Implantação de enxertos vasculares Electrospun com estrutura otimizada em um modelo do rato

Resumo

Aqui, apresentamos um método eletrofiação modificado para fabricar enxertos vasculares PCL com fibras grossas e poros dilatados e descrever um protocolo para avaliar o desempenho na vivo em um modelo do rato de substituição da aorta abdominal.

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar se enxerto vascular de PCL e descrever um protocolo de avaliação, usando um modelo do rato de substituição da aorta abdominal. Os enxertos vasculares electrospun muitas vezes possuem relativamente pequenos poros, que limitam a infiltração de células os enxertos e dificultam a regeneração e remodelação das artérias-neo. Neste estudo, enxertos vasculares PCL com fibras mais grossas (5-6 µm) e poros maiores (~ 30 µm) foram fabricados usando uma técnica de processamento modificado. O desempenho a longo prazo do enxerto foi avaliado pela implantação de um modelo de aorta abdominal de ratos. Análise de ultrassom mostrou que os enxertos permaneceram patentes sem aneurisma ou estenose ocorrendo mesmo após 12 meses da implantação. Estrutura se melhorou o crescimento celular e assim promovido o tecido regenerado em 3 meses. Mais importante, não havia nenhum sinal de remodelação adversos, tais como calcificação na parede do enxerto após 12 meses. Portanto, enxertos vasculares de electrospun PCL com modificados se processamento têm potenciais para ser um substituto de artéria para implantação de longo prazo.

Introdução

Enxertos vasculares feitos de polímeros sintéticos são amplamente utilizados na clínica para o tratamento de doenças cardiovasculares (doenças cardiovasculares). Infelizmente, no caso de enxertos vasculares de pequeno diâmetro (D < 6mm) não há nenhuma produtos de sucesso disponíveis devido a baixa permeabilidade desencadeada pela velocidade do fluxo de sangue reduzido, que muitas vezes leva a trombose, hiperplasia da íntima e outros complicações¹.

Engenharia de tecidos fornece uma estratégia alternativa para realizar a patência a longo prazo e homeostase baseado na reconstrução e regeneração vascular andaime-guiada. No detalhe, o enxerto vascular, como um modelo tridimensional, poderia fornecer suporte mecânico e orientação estrutural durante a regeneração do tecido vascular e influência funções celulares, incluindo a adesão celular, migração, proliferação, e secreção de matriz extracelular². Até agora, vários polímeros sintéticos foram avaliados para aplicações em engenharia de tecido vascular. Entre estes polímeros, poly(ε-caprolactone) (PCL) tem sido intensamente pesquisada devido à célula boa compatibilidade e degradação lenta que variam de vários meses a dois anos³. Em um rato aorta modelo^4,5,6, enxertos vasculares PCL, processados por eletrofiação exibiram excelente integridade estrutural e patência, invasão da célula, bem como continuamente aumentado e neovascularização na parede da prótese por até 6 meses. No entanto, remodela o tecido adverso, incluindo regressão de células e capilares e calcificação, também foram observados em momentos mais, acima de 18 meses.

Celularização da prótese vascular é um factor-chave determinando a regeneração do tecido e remodelando o⁷. Eletrofiação, como uma técnica versátil, tem sido amplamente empregada para a preparação de enxertos vasculares com estrutura fibrosa nano⁸. Infelizmente, a estrutura relativamente pequenos poros conduz frequentemente a infiltração de células insuficientes no enxerto vascular electrospun, que limita a regeneração do tecido subsequentes. Para resolver este problema, tem sido tentadas várias técnicas para aumentar o tamanho dos poros e porosidade total, incluindo o sal/polímero lixiviação^9,10, modificação do aparelho coletor, pós-tratamento por radiação laser¹¹ , etc. Na verdade, a estrutura dos enxertos de electrospun (incluindo o diâmetro da fibra, tamanho dos poros e porosidade) está intimamente relacionada com as condições de processamento de^12,13. Durante eletrofiação, o diâmetro da fibra pode ser facilmente controlado alterando os parâmetros, tais como a concentração da solução de polímero, vazão, tensão, etc. ^{14 , 15}, e portanto, o tamanho dos poros e porosidade foram aprimorados em conformidade.

Recentemente, informou um enxerto de electrospun PCL modificado com estrutura se (fibras com diâmetro de 5 a 7 µm e poros de 30-40 µm). Implantação in vivo , substituindo aorta abdominal de ratos mostrou alta taxa de patência, bem como a boa regeneração endotelização e músculo liso no pós-operatório de 3 meses¹⁶. Mais importante, não remodela o tecido adverso incluindo regressão calcificação e célula podia ser observada mesmo após um ano de implantação.

