seguir ao recrutamento de complexos Multiproteicos específicos, chamados de plataformas de ativação. Complementação de fluorescência caspase Bimolecular (BiFC) é uma abordagem baseada em imagem onde dividir proteínas fluorescentes fundidas ao iniciador caspases são usadas para visualizar o recrutamento das caspases iniciador de suas plataformas de ativação e o resultante induzida por proximidade. Esta fluorescência fornece uma leitura de um dos primeiros passos necessários para a ativação de caspase iniciador. Usando um número de diferentes abordagens baseadas em microscopia, esta técnica pode fornecer dados quantitativos sobre a eficiência da ativação de caspase em um nível de população, bem como a cinética de ativação de caspase e o tamanho e o número de ativação de caspase complexos em uma base por célula.

Introdução

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A família de protease caspase é conhecida por seus papéis críticos na apoptose e imunidade inata 1. Por causa de sua importância, determinar quando, onde e quanto à eficácia das caspases específicas são ativadas podem fornecer insights cruciais sobre os mecanismos de caspase vias de ativação. O protocolo baseado em imagem descrito aqui permite a visualização dos primeiros passos para a cascata de ativação de caspase. Esta técnica tira proveito das interações da proteína: proteína dinâmica ativação de caspase naquela unidade.

As caspases podem ser divididas em dois grupos: as caspases de iniciador (caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12) e as carrasco caspases (caspase-3, -6 e -7). As caspases carrasco estão presentes na célula como dímeros pré-formadas e são ativadas por clivagem entre os grandes e pequenos subunidade 2. Quando ativado, eles cleave inúmeras proteínas estruturais e reguladoras, resultando em apoptose 3. As iniciador caspases são as caspases primeiras para ser ativado em uma via e geralmente acionar a ativação das caspases carrasco. Em contraste com o carrasco caspases, iniciador caspases são ativadas por dimerização 4,5. Este dimerização é facilitada pelo recrutamento de monômeros inativos para complexos de peso molecular grande específico conhecidos como plataformas de ativação. Montagem de plataformas de ativação é regida por uma série de interações da proteína: proteína específica. Estas são mediadas por motivos de interação de proteínas conservadas presentes no proform de caspase o iniciador e incluem o domínio da morte (DD), domínio effector da morte (DED) e de domínio (cartão) de recrutamento de caspase 6 (figura 1A). Plataformas de ativação incluem geralmente uma proteína do receptor e uma proteína do adaptador. O receptor é normalmente ativado mediante a ligação de um ligante, induzindo uma mudança conformacional que permite a oligomerização de numerosas moléculas. O receptor então também recruta a caspase diretamente ou moléculas do adaptador que por sua vez, trazem a caspase ao complexo. Assim, numerosas moléculas de caspase entram em proximidade que permite dimerização. Isso é conhecido como o modelo de proximidade induzida por 7. Uma vez dimerized, a caspase sofre de autoprocessamento, que serve para estabilizar a enzima activa 4,8. Por exemplo, montagem do apoptossomo Apaf1 é acionada pelo citocromo c após sua libertação da mitocôndria em um processo chamado de permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP). Apaf1, por sua vez, recruta caspase-9, através de uma interação que é mediada por um cartão presente em ambas as proteínas 9. Semelhante resultado de interações proteína na Assembleia da CD95 morte induzindo sinalização complexo (disco) que leva à ativação de caspase-8; o PIDDosome, que pode ativar caspase-2; e vários inflammasome complexos que iniciam a ativação de caspase-1 10,11,12. Assim, iniciador caspases são recrutadas para plataformas específicas de ativação através de um mecanismo comum, resultando em proximidade induzida e dimerização, sem a qual não ocorrerá ativação.

