Summary
En este artículo demostramos en proyección de imagen de gusanos individuales empleando un dispositivo de microfluidos personalizado. En el dispositivo, gusanos varios individualmente se limitan para separar compartimientos, lo que permite vigilancia longitudinal multiplexada de varios procesos biológicos.
Abstract
En la última década, microfluidos técnicas se han aplicado para el estudio de pequeños animales, tales como el nematodo Caenorhabditis elegansy han demostrado ser útiles como plataforma de proyección de imagen vivo conveniente proporciona capacidades para un control preciso de condiciones experimentales en tiempo real. En este artículo demostramos en proyección de imagen de gusanos individuales empleando WormSpa, un dispositivo de microfluidos personalizado publicado previamente. En el dispositivo, gusanos varios individualmente se limitan para separar compartimientos, lo que permite vigilancia longitudinal multiplexada de varios procesos biológicos. Para ilustrar la capacidad, se realizaron experimentos de prueba de principio en que gusanos estaban infectados en el dispositivo con bacterias patógenas, y la dinámica de la expresión de genes de respuesta inmune y la puesta de huevos fueron monitoreada continuamente en individuo animales. El diseño simple y la operación de este dispositivo hacen conveniente para los usuarios sin experiencia previa con experimentos basados en microfluidos. Proponemos que este enfoque sea útil para muchos investigadores interesados en observaciones longitudinales de los procesos biológicos en condiciones bien definidas.
Introduction
Cambios en las condiciones ambientales pueden conducir a la activación de programas genéticos acompañados de inducción y represión de la expresión de genes específicos1,2. Estos cambios cinéticos puede variar entre los tejidos en los mismos animales y entre diferentes animales. Estudios de los programas genéticos por lo tanto llaman a los métodos que permite la proyección de imagen longitudinal de los individuos y proporcionar control preciso de la dinámico de las condiciones ambientales.
En los últimos años se han utilizado dispositivos fluídicos recientemente para estudiar muchos aspectos de la respuesta y comportamiento en pequeños animales, incluyendo gusanos, moscas, osos de agua y3,más de4,5,6, 7. Las aplicaciones incluyen, por ejemplo, profundo phenotyping, optogenetic registro de la actividad neuronal en respuesta a estímulos químicos y el seguimiento de comportamientos motores como locomoción y bombeo8,9,10 , 11.
Enfoques basados en microfluidos sostener muchas propiedades que podrían beneficiar a la proyección de imagen longitudinal a largo plazo de respuesta a señales ambientales, incluyendo un control dinámico preciso del microambiente local, diseño flexible que permite el mantenimiento de animales individuales en cuartos separados y los atributos favorables para la proyección de imagen. Sin embargo, mantener los animales en una cámara de microfluidos durante mucho tiempo con el mínimo impacto adverso sobre los seres de bien es un desafío, que requiere particular cuidado en el diseño del dispositivo microfluídico, así como en la ejecución del experimento.
Aquí se demuestra el uso de WormSpa, un dispositivo de microfluidos para la proyección de imagen longitudinal de Caenorhabditis elegans. 5 gusanos individuales están confinados en las cámaras. Un flujo constante baja de la suspensión bacteriana y líquido garantiza que gusanos están bien alimentados y suficientemente activa para mantener una buena salud y aliviar el estrés, y la estructura de las cámaras permite gusanos que ponen huevos. La simplicidad del diseño y operación de WormSpa deben permitir a los investigadores sin experiencia previa en microfluídica para incorporar este dispositivo en sus propios planes de investigación.
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Protocol
El protocolo siguiente utiliza WormSpa5, un dispositivo de microfluidos descrito previamente para la proyección de imagen longitudinal de gusanos. Fabricación de WormSpa (a partir de archivos CAD que se pueden obtener de los autores a petición) es sencillo pero requiere algo de experiencia. En la mayoría de los casos, fabricación puede fácilmente hacerse por un centro base o por una empresa comercial que proporciona tales servicios. Cuando la fabricación del dispositivo, asegúrese de especificar que la altura de las características es de 50 μm.