Protocolo

O uso de animais experimentais foi aprovado pela Animal experiências éticas Comitê de Nankai University e realizado em conformidade com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. fabricação de enxertos Electrospun PCL

Nota: Neste documento, uma técnica de eletrofiação foi utilizada para fabricar os enxertos vasculares.

1. Preparar soluções PCL de 25% em peso e 10% em peso, dissolvendo PCL em uma mistura de metanol e clorofórmio, respectivamente, (relação de volume de 1:5), à temperatura ambiente (RT) para 12 h.
2. Carrega a solução PCL em uma seringa de vidro de 10 mL.
3. Coloque a seringa com uma agulha 21-G.
4. Coloca o mandril de aço inoxidável (2 mm de diâmetro, 25 cm de comprimento) sobre o instrumento de coleta.
5. Para enxertos de fibra mais grossa, use a solução PCL de 25% em peso, a distância de trabalho de 17 cm da ponta da agulha para colecionador, taxa de fluxo de 8 mL/h e tensão de 11 kV como eletrofiação parâmetros. Para enxertos de diluente-fibra, use a solução PCL de 10% em peso, distância de trabalho de 20 cm da ponta da agulha para colecionador, uma taxa de fluxo de 2ml/h e a tensão de 18 kV como eletrofiação parâmetros.
6. Certifique-se que os enxertos obtidos são colocados no vácuo durante a noite para remover o solvente residual. Esterilizar todos os instrumentos antes do procedimento e manter técnica asséptica durante todo.
7. Antes da implantação, desinfecte os enxertos por imersão-los em 10 mL de etanol a 75% por 30 min e expô-los à luz UV durante a noite.
8. Medições de tamanho da fibra e dos poros: calcular o diâmetro da fibra média usando software ImageJ baseado na digitalização de imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV).
9. Teste mecânico de andaimes:
   1. Corte os andaimes tubulares em seções de 3 mm de comprimento, usando uma lâmina de barbear. Medir a espessura de andaimes usando um micrômetro.
   2. Coloque os andaimes tubulares em uma máquina de ensaio de tração com capacidade de carga de 100 N.
   3. Fixe os andaimes com uma distância de 1 mm grampo inter e puxar longitudinalmente a uma taxa de 10 mm/min até ruptura. Medir a resistência à tração e alongamento final na ruptura. Calcular o módulo de Young da região linear inicial (até 5% de tensão) da curva tensão-deformação.

2. modelo de implantação do rato Aorta Abdominal

Nota: Todos os materiais e instrumentos utilizados na cirurgia são estéreis. Durante a cirurgia, certifique-se que o operador usa uma máscara de gaze e luvas estéreis para evitar infecções. Assegure que a temperatura é mantida a 27-30 ° C para manter a temperatura do corpo animal. Siga orientações IACUC locais sobre analgesia.