Complementação de fluorescência caspase Bimolecular (BiFC) é um ensaio baseado em imagens que foi desenvolvido para medir este primeiro passo na ativação das caspases de iniciador, permitindo a visualização direta da proximidade de caspase induzido após a plataforma de ativação montagem. Este método aproveita-se das propriedades da proteína fluorescente divisão Venus. Vênus é um mais brilhante e mais fotoestável versão de proteína fluorescente amarela (YFP) que pode ser separada em dois fragmentos não-fluorescente e ligeiramente sobrepostos: N-terminal de Vênus (Venus N ou VN) e o C-terminal de Vênus (Venus C ou VC). Estes fragmentos mantêm a capacidade de redobrar e tornar-se fluorescente quando na proximidade de 13. Cada fragmento de Vênus é fundido para o prodomínio da caspase, que é a porção mínima da caspase que vincula-se à plataforma de ativação. Isso garante que as caspases não reter a atividade enzimática e, portanto, a análise simultânea de jusante eventos associados a eventos endógenos é possível. A Vênus de fragmentos redobrar quando os prodomains de caspase são recrutados para a plataforma de ativação e passam por proximidade induzida. (Figura 1B). A fluorescência de Venus resultante pode ser usada com precisão e especificamente monitorar a Localização subcellular, a cinética e a eficiência do conjunto de plataformas de ativação de caspase iniciador em células únicas. Dados de imagem podem ser adquirido por microscopia confocal ou por microscopia de fluorescência padrão e pode ser adaptado para uma série de abordagens diferentes microscopia incluindo: imagem de lapso de tempo para controlar a ativação de caspase em tempo real; imagem de alta resolução para determinações precisas de Localização subcellular; e ponto final quantificação da eficiência de ativação.

Esta técnica foi desenvolvida para investigar a ativação de caspase-214. Enquanto a plataforma de ativação de caspase-2 é pensada para ser o PIDDosome, que consiste do receptor PIDD (proteína p53-induzido com um domínio de morte) e o adaptador RAIDD (RIP-associado ICH-1/CAD-3 proteínas homólogas com um domínio de morte), Ativação de caspase-2 independente de PIDDosome tem sido relatada. Isto sugere que plataformas adicionais de ativação de caspase-2 existem 15,16. Apesar de não saber os componentes completo da plataforma de ativação de caspase-2, permitiu-se a caspase BiFC técnica para interrogatório bem sucedido das vias sinalização caspase-2 para o nível molecular 14,17. Adaptámos também com êxito este protocolo para as caspases inflamatórias (caspase-1, -4, -5 e -12) 18 e, em princípio, a mesma abordagem deve ser suficiente para da mesma forma, analisar cada uma das caspases restantes do iniciador. Este protocolo da mesma forma pode ser adaptado investigar outros caminhos foram dimerização é um grande sinal de ativação. Por exemplo, as proteínas STAT são ativadas por dimerização após fosforilação por Janus quinase (JAK) 19. Assim, o sistema de BiFC pode ser usado para visualizar para ativação STAT, bem como muitas outras vias reguladas por interações proteína dinâmico. O seguinte protocolo fornece instruções passo a passo para a introdução dos repórteres em células, bem como as metodologias de análise e aquisição de imagem.

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Protocolo

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1. preparação de células e pratos da cultura

Nota: Execute os passos 1-3 em uma capa de fluxo laminar de cultura de tecidos. Use luvas.

  1. Se utilizar pratos de vidro inferior, cubra o vidro com fibronectina. Ignorar a etapa 1.2 se usando pratos de plástico.
    1. Fazer uma solução de 0,1 mg/mL de fibronectina: diluir 1 mL da solução de fibronectina 1 mg/mL em 9 mL de 1X PBS.
    2. Cubra o fundo de vidro de cada poço com 0,5-1 mL de fibronectina e incube por 15 min à temperatura ambiente.
    3. Utilizando uma pipeta, recolher a solução de fibronectina e armazenar a 4 ° C.
      Nota: A solução de fibronectina pode ser reutilizada várias vezes.
    4. Lave o vidro uma vez com 1-2 mL 1X PBS e aspire o PBS.
  2. Placa 1 x 105 células por poço de uma placa de 6 em 2 mL dos meios de cultura de célula apropriada (ver tabela 1 para números de celular para usar para poços de tamanhos diferentes). Se usando uma linha celular que expressa estàvel os caspase BiFC componentes (ver discussão), placa de 2 x 105 células e prossiga para a etapa de tratamento (etapa 3).
  3. Permitir que as células aderir ao prato durante a noite a 37 ° C, em uma incubadora de cultura de tecidos.