1. experimental configuración
- Monte el dispositivo de microfluidos en un microscopio de fluorescencia invertido con una platina motorizada.
- Coloque un agitador orbital cerca del microscopio, pero asegúrese de que la vibración de la coctelera no afecta directamente al microscopio. Por ejemplo, poner el vibrador en un estante fijado en una pared que no hace ningún contacto con la mesa óptica.
- Coloque una bomba de la jeringuilla en el agitador orbital. Cinta de la bomba a la coctelera para que no agitan agitando.
2. preparación del entorno de microfluidos
Nota: Durante el experimento, cuatro jeringas están conectadas al dispositivo de microfluidos vía los tubos de jeringa, como se indica en la figura 1. Este paso describe la preparación de estas jeringas. Se indique lo contrario, mantener los tubos de jeringa tan cortos como sea posible sin lo que tensa.
- Preparar una jeringa de toma y un tubo de la jeringa. Esta jeringa (S1 en la figura 1) será más tarde a la salida del dispositivo a través del tubo de la jeringa y utilizado para el almacenamiento temporal del líquido que sale del dispositivo.
- Hacer una aguja adaptador quitando las piezas de plástico de una punta de la jeringa de 20 x 1/2 pulgada, manteniendo sólo la aguja (la parte metálica). Lo hacen manteniendo las piezas de plástico y de metal con pinzas y tirando de ellos aparte. Residuo plástico de la aguja puede ser quemado con un mechero de Bunsen.
- Doblar la aguja según la geometría de la disposición experimental mientras sostiene sus dos extremos con pinzas. En el diseño descrito aquí, es más conveniente doblar la aguja en su centro un ángulo de ~ 110°.
- Conecte la aguja adaptador la mitad en el tubo. La otra mitad más tarde va a ser conectada en el dispositivo. El tubo de la jeringa debe ser compatible con una punta de la jeringa de 20 G sin una pérdida (por ejemplo, tubería con diámetro interno de 0,86 mm y diámetro externo de 1,32 mm). La longitud del tubo recomendado es de 50 cm.
- Conecte una jeringa de 10 mL luer-lock al otro extremo del tubo de la jeringa a través de una punta de la jeringa de 20 x 1/2 pulgada (abierto).
- Preparación buffer entrada jeringas y tubos de jeringa. Una de estas jeringas (S2 en la figura 1) se utiliza como reservorio para el líquido que va en el dispositivo y para controlar el flujo de inyección. La otra jeringa (S3 en la figura 1) se requiere para cambio de tampón, como se explica en el paso 3.2.
- Conecte la jeringa de 10 mL luer-lock (S2) directamente a una válvula de 3 vías y otra jeringa (S3) a la misma válvula a través de un tubo de la jeringa (figura 1): Conecte S3 al tubo mediante una punta de la jeringa y conectar el tubo a la válvula por otra punta de la jeringa.
Nota: No importa el orden en que estos materiales están conectados. - Conecte un tubo de la jeringa al puerto restante de la válvula de 3 vías. Preparar otra aguja adaptador como en el paso 2.1.2 y conecte la aguja medio en el otro extremo (libre) del tubo de la jeringa.
- Ponga la válvula de tal manera que el tubo de la jeringa en el paso 2.2.2 y S2 están conectados mientras que S3 está cerrado (figura 1).
- Conecte la jeringa de 10 mL luer-lock (S2) directamente a una válvula de 3 vías y otra jeringa (S3) a la misma válvula a través de un tubo de la jeringa (figura 1): Conecte S3 al tubo mediante una punta de la jeringa y conectar el tubo a la válvula por otra punta de la jeringa.
- Preparar una jeringa de gusano-entrada y un tubo de la jeringa. Esta jeringa (S4 en la figura 1) se utiliza para la carga de gusanos en el dispositivo.
- Conecte un tubo largo de jeringa a jeringa de 10 mL luer-lock (S4). Determinar la longitud de este tubo del volumen del líquido que se utilizará para la carga; por ejemplo, 100 cm de la tubería soporta más 2 mL de líquido (también, vea el paso 4.2).
