Quantificação de lipídios abundância e avaliação da distribuição de lipídios em Caenorhabditis elegans por Nilo vermelho e coloração do óleo vermelho O

Resumo

Nile vermelho coloração do fixo Caenorhabditis elegans é um método para a medição quantitativa de depósitos de lipídios neutros, enquanto o óleo vermelho O coloração facilita a avaliação qualitativa da distribuição de lipídios entre tecidos.

Resumo

Caenorhabditis elegans é um organismo modelo excepcional em que para estudar o metabolismo lipídico e homeostase de energia. Muitos dos seus genes de lipídios são conservados em seres humanos e estão associados com a síndrome metabólica ou outras doenças. Exame do acúmulo de lipídios neste organismo pode ser realizada por corantes fixador ou métodos livre de rótulo. Manchas de fixador como Nilo vermelho e O vermelho de óleo são maneiras de baixo custo, confiáveis para medir quantitativamente os níveis de lipídios e observar qualitativamente distribuição de lipídios através de tecidos, respectivamente. Além disso, estas manchas permitem para elevado-throughput screening de vários genes do metabolismo de lipídios e caminhos. Além disso, sua natureza hidrofóbica facilita a solubilidade lipídica, reduz a interação com tecidos circundantes e impede que a dissociação em solvente. Embora esses métodos são eficazes em examinar o teor lipídico geral, eles não fornecem informações detalhadas sobre a composição química e diversidade dos depósitos de lipídios. Para estes fins, livre de rótulo métodos tais como a microscopia de GC-MS e carros estão melhores adequado, os seus custos, não obstante.

Introdução

Lipídios são essenciais para a vida. Eles são componentes integrais das membranas, atuam como mensageiros secundários e Transdutores de sinal e têm funções cruciais no armazenamento de energia. Quando o metabolismo lipídico é prejudicado, leva a doenças como obesidade e diabetes tipo II, que estão pressionando as preocupações de saúde pública⁹. Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um organismo modelo excelente em que para estudar o metabolismo lipídico, porque tem um ciclo de vida relativamente curto, um corpo transparente, uma linhagem de células conhecidas e um genoma completamente sequenciado. Principalmente uma hermafrodita, o c. elegans permite que os pesquisadores levantar um grande número de animais isogénicas Resumindo períodos de tempo para realizar elevado-throughput avanço genéticos telas para estudar uma grande variedade de de genes e vias metabólicas⁴. Esta abordagem revelou-se um elevado grau de conservação em 273 c. elegans genes de metabolismo de lipídios entre seres humanos, ratos, ratos e drosófila. Além disso, mais de 300 genes de lipídios em c. elegans tem orthologues humano que estão associados com doenças não relacionadas com síndrome metabólica¹¹. Tradicionalmente, exame de armazenamento de lipídios em c. elegans principalmente dependeu de tingir-etiquetados ensaios, que fornecem informação robusta sobre o acúmulo de lipídios. Menos comum é uma descrição de onde localizar lipídios e medidas diferenças na abundância de lipídios através de tecidos. No entanto, o trabalho recente revelou que a distribuição de lipídios pode ser tão importante como o acúmulo de lipídios⁶.

Ultimamente, estudos começaram a integrar métodos como alto rendimento líquido cromatografia / espectrometria de massa (HPLC-MS), cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS), e coerente anti-stokes microscopia de Raman espalhamento (carros) para o endereço a deficiências de mancha-abordagens analisando diretamente o conteúdo de lipídios extratos e frações lipídica específica depósitos lipídicos, respectivamente de^10,11. Além disso, a microscopia de carros revelou que vermelho Nilo pode servir apenas como um proxy para o acúmulo de gordura quando usado como um corante fixador, para seu uso como uma mancha vital leva para fora do alvo coloração de organelas autofluorescente¹⁰. No entanto, os conhecimentos técnicos necessários e os custos associados a estes cromatografia e métodos de microscopia tornam a sua utilização insustentável para muitas perguntas de pesquisa. Neste artigo, discutimos um método conveniente e confiável para se fixam e manchar os depósitos de lipídios neutros em c. elegans usando Nilo vermelho e O vermelho para distinguir a abundância de lipídios em animais inteiros e em tecidos específicos de óleo.

