Titulação ELISA como um método para determinar a constante de dissociação de interação do ligante do Receptor

Resumo

Um protocolo detalhado para executar uma titulação ELISA é descrito. Além disso, um algoritmo de romance é apresentado para avaliar a titulação ELISAs e obter uma constante de dissociação de ligação de um ligante solúvel a um receptor de imobilizado-placa de microtitulação.

Resumo

A constante de dissociação descreve a interação entre os dois parceiros em equilíbrio a ligação e é uma medida de sua afinidade. É um parâmetro fundamental para comparar diferentes ligantes, por exemplo, inibidores do competidor, isoformas de proteínas e mutantes, para sua força de ligação a um parceiro de vinculação. Constantes de dissociação são determinados pela plotagem concentrações de limite contra o ligante livre como curvas de ligação. Em contraste, curvas de titulação, em que um sinal que é proporcional à concentração de ligante ligado é plotado contra a concentração total de ligante adicionado, são mais fáceis de gravar. O sinal pode ser detectado espectroscopicamente e por ensaio imunoenzimático (ELISA). Isto é exemplificado em um protocolo para uma titulação ELISA que mede a ligação do rhodocetin derivado de veneno de cobra para seu domínio alvo imobilizado da integrina α2β1. Titulação ELISAs são versáteis e amplamente utilizado. Qualquer par de interação de proteínas pode ser usado como receptor de imobilizado e solúvel ligante, desde que ambas as proteínas são puras, e as respectivas concentrações são conhecidas. Até agora, a dificuldade tem sido determinar a constante de dissociação de uma curva de titulação. Neste estudo, é introduzida uma função matemática subjacente de curvas de titulação. Sem qualquer estimativa propenso gráfica de um rendimento de saturação, este algoritmo permite o processamento dos dados brutos (intensidades de sinal em diferentes concentrações de ligante adicionado) diretamente pela avaliação matemática através de regressão não-linear. Assim, várias curvas de titulação podem ser gravadas simultaneamente e transformadas em um conjunto de parâmetros característicos, entre elas a constante de dissociação e a concentração de vinculação-ativo do receptor, e elas podem ser avaliadas estatisticamente. Quando combinado com este algoritmo, titulação ELISAs ganhar a vantagem de apresentar diretamente a constante de dissociação. Portanto, eles podem ser usados mais eficientemente no futuro.

Introdução

A constante de dissociação K é um parâmetro chave para descrever a afinidade de um receptor (R) para seu ligante (L). Com base na lei de ação das massas, K é definido para o equilíbrio, no qual a RL complexo ligante-receptor dissocia-se para o receptor R e o ligante l:

            Equação 1

com os índices f indicando o estado livre/desacoplado do receptor e ligante. A concentração do complexo receptor-ligante, RL, é idêntica à concentração do ligante do receptor-limite Lb. C....

Protocolo

1. as soluções

1. Para preparar 100 mL de 10 x TBS solução de pH 7,4, dissolver 6,06 g de TRIS e 8,77 g de NaCl em 90 mL de água desionizada, ajustar o pH para 7,4 com solução de HCl 37%, preencher o volume a 100 mL com água desionizada e filtrar a solução.
2. Para preparar 100 mL de 1 M HEPES/NaOH, solução de pH 7,4, dissolver 23,83 g de HEPES em 90 mL de água desionizada, ajustar o pH para 7,4 com 1,5 M de NaOH, preencher o volume a 100 mL com água desionizada e filtrar a solução.
3. Para preparar 100 mL de solução de NaCl 5m, dissolva 29,2 g de NaCl em 90 mL de água desionizada. Preencher o volume a 100 mL com água desionizada e filtrar a soluç....

Resultados

Após o ELISA foi desenvolvido, a cor amarela do substrato convertidos da fosfatase alcalina, pará- nitrophenolate, indica que a quantidade de ligante rhodocetin limite diminui com diminuindo as concentrações de rhodocetin adicionado de colunas de 1 a 11 (Figura 1). Os poços incolores nos poços rhodocetin-livre na coluna 12 mostram um sinal de baixo fundo.

Fotométrica quantificação em 405 nm.......

Discussão

A titulação de ELISA é um sistema versátil de teste para determinar a dissociação de uma interação receptor-ligante. Como a titulação ELISA contorna a necessidade de separar ligands livre e limite efetivamente e analisar as suas concentrações quantitativamente, substancialmente mais estudos e publicações têm empregado titulação ELISAs em vez de gravação curvas de ligação . Além disso, titulação ELISAs são fáceis de realizar e requerem quantidades razoavelmente baixas do receptor e ligante. Para uma análise precisa das co.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
TRIS	neoFrox	1125KG001
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
NaCl	Applichem	1.316.591.214
MgCl2	Merck	172571
integrin a2A, wild-type e mutante, recombinante		isolado no laboratório do autor
NiNTA superflow column	Qiagen, Alemanha	30821
Coomassie-Brilliant Blue R250	Serva	35050
ensaio de ácido bicinchônico (BCA), kit de determinação de concentração de proteína	Fisher Scientific	23225
albumina sérica bovina (BSA), fração V	Applichem	A1391
solução de 25% de glutaraldeído	Merck	354400
anticorpos imunoglobulina anti-coelho de cabra, conjugados com fosfatase alcalina	Sigma-Aldrich	A9919
Glicina	Applichem	A1377
acetato de Zn(II)	Applichem	A4324
NaOH	Applichem	A1551
Comprimido de substrato de fosfatase alcalina (5 mg)	Sigma-Aldrich	S0942
Costar placa de microtitre de meia área	Thermo Scientific	Corning 3690
tubos de reação micro	Eppendorf	30120086
Leitor de microplaca ELISA	BioTek	Synergy HT