- Preparar otra aguja adaptador como en el paso 2.1.2 y enchufe a una mitad de la aguja al otro extremo del tubo de jeringa (abierto).
- Enjuague todas las jeringas y tubos con medio S12 dos veces. Llene las jeringas y los tubos con medio de S, teniendo cuidado de eliminar todas las burbujas de aire.
- Conecte el tubo de salida de la jeringa a la salida del dispositivo.
- Conecte la aguja adaptador en el extremo del tubo de la jeringa en el orificio de salida.
- Inyectar un pequeño volumen de medio de S a través de la toma para llenar el dispositivo, hasta que un poco S-medio sale de la entrada del buffer y la entrada del gusano.
- Conecte el tubo de jeringa buffer entrada al puerto de entrada de buffer del dispositivo, mientras conectas la entrada del gusano con un pasador (perno de pasador de acero inoxidable con un diámetro de 1/32 de pulgada).
- Inyectar un flujo constante de buffer en el dispositivo. Cargue la jeringa buffer entrada S2 en un jeringa bomba13y ajustar la bomba de tal forma que el medio en el S2 se inyecta continuamente en el dispositivo con un caudal de 3 μl/min.
3. carga de bacterias en el dispositivo de microfluidos
- Preparar OP50 de Escherichia coli en medio S12.
- Siguiendo un protocolo estándar, inocule un frasco de 250 mL con 50 mL de LB y una sola Colonia e incubar durante una noche a 37 ° C.
- Centrifugue la cultura durante la noche a 4000 rpm durante 10 minutos y resuspender el precipitado en 30 mL de medio de S.
- Filtrar la suspensión a través de un filtro de jeringa de 5 μm. Medir la concentración bacteriana por su densidad óptica a 600 nm (OD600) y ajustar la concentración a un OD600 de 3. Esta alta densidad es necesaria para mantener bien alimentado a los gusanos.
- Intercambiar el buffer en el dispositivo con la suspensión OP50.
- Preparar una jeringa limpia (S5) con la suspensión OP50. Sostenga la jeringa en posición vertical y pulse varias veces para recoger todas las burbujas de aire en la parte superior.
- Gire la válvula de 3 vías de las jeringas de entrada búfer para cerrar la conexión con el dispositivo y conectar las dos jeringas, S2 y S3. Desenganche el S2 de la bomba de jeringa.
- Desconecte el S2 de la válvula y conecte S5 a la válvula. Expulsar todo el aire recogido en la parte superior del S5 S3 a través de la válvula hasta un poco del búfer OP50 va en S3. Al hacerlo, asegúrese de que ninguna burbuja de aire queda en S5 o la válvula.
- Gire la válvula de 3 vías a la posición original para cerrar la conexión entre S3 y S5 y conectarse al dispositivo de S5. S5 de carga en la bomba de jeringa. Encender el agitador orbital que contiene la bomba. Ajustar la velocidad de agitación a aproximadamente 200 rpm.
- Fijar el caudal a ser 100 μl/min. El tiempo que tarda el nuevo búfer llegar a los gusanos en el dispositivo depende de la longitud del tubo de la jeringa del buffer de entrada (alrededor de 5 minutos con el tubo descrito anteriormente). Una mayor tasa de flujo se puede emplear si se requiere un cambio de buffer más rápido.
- Una vez que el buffer OP50 se disemina por todo el dispositivo, fijar el caudal a 3 μl/min.
4. carga de gusanos en el dispositivo de microfluidos
- Preparar un tubo de microcentrífuga de atascamiento bajo pequeño (650 μL) y llenarlo con 100 μl de suspensión OP50. Transferir alrededor de 20-30 joven edad-que sincronizados recoger gusanos adultos (46 horas post detención larvas L1 a 25 ° C) de una placa de agar de la NGM (medio de cultivo nematodos) al tubo de ellos escogiendo uno a uno con un gusano. Edad-sincronización puede hacerse siguiendo un protocolo estándar de12.
