Adaptação 3' rápida amplificação do CDNA termina para mapear transcritos em câncer

Summary

A amplificação rápida dois diferentes 3' extremidades do cDNA (3' corrida) protocolos descrito aqui fazem uso de dois diferentes polimerases de DNA para mapear sequências que incluem um segmento de quadro de leitura aberta (ORF), o códon de parada e o inteiro 3' UTR de uma transcrição de usando o RNA obtidos de linhagens celulares de cancro diferentes.

Abstract

Maturação dos mRNAs eucarióticos envolve 3' formação de ponta, que envolve a adição de uma cauda poli (a). A fim de mapear a extremidade 3' de um gene, o tradicional método de escolha é 3' amplificação rápida das extremidades do cDNA (3' corrida). Protocolos para 3' corrida requerem o design cuidadoso e seleção de primers aninhadas dentro da região 3' untranslated (3' UTR) do gene alvo de interesse. No entanto, com algumas modificações, o protocolo pode ser usado para incluir o inteiro 3' UTR e sequências dentro do quadro de leitura aberta (ORF), fornecendo uma imagem mais abrangente da relação entre a ORF e a 3' UTR. Isto está além da identificação do sinal de poliadenilação (PAS), assim como o decote e poliadenilação site fornecido pelo convencional 3' corrida. Expandida de 3' corrida pode detectar incomum 3' UTRs, incluindo fusões gene dentro a 3' UTR, e as informações de sequência podem ser usadas para prever potenciais locais obrigatórios de miRNA, bem como AU rico desestabilizando a elementos que possam afectar a estabilidade da transcrição.

Introduction

A formação da extremidade 3' é um passo crítico na maturação do mRNA que compreende a clivagem do pre-mRNA a jusante de um PAS, seguido pela adição de 250 ~ untemplated adenines, que formam a cauda de poli^1,2. Proteína de ligação a poli (PABP) vincula-se à cauda poli (a), e isso protege a transcrição do mRNA de degradação e facilita a tradução¹.

As estimativas atuais sugerem que 70% dos genes humanos têm Passe múltiplo e, portanto, submeter-se poliadenilação alternativa, resultando em múltiplos 3' extremidades³. Assim, é importante ide....

Protocol

Vestir um jaleco, luvas e óculos de segurança em todos os momentos durante a execução de todos os procedimentos no presente protocolo. Certifique-se que recipientes/tubos contendo o reagente de isotiocianato de fenol e guanidina só são abertos em um capuz certificada e descarte de resíduos de fenol em um recipiente designado. Use os reagentes, dicas e tubos estéreis DNAse/RNAse-livre.

1. cultura de pilha

1. Crescer a linhagem de células HeLa e dois suspensão manto linfoma célula linhas celulares, Granta-519 e Jeko-1, em DMEM contendo 10% FBS e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina em uma incubadora umidificada com 5% CO₂ a....

Results

Pesquisa de Primer frente aninhados:

O gel de agarose de A Figura 1 mostra dois produtos distintos de gel PCR (faixas 1 e 2) que uso o mesmo encaminhar a cartilha mas diferentes cartilhas reversos. 3 Lane tem um produto PCR distinto e tem uma distinta cartilha frente e verso. Os primers ideais para usar para a reação de PCR com base são aqueles que dão um produto PCR distinto (faixa 3).......

Discussion

Apesar do advento das tecnologias de sequenciação paralelo maciço, numa base de gene-gene-por, 3' corrida continua a ser o método mais fácil e mais econômico para identificar o PAS e nucleotídeos adjacentes à cauda poli (a). A adaptação descrita aqui expande usando 3' corrida para amplificar e mapear sequências que incluem uma parte da ORF, o códon de parada e o inteiro 3' UTR a transcrição do mRNA de ANKHD1 . Uma grande vantagem do 3' corrida é que, com algumas adaptações menores, produtos de 3' corrida podem s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Células HeLa	ATCC	CCL-2	Linha celular de câncer cervical.
Células Jeko-1	ATCC	CRL-3006	Linha celular de linfoma de células do manto.
Células Granta-519	DSMZ	ACC-342	Linha celular de linfoma de células do manto.
Soro bovino fetal	Sigma Aldrich	F6178	Soro bovino fetal para cultura de células.
Penicilina/Estreptomicina	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiótico e antimicótico.
Coprecipitante	GlycoBlue		Ambion AM9545
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	meios de cultura celular da marca Gibco com GlutaMAX.
Água livre de nuclease	ThermoFisherScientific	AM9938	Água livre de Ambion DNase e RNAse (não tratada com DEPC).
Dulbecco' s Solução tamponada com fosfato	Corning	21-030	1X PBS.
Clorofórmio	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagente Álcool	Sigma Aldrich	793175
Etanol Solução de Brometo de Etídio	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol	Reagente ThermoFisherScientific	15596026	Reagente monofásico de fenol e isotiocianato de guanidina.
2X Extensor PCR-para-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-para-Gel Master Mix  contendo corante de carregamento usado em ensaios de PCR rápidos de rotina e busca de primer.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase DNase	livre Promega	M6101	Dnase kit de tratamento.
Corante de Carregamento de Gel Laranja (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix com tampão HF	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix contendo uma DNA polimerase quimérica consistindo de um domínio de ligação ao DNA fundido a uma polimerase de revisão semelhante a Pyrococcus e outros reagentes.
PfuUltra II Fusion HS DNA polimerase	Agilent Technologies	600670	DNA polimerase modificada de Pyrococcus furiosus (Pfu).
Kit de Transcrição Reversa RevertAid RT	Thermo Fischer	K1691	Usado para  transcrição reversa de mRNA em  síntese de cDNA. O kit inclui  Inibidor de RNAse Ribolock, transcriptase reversa RevertAid M-MuLV e outros reagentes listados no manuscrito.
Escada perfeita de tamanho 1Kb	5 Prime	2500360	Escada de DNA de peso molecular.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Usado para visualizar o gel de agarose corado com brometo de etídio.
Escada de baixo peso molecular	New England BioLabs	N3233L	Escada de DNA de peso molecular.
Misturador de Vórtice	MidSci	VM-3200
Mini Centrífuga	MidSci	C1008-R
Banho Seco	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Espectrofotômetro.
Mini-Sub-Sub Largo Sistema de eletroforese horizontal Cell GT	BioRad	1704469	Equipamento-aparelho de eletroforese para configurar a
fonte de alimentação básica de gel PowerPac	BioRad	1645050	para eletroforese em gel.
Termociclador	Aependorf	950000015	Gradiente
AGLE-500		Agarose	Dot Scientific
Centrífuga	Eppendorf	5810 R
Centrífuga	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel e Fragmento de PCR Sistema de Limpeza de DNA	Promega	A9281
Kit de Clonagem de PCR TOPO Zero Blunt, com One Shot  TOP10 Células de E. coli quimicamente competentes	ThermoFisherScientific	K280020
Estação de preparação MyPCR Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Capuz dedicado ao trabalho de PCR.
Hotte Hamilton SafeAire II	ThermoFisherScientific		Exaustor.
Beckman Coulter Z1  Partícula  Contador	Beckman Coulter	6605698	Contador de partículas. Para contar células antes do revestimento  para extração de RNA.
Software de scanner de sequência da Applied Biosystems v2.0	Applied Biosystems (através da ThermoFisherScientific)		Software para analisar dados de sequenciamento de Sanger.