Nilo vermelho, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, é um corante benzophenoxazone que prontamente se dissolve em diversos solventes orgânicos, mas principalmente é insolúvel em água. É um excelente lisocromo corante usado para manchar lípidos neutros como triglicérides ou ésteres de colesterol porque ele apresenta uma cor forte, solubiliza bem em lipídios, tem interação insignificante com tecidos circundantes e é menos solúveis no solvente do que no lipídios. Tem uma excitação e emissão maxima de 450-500 e 520 nm, respectivamente¹. Quando Nilo manchados de vermelho c. elegans é visto por fluorescência verde, corpos lipídico discreta podem ser observados em todo o intestino e outros tecidos ou em aglomerados ou uniformemente dispersos, dependendo do genótipo do animal ou tratamento experimental ⁷.

O óleo vermelho é um lisocromo, corante lipossolúvel usado para manchar os triglicerídeos e lipoproteínas. Chama-se um corante azoico porque sua estrutura química contém dois grupos azo ligados a três anéis aromáticos. É difícil ionizar, que torna altamente solúvel em lipídios. Sua mancha cor é vermelha e sua absorção de luz máxima é 518 nm ³. C. elegans manchado com óleo vermelho O mostrar gotículas lipídicas vermelho destacam-se contra o corpo do animal transparente, que facilita a avaliação qualitativa da distribuição de lipídios entre diferentes tecidos⁶.