- Llenar la entrada de gusano jeringa y jeringa tubo (S4 en la figura 1) con la suspensión OP50. Inyecte ~ 500 μl del líquido en el tubo de microcentrífuga con gusanos. Dibujar la suspensión con gusanos en el tubo de jeringa de gusano-entrada. Asegúrese de que el tubo de la jeringa es lo suficientemente larga (> 1 m) y que gusanos dibujadas en el tubo de la jeringa y no hacen todo el camino a la jeringa S4.
- Conecte el S4 a la entrada del gusano. Inyectan todos los gusanos en el tubo de la jeringa de gusano-entrada en el dispositivo de microfluidos. Desconecte el S4 y el tubo de la jeringa. Conecte la entrada del gusano con un alfiler.
- Desconectar la jeringa del buffer entrada S2 de la bomba mecánica ( figura 1) y controlar manualmente S1 y S2 para empujar todos los gusanos en canales separados. Presionando S2 se mueven gusanos en los canales, mientras que presionar S1 se moverá en la dirección contraria. Una vez cargado un canal, el gusano en cada canal bloqueará la entrada de otros gusanos.
- Permite gusanos ajustar al nuevo ambiente durante 2-3 horas.
5. establecer un protocolo de la proyección de imagen
- Encontrar todos los gusanos que están situados firmemente en el dispositivo y establecer una posición de la proyección de imagen para cada uno de ellos en el software de adquisición de imagen que controla su microscopio. Tenga en cuenta que en algunos casos (por ejemplo, cuando se desea mayor aumento, o cuando se usan cámaras con un sensor CCD más pequeño) múltiples posiciones de proyección de imagen se requieren para cada canal.
Nota: Mientras que esto puede hacerse manualmente, algunos paquetes de software de adquisición pueden cargar un archivo de texto que muestra las posiciones donde deben tomarse imágenes. Desde estas posiciones se ordenan regularmente en WormSpa, un usuario puede escribir un pequeño script (por ejemplo, en Python o software comercial) que crea automáticamente dicha lista. El formato exacto de este script depende el formato esperado por el software de adquisición (véase un ejemplo en 1 Material complementario). - Fijar la frecuencia deseada de la proyección de imagen de Time-lapse. Por ejemplo, proyección de imagen del gene inmune ante la infección se realiza a una frecuencia de 10 minutos por capítulo. Asegúrese de que todos los canales necesarios (por ejemplo, de campo claro y la fluorescencia de GFP) se adquieren en cada momento.
6. el anfitrión respuesta a la infección por Pseudomonas
Nota: Este paso es específico para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. Alternativomente, uno puede preparar un buffer que contiene otras señales ambientales de interés (factores de estrés bióticos y abióticos, drogas, señalización de moléculas, etc.).
- Preparar PA14 de Pseudomonas aeruginosa en medio SK14.
- Inocular un frasco de 250 mL con 50 mL de LB y una sola Colonia e incubar durante una noche a 37 ° C.
- Inocular en otro matraz de 250 mL con 50 mL de LB y una alícuota de la cultura e incubar durante una noche a 37 ° C.
- Centrifugue la cultura durante la noche a 4000 rpm durante 10 minutos y resuspender el precipitado en 10 mL de medio de SK. Medir la concentración bacteriana y ajustar la concentración de OD600 = 4.
- Trasvasar la suspensión a un matraz limpio e incubar a 37 ° C durante 24 horas y a 25 ° C durante 24 horas agitando. Este paso imita el paso de incubación de la placa en el estándar matando ensayo14.
- Filtrar la suspensión a través de un filtro de jeringa de 5 μm. Esto es para evitar agregados bacterianos obstruyan el dispositivo.
- Reemplazar la suspensión OP50 en el dispositivo con la suspensión de PA14, siguiendo el mismo procedimiento como en el paso 3.2. Mantener la proyección de imagen de 10 horas.