1. Use ratos Sprague Dawley masculinos pesando 240-270 g como destinatários da prótese vascular. Certifique-se do que rato tem jejuado 24 h antes da cirurgia. O objectivo dos ratos jejum por 24 h é vazio as fezes no trato intestinal suficientemente, assim, ampliam o horizonte do operador.
2. Segure o pescoço costas do rato e mantenha sua cabeça para baixo, insira a agulha de springe na cavidade abdominal do abdômen inferior. Induzi o rato para anestesia com hidrato de cloral (330 mg/kg) por uma injeção intraperitoneal.
3. Confirme anesthetization adequada, garantindo que o rato tem relaxado os músculos e respiração firme. Coloque o rato sob o microscópio de operação na posição supina.
4. Aplica pomada de vaselina oftálmica veterinário sobre os olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia. Administre a anticoagulação (100 UI/kg) com fisiológico heparinizado (50 UI/mL) por injeção de veia cauda antes da cirurgia.
5. Raspar a pele na parede abdominal anterior usando uma lâmina de barbear e limpar a pele usando solução de iodo e de solução de álcool.
6. Realizar uma incisão laparotomia com tesoura cirúrgica e certifique-se de que a incisão é cerca de 4-5 cm de comprimento e em seguida expor a cavidade abdominal.
7. Retraia e enrole os intestinos com gaze umedecida com soro fisiológico, preferencialmente.
8. A aorta abdominal disse cuidadosamente.
9. Identificar e ligar todos os pequenos ramos usando suturas de nylon monofilamento 9-0.
10. Fixar a seção isolada (até 1 cm de comprimento) da aorta usando duas pinças vasculares. A aorta pode permanecer preso por 20-30 min.
11. Transecto a aorta abdominal entre duas pinças usando microtesoura para criar os sites anastomótica.
12. Lave as duas extremidades da aorta com solução salina heparinizada (50 UI/mL) para remover o sangue residual.
13. Descole a adventícia usando microtesoura.
14. Anastomose do enxerto com diâmetro interno de 2 mm e 1 cm de comprimento para a aorta abdominal de ratos com um padrão de sutura em forma de oito usando suturas de nylon monofilamento 9-0.
15. Em primeiro lugar, construir quatro anastomoses de acordo com a sequência de 3, 9, 12 e 06:00 posições no lado proximal e, em seguida, se anastomosam as bordas cortadas em 4 pontos entre duas suturas. Depois de terminar a sutura proximal, sutura do lado distal pelo mesmo método.
    Nota: Cada ponto é necessário para garantir que o lado nativo ligeiramente é incorporado no enxerto.
16. Remova a braçadeira distal para permitir que o sangue flua do enxerto e, em seguida, remova a braçadeira proximal.
17. Pressione as extremidades de sutura para parar o sangramento usando uma bola de algodão estéril ou uma pequena compressa de gaze. Pressione para cerca de 3 min, a hemostasia.
18. Retorne os intestinos na cavidade abdominal.
19. Lave a cavidade abdominal com soro fisiológico morno com gentamicina (320 U/mL).
20. Cosa a parede abdominal usando uma sutura de Nylon 3-0 na camada de músculo e pele, respectivamente.
21. Coloque o rato em uma gaiola limpa e seca e coloque uma almofada de aquecimento sob a gaiola para manter a temperatura do corpo animal; Então espere o rato para se recuperar da anestesia. Cuidar do animal até que ele recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
22. Depois de recuperar a consciência, coloque o rato em uma única gaiola com comida e água. Aplica iodo na ferida para prevenir a infecção após a cirurgia. Retorne o rato para a companhia de outros animais até que ele se recupere totalmente.
23. Eutanásia em ratos de acordo com as normas institucionais em pontos de tempo predeterminado.

Resultados

Os enxertos PCL foram explantados em 3 meses e 12 meses de pós-operatório e analisaram por técnicas histológicas padronizadas de hematoxilina e eosina (H & E), corante tricromo de Masson, Verhoeff-van Gieson (Wagner), Von Kossa e mancha para α-SMA, MYH, vWF e elastina. As imagens histológicas foram tiradas usando um microscópio na posição vertical, e as imagens de imunofluorescência foram tiradas usando um microscópio fluorescence.

Discussão

Infiltração de células é fundamental para a regeneração e remodelação do enxerto vascular na vivo¹⁶. Infiltração de célula limitada é muitas vezes relacionada com os poros relativamente pequenos do enxerto que dificultam a migração de células na parede da prótese. Para resolver esta dificuldade, desenvolvemos um método modificado para preparar enxertos vasculares de electrospun PCL com estrutura de poros grandes. No detalhe, o tamanho dos poros aumentou com o aumento da espessura da fibra...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pellets de poli (ε -caprolactona) (PCL) (M < sub > n < / sub> = 80.000)	Sigma	704067
Metanol	Tianjin Chemical Reagent Company	1060
Álcool	Tianjin Chemical Reagent Company	1083
Clorofórmio	Tianjin Chemical Reagent Company	A1007
Sacarose	Tianjin Fengchuan Empresa	2296
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
Ratos Sprague Dawley	Centro Animal de Laboratório da Academia de Ciências
Solução salina normal	Hebei Tiancheng Empresa
Hidrato de cloral	Tianjin Ruijinte empresa química	2223
Injeção de heparina sódica			Tianjin Biochem
Injeção de sulfato de gentamicina	Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company
Anticorpo primário anti-alfa-SMA de camundongo	Abcam	ab7817
Anticorpo primário anti-liso MYH de camundongo	Abcam ab683
Anticorpo policlonal de elastina de rato de coelho	Abcam ab23748
Anticorpo primário do fator anti-von Willebrand de coelho	Abcam	ab6994
IgG anti-camundongo de cabra (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150117
IgG anti-coelho de cabra (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150077
5% soro de cabra normal	Zhongshan Ponte dourada	ZLI9022
Hematoxilina e eosina (H & E)	Pequim leagene biotecnologia	DH0006
tricrômico de Masson	Pequim leagene biotecnologia	DC0032
Verhoeff-van Gieson (VVG)	Pequim leagene biotecnologia	DC0059
Von Kossa	Pequim leagene biotecnologia	DS0003
Agulhas de suturas cirúrgicas com fio, 3-0 seda	Xangai Jinhuan empresa de suprimentos médicos	G3002b
Agulhas de suturas cirúrgicas com fio, 9-0 seda	Shanghai Jinhuan empresa de suprimentos médicos	H901