2. transfecção de células para introduzir os caspase BiFC componentes

  1. Transfect células com o reagente de transfeccao apropriado.
    Nota: Este protocolo descreve as instruções para Lipofectamine 2000, que foi otimizado para toxicidade mínima. Este protocolo tem sido usado com sucesso em células Hela, células MCF7 e células LN18. Se usar adicionais reagentes de transfecção sigam as instruções do fabricante e otimizar conforme necessário.
    1. Adicione 12 µ l de reagente de Transfeccao para 750 µ l de mídia reduzida de soro em um tubo estéril.
    2. Incube a temperatura ambiente por 5 min.
    3. Adicionar 10 ng de um plasmídeo do repórter (um plasmídeo codificação de uma proteína fluorescente, por exemplo, vermelho proteína fluorescente [RFP], que irá rotular as células transfectadas) para um tubo estéril de 1,5 mL para cada poço a transfected.
    4. Adicionar 20 ng de cada caspase BiFC plasmídeo (por exemplo, 20 ng de caspase-2 prodomínio [C2 Pro]-VC e 20 ng de C2 Pro-VN) para cada tubo (tabela 2).
    5. Trazer cada tubo até um volume total de 100 µ l adicionando mídia soro reduzida.
    6. Usando uma pipeta p200, adicione 100 µ l de solução de reagente de Transfeccao de passo 2.1.2 para a mistura de plasmídeo de forma gota a gota.
    7. Incube a mistura de reagente de transfeccao Plasmideo por 20 min em temperatura ambiente.
    8. Aspire os meios de comunicação das células com uma pipeta ou com sucção e em seguida, usando uma pipeta p1000, pipetar 800 µ l de meios livres de soro delicadamente para baixo do lado do bem.
    9. Usando uma pipeta p200, adicione 200 µ l do complexo DNA-lipídico gota a gota a cada poço.
    10. Incube as células em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ° C por 3 h.
    11. Tomando cuidado para não perturbar a monocamada, remover os meios livres de soro contendo os complexos lipídios-DNA por aspiração usando sucção ou de uma pipeta.
    12. Pipete 2 mL do meio de crescimento completo pré-aquecido (37 ° C) suavemente para o lado de cada poço.
  2. Incube as células a 37 ° C por 24-48 h para a expressão da proteína ideal numa incubadora de cultura de tecidos.

3. indução de ativação de caspase

  1. Tratar com uma droga ou estímulo que induz a caspase ativação aproximadamente 24 h pós-do transfection.
    1. Adicionar a concentração desejada do fármaco para pré aquecido (37 ° C) de imagem media (mídia de crescimento completo suplementada com Hepes [20 mM, pH 7,2-7,5] e 2-Mercaptoetanol [55 µM]) e misture delicadamente (tabela 3).
    2. Aspirar os meios de comunicação das células com uma pipeta ou com sucção e em seguida, usando uma pipeta, Pipetar 2 mL da solução de 3.1.1 suavemente para o lado do bem.
    3. Adicione imagem de mídia sem a droga a um bem como um controle não tratado.
  2. Incubar as células em uma cultura de tecidos de incubadora a 37 ° C ou prossiga para o passo 4.3 para um experimento de lapso de tempo.