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Representative Results
Gusanos adultos jóvenes edad sincronizado (46 horas post detención larvas L1 a 25 ° C)12 fueron cargados en el dispositivo, como se describe en el protocolo. Los gusanos fueron situados individualmente en canales separados, permitiendo la medición longitudinal de la respuesta de los animales al patógeno. Cuando el experimento tiene éxito, la mayoría gusanos permanecen en sus canales para la duración del experimento. En este caso, se toman imágenes de los gusanos simplemente colocando su canal en la ruta de la imagen, evitando la necesidad de buscar activamente el animal. Figura 2 A se muestran las imágenes de campo claro de un solo gusano representativo a lo largo de 10 horas en el dispositivo. Mientras que los gusanos están confinados dentro de sus canales, pueden moverse hacia arriba y hacia abajo y puede girar libremente a sus cabezas. Esto es fundamental para garantizar que el dispositivo sí mismo no causar estrés o daño a los animales.
Supervisamos la respuesta de gusanos a la infección bacteriana por p. aeruginosa, uno de los patógenos bacterianos más estudiados de C. elegans. Es también un patógeno oportunista que causa infecciones en fibrosis quística y pacientes inmunocomprometidos. Alimentar gusanos con particular cepas de p. aeruginosa, como aislar el clínico PA14, conduce a la letal infección intestinal, y los factores de virulencia involucrados en este proceso también están implicados en la infección de los hospedadores mamíferos. 14 , 15
Para examinar el patrón de cambios en la expresión génica durante la infección bacteriana, pueden emplearse reporteros fluorescentes. Entre los muchos genes que muestran respuesta dinámica a la infección, supervisamos la respuesta transcripcional de irg-1 (infección gene la respuesta del 1), por proyección de imagen de gusanos transgénicos expresando irg-1::GFP de la fluorescencia de GFP (AU0133 [() agIs17 PIRG-1::GFP; pmyo-2::mCherry)], obtenido por el laboratorio de Ausubel). IRG-1 es conocido por ser fuertemente inducida en el intestino de los animales infectados en la etapa temprana de la infección por p. aeruginosa PA14. 16 , 17 Figura 2 B muestra imágenes de lapso de tiempo de un gusano representante (el mismo animal como en la figura 2A). Cada imagen de fluorescencia fue tomada inmediatamente después de la correspondiente imagen de campo claro. En la primera 5 horas post infección, fluorescencia de GFP aumenta sólo levemente en el cuerpo medio y la cola. Luego, se observa un aumento sustancial de la fluorescencia a partir de medio cuerpo. La fluorescencia total en cada gusano se grafica en la figura 2C como una función de post infección de tiempo. Estos datos ilustran no sólo la inducción descrito previamente de la irg-1 sobre PA14 infección, sino también la variabilidad del gusano al gusano en el tiempo y el grado de inducción.
El diseño del dispositivo de microfluidos WormSpa incluye filtros que recogen los huevos puestos por cada gusano individual5. Una vez que salen de los huevos, las larvas L1 se lavan a través del filtro y el tubo de salida. Esto nos permitió controlar manualmente la cinética puesta de huevos de gusanos individuales durante una infección bacteriana. Las imágenes de lapso de tiempo de los huevos puestos por el mismo gusano como en la figura 2 se muestran en la figura 3A. Estas imágenes fueron tomadas justas después de las correspondientes imágenes de campo claro en figura 2A. El número de huevos puestos por cada gusano se muestra como una función de la infección post de tiempo en la figura 3B, y la media y la desviación estándar sobre toda la población se muestran en la figura 3C. Captura de estos datos la variabilidad de animal a animal, así como la disminución previamente descrito de puesta de huevos como la infección progresa. Por el contrario, en animales no infectados no disminuir tasa de puesta de huevos hasta que picos a ~ 54 horas post L1 en 25 ° C5,18.