Protocolo

1. Nilo vermelho (NR) coloração de lipídios

1. Preparação de NR de 5 mg/mL de solução
   1. Em uma garrafa de 500 mL, adicione 100 mg de pó NR para 200 mL de acetona 100%.
   2. Cubra o frasco com papel de alumínio para evitar qualquer exposição à luz.
   3. Antes de usar, misture a solução por 2 h no escuro.
   4. Para uso a longo prazo, armazene a solução estoque NR em um frasco hermeticamente selado sem qualquer exposição à luz. Escala NR solução-mãe de acordo com as necessidades de pesquisa. Certifique-se de que a mesma solução estoque é usada através de experimentos NR-coloração para obter a coloração consistente e os resultados de imagem.
2. Preparação da solução de trabalho NR
   1. Para cada 1 mL de isopropanol 40% (v/v), adicione 6 µ l de solução-mãe de NR.
   2. Prepare-se para cada amostra de 600 µ l da solução de trabalho de NR.
      Nota: Fazer fresco NR funcionando direito solução antes da coloração. Dependendo das necessidades de solução-mãe de NR, use um tubo cônico graduado de 50 mL ou 15 mL.
3. Preparação de worms para coloração de lipídios NR
   1. Crescem vermes a fase inicial de L4 a 20 ° C, no meio de crescimento de nematoides (NGM) inoculado com final do log OP50 Escherichia coli.
   2. Lave os vermes no prato com 1 mL de 1x tampão fosfato salino + 0,01% solução de Triton X-100 (PBST) e colocar a suspensão de worm em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   3. Centrifugue que os vermes a 560 x g por 1 min. remover o sobrenadante e repita este passo até Escherichia coli está desmarcado de suspensão.
   4. Adicionar 100 µ l de isopropanol 40% para a pelota de verme e incube-lo em temperatura ambiente por 3 min.
   5. Centrifugue os vermes a 560 x g por 1 min e remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento do worm.
      Nota: Maiores volumes de uso de PBST para lavar os vermes os pratos se usando placas maiores ou mais vermes por placa de coloração. Não lave os vermes em PBST, há mais de 15 min antes da fixação da amostra. Realize lavagens adicionais se o sobrenadante não é livre de bactérias. Realize a incubação em isopropanol 40% usando um nutator ou balancim. Sempre monitore os tubos para certificar-se de agitação da amostra completa está ocorrendo.
4. Lipídios, coloração com NR
   1. No escuro, adicione 600 µ l da solução de trabalho de NR para cada amostra. Inverter os tubos três vezes e totalmente misturar os vermes em solução NR.
   2. Gire a amostra no escuro à temperatura ambiente por 2 h.
   3. Após a incubação, centrifugue os vermes a 560 x g por 1 min e retirar o sobrenadante.
   4. Adicione 600 µ l de PBST e incubar as amostras no escuro por 30 min remover a mancha excesso de NR.
   5. Centrifugar as amostras a 560 x g por 1 min e remover todos, mas cerca de 50 µ l do sobrenadante.
      Nota: Incubação NR não requer agitação. Sedimentação de vermes é comum durante esta etapa.
5. Preparação de slides para imagens de microscópio
   1. Ressuspender o worm no sobrenadante restante.
   2. Coloque 5 µ l de suspensão de worm em um microscópio e coloque uma lamela cuidadosamente para evitar captura quaisquer bolhas de ar.
   3. Sele a lamínula com esmalte antes da imagem latente de vermes.
   4. Prepare-se apenas alguns slides de cada vez. Isso garantirá que a imagem de NR permanece constante através de amostras. A qualidade das imagens manchadas de NR diminui depois de gotículas de lipídios discreta de 6 h. são difíceis de observar e fluorescência de fundo aumenta, o que interfere com a detecção do sinal NR.
6. Imagens de worms NR-manchado
   1. Os vermes em 5 ampliação de X para capturar vários animais por campo de visão da imagem.
   2. Alternar para ampliação de 10x para melhor quantificação dos vermes individuais.
   3. Use o canal FITC/GFP para imagem manchada de NR vermes e tente tempos de exposição diferentes para determinar as condições ideais para quantificação.
   4. Salve arquivos em formato TIF para evitar perda de dados devido à compressão.
      Nota: Exposição típica vezes variam de MS. 100-1000, tendo um tempo de exposição ideal, usá-lo para todas as amostras para manter a consistência da imagem latente.
7. Quantificação de imagem coloração NR
   1. Upload de fotos para ImageJ. No menu suspenso de Plugins, use a função de Bio-formatos se o arquivo de imagem não é reconhecido.
   2. Na imagem menu pull-down, sob a função de pilhas, use imagens-para-Stack para criar uma pilha de imagem quando várias micrografias são comparadas.
   3. No mesmo menu suspenso, ajustar o brilho/contraste da pilha imagem e propagar alterações a todas as imagens clicando em aplicar.
   4. Emprega a ferramenta de seleção Polygon para delinear cada verme imagem e usar a função da medida sob o menu pull-down de análise para quantificar a intensidade da fluorescência emitida pelo NR.
   5. Para cada imagem, medir cinco locais de fundo e calcular a intensidade de fluorescência do fundo.
   6. Subtrair a intensidade de fluorescência de fundo de cada imagem worm usando a fórmula N = G - (A x B), onde N representa líquida fluorescência, G para fluorescência bruta, A área total worm e B para fluorescência do fundo.
   7. Para normalizar a intensidade da fluorescência pelo tamanho do verme, divida líquida fluorescência de cada worm pela sua área total. Os resultados são relatados como intensidade de fluorescência, em unidades arbitrárias (u.a.), por pixel.
      Nota: Evite exportar imagens em formato JPEG. Enquanto a compressão faz com que mais gerenciável para armazenar arquivos, integridade dos dados é comprometida por esse formato. Certifique-se de que todas as imagens são modificadas e analisadas de forma idêntica. Lembre-se de incluir uma barra de escala para avaliar corretamente o tamanho em diferentes ampliações. Para visualizar melhor as diferenças na intensidade de fluorescência usando o ImageJ, mudar o tipo de imagem de RGB para 8-bit e selecione fogo no menu imagem pesquisa tabelas (LUT). Isso cria uma imagem de mapa de calor em qual cor maior brilho correlaciona-se com intensidade de aumento da fluorescência.