4.. Aquisição de dados de Caspase BiFC

  1. Caspase BiFC para aquisição de ponto único tempo
    1. Liga o microscópio e a fonte de luz fluorescente, seguindo as instruções do fabricante.
    2. Encontre as células sob o filtro RFP e focar a fluorescência do gene repórter.
    3. Usando um contador mão-contagem, conte todas as células de RFP-positivo no campo visual. O número de registro.
    4. Mantendo o mesmo campo visual, alterne para o GFP (ou um filtro YFP se estiver disponível) e, usando um contador mão-contagem, contar o número de células vermelhas que também são verdes (Venus-positivo). Alterne entre os dois filtros para garantir que apenas os eritrócitos são avaliados para Venus-positividade. Registre o número (Figura 3).
    5. Conte pelo menos 100 células de RFP-positivo de cada uma das três áreas individuais da placa.
    6. Em cada área, calcule a porcentagem de células transfectada Venus-positivo (ou seja, eritrócitos que também são verdes). Média as percentagens resultantes para obter o desvio padrão.
  2. Geração de imagens tridimensional de caspase BiFC
    1. Ligue o microscópio seguindo as instruções do fabricante e lançar o software de aquisição.
    2. Selecione o x 60 ou objectivo de óleo x 63 e coloque uma gota de óleo sobre o objetivo
    3. Coloque o prato de cultura no palco microscópio usando o suporte de placa correta.
    4. Usando uma fonte de luz de epifluorescência e a parte do olho de microscópio ou o laser confocal e tela do computador, navegue até um campo de interesse.
    5. Focar a fluorescência de repórter usando o laser RFP ou filtro.
    6. Se epifluorescência tem sido utilizada até este ponto, mudar a fonte de luz para o laser confocal e visualizar a imagem ao vivo das células como adquirida pela câmera e exibido pelo software de aquisição na tela do computador.
    7. Usando o controle de joystick e a roda de foco, ajuste o foco e a posição das células para que as células estão no centro do visor. Escolha as células que são separadas uns dos outros e não se sobrepõem.
    8. Entrada a potência do laser de porcentagem para 50% e o tempo de exposição a 100 ms para Venus e RFP como ponto de partida para determinar as configurações ideais para usar para o experimento.
    9. Ligue a captura ao vivo e inspecionar a imagem resultante e os histogramas de exibição acompanhamento para ambos os canais.
    10. Se o sinal é baixo e a imagem é difícil de decifrar, aumente o tempo percentual de potência e/ou exposição de laser em incrementos até que o sinal na imagem parece ser bom.
    11. Certifique-se de que o sinal não chega saturação. Inspecione o histograma de exibição para certificar-se de que um pico distinto é visível para cada fluor. Se o pico engloba a exibição de histograma inteiro, entrada do laser poder e exposição ajustes inferiores (Figura 2).
    12. Visualize as células de controle (não tratada ou não-transfectadas) sob as mesmas condições para garantir que o sinal é específico.
      Nota: Única cor transfectants também pode ser usado para controle de crossover, mas se os sinais são espacialmente distintas (por exemplo, mitocondrial contra citosólico) isso não é necessário.
    13. Selecione ou abra o módulo de pilha de Z no software do microscópio.
    14. Usando o botão de foco, aproximado posição focal correspondente ao centro da célula.
    15. Ajuste o foco em uma direção, até que a célula não é mais visível, selecione essa opção como a primeira posição.
    16. Ajuste o foco na direção oposta até a célula novamente não é mais visível e selecionar esta opção como a posição inferior.
    17. Escolha o tamanho de passo ótimo (geralmente cerca de 20 µm) e iniciar a aquisição para instruir a câmera para tirar automaticamente uma única imagem em cada canal em cada uma das 20 etapas µm entre as posições superior e inferior.
    18. Use o software de renderização 3D para reconstruir a imagem 3D (Figura 4filme 1).
  3. Imagem de lapso de tempo de caspase BiFC
    1. Pelo menos 1 h antes do experimento, ligue o microscópio e seleccionar a temperatura de 37 ° c.
    2. Selecione o x 40, 60 x ou objectivo de óleo x 63 e coloque uma gota de óleo sobre o objetivo.
    3. Coloque o prato de cultura no palco microscópio usando o suporte de placa correta.
    4. Se uma fonte de2 CO está disponível, coloque o dispositivo de entrega do CO2 (normalmente uma tampa de plexiglass ligada ao tubo que entrega o CO2) em cima do suporte da placa. Definir o CO2 nível de 5% e ligar o CO2 controlador de dentro do software. Se não houver uma fonte de2 CO, incluem 20 mM Hepes para tamponar a mídia.
    5. Navegue até um campo de células transfectadas e visualizar a imagem ao vivo das células como exibido pelo software de aquisição na tela do computador usando o laser RFP e adquirida pela câmera.
    6. Seguindo os passos 4.2.8-4.2.12, entrada as configurações para porcentagem do laser poder e tempo de exposicao do laser de RFP. Manter estes valores tão baixos quanto possível e ainda ser capaz de detectar o sinal fluorescente.
    7. Usando um controle positivo da amostra (ver tabela 3 para obter exemplos), siga passos 4.2.8-4.2.12 para as configurações de entrada para porcentagem do laser poder e tempo de exposicao para a luz de laser YFP. Manter estes valores tão baixos quanto possível enquanto ainda é capaz de detectar o sinal de Venus.
    8. Para cada poço da placa, escolha um número de posições diferentes que contêm uma ou mais células expressando o repórter.
    9. O intervalo de tempo entre cada quadro do lapso de tempo e total número de quadros a serem tomadas de entrada. Verifique se há tempo para adquirir todas as posições selecionadas antes que o próximo quadro é para ser tomado.
    10. Re-visitar cada posição e corrigir e atualizar o foco conforme necessário.
    11. Para corrigir para drift focal que pode resultar de mudanças de temperatura ou vibrações externas, ligue o sistema de correção de desvio de foco (se disponível).
    12. Começar o lapso de tempo e salvar os dados.
    13. Analise os dados usando o software de imagem disponível (Figura 5filme 2).