Figura 1: esquema Experimental de imágenes directo de gusanos en un dispositivo de microfluidos. Gusanos se cargan en el dispositivo a través de la entrada del gusanoy posteriormente se empujaron en canales separados. Suspensión bacteriana se inyecta en el dispositivo de la entrada del tampón por una bomba mecánica montada en un agitador orbital. El tampón sale a través del orificio de salida del dispositivo. Cuatro jeringas (S1, S2/S5, S3 y S4) se utilizan para manejar el dispositivo. Las líneas discontinuas rojas son tubos de jeringa, jeringas y el dispositivo de conexión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: cinética de expresión de genes representante. Imágenes de lapso de tiempo de un gusano representativa tomadas por microscopia de la fluorescencia de GFP campo brillante (A) y (B) . Las imágenes de la izquierda fueron tomadas justo antes de que el patógeno se introdujo, considerando que las imágenes de la derecha fueron tomadas 10 horas post infección por PA14. El intervalo de tiempo entre imágenes es de 1 hora. (C) el curso del tiempo de total irg-1:: la fluorescencia de GFP en los gusanos. Cada fila corresponde a un solo animal. Filas se ordenan en orden decreciente de fluorescencia media. Intensidad de fluorescencia es codificados por colores y la escala cromática se muestra a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: representación cinética de puesta de huevos. (A) tiempo imágenes de olvido del número de huevos puestos por el mismo gusano que se muestra en la figura 2A y B. Las imágenes de la izquierda fueron tomadas justo antes de que el patógeno se introdujo, considerando que las imágenes de la derecha fueron tomadas 10 horas post infección por PA14. El intervalo de tiempo entre imágenes es de 1 hora. (B) el curso del tiempo del número de huevos de los gusanos. Cada fila corresponde a un solo animal. Filas se ordenan en orden descendente de la cantidad total de huevos puestos por gusano. El número de huevos es con códigos de color y la escala cromática se muestra a la derecha. (C) el número promedio de huevos puestos por gusano como una función del tiempo. La zona gris indica una desviación estándar de ±. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1 Material complementario: un script de ejemplo que crea un archivo de texto que contiene las posiciones proyección de imagen para todos los canales en el dispositivo de WormSpa. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Herramientas de microfluidos proporcionan múltiples beneficios en el estudio de gusanos. Proyección de imagen en un PDMS dispositivo ofrece mayor calidad de imagen en comparación con una placa de agar estándar de NGM. Varias imágenes se pueden tomar de un solo gusano, a diferencia de métodos tradicionales en que animales son recogidos de la placa y montados en un portaobjetos para la proyección de imagen. Además, el microambiente en el cual residen gusanos se puede mantener constante o modulado según se desee, permitiendo una precisa cartografía entre la composición del medio ambiente y la respuesta de los animales.
Aquí demostramos cómo realizar una medición longitudinal de la respuesta del huésped a la infección bacteriana por proyección de imagen la respuesta de varios gusanos individuales al patógeno oportunista p. aeruginosa PA14 usando un dispositivo de microfluidos personalizado (WormSpa). Campo claro y fluorescencia imágenes se tomaron varias veces sin perturbar el experimento continuo. En particular, la cinética de la puesta de huevos y la expresión de gene de la irg-1 fueron sondeados cada 10 minutos, un aumento significativo en la resolución temporal sobre los métodos tradicionales14,15.
En este dispositivo, pueden realizarse mediciones longitudinales de varios gusanos revisitando la ubicación guardada de cada lombriz en un momento dado. Esto fue demostrado en las figuras 2C y 3B, donde nos cuantificar el irg-1:: la fluorescencia de GFP y los huevos puestos por los gusanos. Estas cifras muestran que gusanos Mostrar la amplia gama de perfiles cinéticos. Según lo demostrado previamente en estudios unicelulares19,20,21, esta individualidad se puede utilizar para entender el diseño de circuitos genéticos, así como la correlación entre distintas vías19, 22.
Para los experimentos exitosos, es fundamental cargar gusanos en el dispositivo de microfluidos rápidamente. Mientras que los gusanos se arrastran sobre la superficie del agar, tienden a thrash en medio líquido, y este comportamiento induce un programa genético que AMP activado Proteína quinasas están involucrados23,24. Para minimizar esta perturbación indeseable, es importante colocar gusanos en sus cámaras separadas rápidamente, como las microestructuras en el compartimiento y la permeabilidad del aire de PDMS proporcionan gusanos con un entorno que imita la superficie sólida. 5 aunque ejercer mayor presión ayuda a gusanos de carga más rápido, presurizar el aparato demasiado podría inducir estrés mecánico en los gusanos. Gusanos que se tensionan seriamente no alimentación o endecha huevos, resultando en un fenotipo claramente observable embolsado del25. Después de cargar, gusanos son alimentados OP50 de e. coli durante 2-3 horas, permitiendo a los gusanos ajustar al ambiente de microfluidos y proporciona al investigador la oportunidad de observar los animales y descartar aquellos que fueron dañados.