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Resultados

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Um exemplo de caspase-2 BiFC induzida por dano do ADN é mostrado na Figura 3. Camptothecin, uma topoisomerase eu inibidor, foi usado para induzir danos e caspase-2 ativação do DNA. O mCherry da proteína fluorescente vermelha foi usado como um repórter para mostrar que as células expressam a sonda BiFC e para ajudar a visualizar o número total de células. Fluorescência de Vênus é mostrada em verde e a grande partitura representam caspase-2 induzido por proximi...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo discute o uso de proteínas fluorescentes divisão para medir caspase induzida por proximidade. Split Vênus foi escolhida para esta técnica, porque é muito brilhante, altamente fotoestável e a dobrar é rápido 13. Assim, a análise de Vênus dobrar sobre proximidade de caspase induzida pode fornecer perto estimativas em tempo real da dinâmica de interação de proteínas caspase. Vênus é dividida em dois fragmentos ligeiramente sobrepostos, o N-terminal de Vênus (Venus-N ou VN) composto por...

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Divulgações

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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós gostaríamos de reconhecer todos os membros anteriores do laboratório Bouchier-Hayes que contribuíram para o desenvolvimento desta técnica. Este trabalho foi financiado em parte pelo prêmio de piloto pediátrica Hospital infantil do Texas a LBH. Agradecemos Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) permissão para incluir dados publicados em colaboração com a equipe dela. O desenvolvimento dos reagentes descrito foi apoiado pela citometria e núcleo de classificação de célula no Baylor College of Medicine com financiamento do NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 e NCRR S10RR024574) e a assistência de Joel M. Sederstrom

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pratos de fundo de vidro de 6 poços não revestidos nº 1,5 20 mmMattekP06G-1.5-20-F
Proteína purificada de fibronectina plasmática humanaMilliporeFC010-10MG
DPBSSigmaD8537-6x500ML
Lipofectamine 2000 reagenteInvitrogen11668019
OPTI MEM IInvitrogen31985088
Plasmídeo C2-Pro VCAddgene49261
Plasmídeo C2-Pro VNAddgene49262
BiFC de caspase inflamatóriadisponíveis mediante solicitação de
células LBH HeLa expressando de forma estável os componentesdisponíveis mediante solicitação do plasmídeo LBH
DsRed mitoClontech632421plasmídeos semelhantes que podem ser usados como repórteres fluorescentes podem ser encontrados em Addgene
HEPESInvitrogen15630106
2 Mercaptoethanol 1000XInvitrogen21985023
q-VD-OPHApex BioA1901
Plasmídeos C2-Pro BiFC

Referências

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