El tamaño y el espaciamiento de microestructuras en cada cámara se optimizan para los gusanos de 46 horas de la detención de L1 a 25 ° C. Las estructuras se pueden escalar para el estudio de gusanos mayores o reducidas para examinar las larvas L4 que son más pequeñas en tamaño. Sin embargo, los gusanos no son capaces de mudar con éxito en la cámara, que el estudio del desarrollo post embrionario en este dispositivo. Para estas aplicaciones, pueden considerarse métodos como WorMotel26 . Desde gusanos se limita pero no inmovilizados en WormSpa, un exitoso experimento duradero depende de si los animales permanecen en la cámara. Nos encontramos con que esto puede ser un reto para las larvas de la temprano-etapa, para varones adultos y para algunos mutantes hermafroditas.
En lugar de utilizar una entrada de solo almacenador intermediario (en el centro de la parte superior, figura 1), las dos entradas hacia abajo en forma de globo se pueden utilizar simultáneamente. Llena las dos jeringas diferentes buffers, uno puede generar entornos estructurados temporal presionando en diferentes jeringas en diferentes momento. Esto, por ejemplo, permite el estudio de adaptación al entorno cambiante. 27 , 28
Como se mencionó anteriormente, el dispositivo de microfluidos descrito aquí puede utilizarse para una amplia gama de otras aplicaciones. Se trata de estudiar las respuestas a otras señales ambientales. Esas respuestas pueden incluir cambios en la expresión génica y la puesta de huevos comportamientos, como se ejemplifica aquí, pero también los cambios en la acumulación de grasa y el metabolismo (por ejemplo, a través de la grasa la coloración roja del Nilo), fisiología neuronal y señalización (e.g. por calcio la proyección de imagen y optogenetic las perturbaciones), cambios en el comportamiento motor como bombeo, movimiento de defecación y la cabeza (via la automatizado cuantitativo la proyección de imagen de secuencias Time-lapse) y más.
Por último, este enfoque es en gran parte automatizado y reduce la mano de obra necesaria para los experimentos de largo durante muchas horas, incluso días. Una vez que las localidades de gusanos individuales se guardan en el software de adquisición de datos, el experimento consiste en grabación automática de imágenes de mientras el controlador de la bomba mecánica mantiene el flujo constante de buffer en el dispositivo. Importante, fabricación de un dispositivo de WormSpa no requiere de ningún protocolo de litografía blanda más estándar, y su diseño y funcionamiento están bastante sencillos incluso para los investigadores sin experiencia previa en microfluídica. Con las varias ventajas mencionadas y pasos de preparación relativamente simple, este enfoque puede ser útil para aquellos que están considerando la medida longitudinal de gusanos vivos bajo condiciones precisamente controladas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por la National Science Foundation a través de subvenciones PHY-1205494 y MCB-1413134 (EL) y por la 2017R1D1A1B03035671 de grant de la Fundación Nacional de investigación de Corea (KSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WormSpa | N/A | N/A | The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab. |
| Compound Microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | An inverted fluorescence microscope with a motorized stage |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D |
| Syringe Tip | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula |
| Syringe Filter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane |
| Syringe | Qosina | C3307 | 10 mL Male Luer Lock Syringe |
| 3 Way Valve | ColeParmer | FF-30600-23 | Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile |
| Dowel Pin | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) |
| Low Binding Microcentrifuge Tube | Corning | CL S3206 | 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube |
References
- Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670 (2017).
- Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
- Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862 (2016).
- Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221 (2017).
- Stiernagle, T.
- NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , New Era Pump Systems Inc. (2017).
- Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
- Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
- Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J.
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
- Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , (1997).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).