2. óleo O vermelho mancha (ORO) de lipídios

1. Preparação da solução-mãe de ORO
   1. Em um frasco de 250 mL, adicionar 500 mg de pó ORO para 100 mL de isopropanol 100% e misture bem.
   2. Uma vez preparados, armazene a solução hermeticamente fechada sem exposição.
2. Preparação da solução de trabalho de ORO
   1. Dilua a solução-mãe de ORO na água (3:2), 60% de isopropanol.
   2. Antes da utilização, filtre a solução de ORO de trabalho através de um filtro de seringa estéril de acetato de celulose de 0,2 µm.
      Nota: Para obter melhor qualidade de solução, preparar a solução de ORO de trabalho no dia anterior e deixá-lo misturar durante a noite. No entanto, se a solução é necessário mesmo dia, diluir e misture a solução ORO sobre um roqueiro para pelo menos 2 h antes da utilização. Antes de balanço, enrole o tubo cônico em fita de parafina para evitar o vazamento da solução ORO.
3. Preparação de worms para coloração de lipídios ORO
   1. Crescem os vermes a 20 ° C em meio de crescimento de nematoides (NGM) inoculado com final do log OP50 Escherichia coli ao estágio de vida desejado.
   2. Adicionar 1 mL de solução PBST à placa e agite até que todos os vermes estão no prato. Incline o prato e lave-a com 1 mL de PBST. Transferi a suspensão de minhoca para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   3. Centrifugue que os vermes a 560 x g por 1 min. Retire o sobrenadante sem perturbar o sedimento e repetir a lavagem passo com 1 mL de PBST três vezes. Remova todos os µ l de sobrenadante mas 100.
   4. Adicione 600 µ l de isopropanol 40% para a pelota de verme e rock-lo em temperatura ambiente por 3 min.
   5. Centrifugue os vermes em 560 x g por 30 s e remover todo o sobrenadante, mas 100 µ l sem interromper a pelota de verme.
      Nota: Use volumes mais elevados de PBST lavar vermes pratos se fazendo coloração de alta produtividade. Não lave vermes em PBST, há mais de 15 min antes da fixação da amostra. Fazer lavagens adicionais se o sobrenadante não é livre de bactérias. Realize a incubação em isopropanol 40% usando um nutator ou balancim. Sempre monitore os tubos para certificar-se de agitação da amostra completa está ocorrendo.
4. Lipídios, coloração com ORO
   1. Adicione solução ORO 600 µ l de cada amostra. Inverter o tubo três vezes e misturar os vermes bem no ORO.
   2. Gire as amostras em 30 rpm para 2 h à temperatura ambiente.
   3. Centrifugar as amostras a 560 x g por 1 min e eliminar todos os µ l de sobrenadante mas 100.
   4. Resuspenda as amostras em 600 µ l de PBST e gire os tubos a 30 rpm durante 30 min remover a mancha excesso de ORO.
   5. Centrifugar as amostras a 560 x g por 1 min e eliminar tudo mas 50 µ l do sobrenadante.
   6. Para melhor distinguir a localização do germline do animal e células intestinais, mancha núcleos adicionando 1 µ l de (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indol-6-carboxamidine) (DAPI) para cada 1 mL de solução de trabalho de ORO. Realize ORO mancha para 2h com a adição de DAPI antes da montagem de slides para a imagem latente. Núcleos intestinais são maiores em tamanho e a gônada distingue-se pelas células germinativas em desenvolvimento.
      Nota: Após coloração de ORO, worms podem aderir aos lados do tubo de microcentrífuga e falhar formar um pellet perceptível. Se isso acontecer, centrifugue os vermes novamente ou permitir worms para contentar por gravidade pelo menos 10 min.
5. Preparação dos slides para verme de imagem
   1. Resuspenda os vermes no sobrenadante restante e homogeneizar a solução.
   2. Colocar 5 µ l de suspensão de worm em um microscópio e coloque uma lamela com cuidado, garantindo que nenhum ar as bolhas se formam.
   3. Sele a lamínula com esmalte e vermes de imagem.
      Nota: Após fixação e coloração, vermes podem ser muito rígidas e difíceis de colocar. Para contornar isso, deixe todo o furo pipetas cortando suas dicas.
   4. Armazene os slides em um rack de microcentrífuga a 4 ° C por até 24 h, se não de imagem imediatamente depois da coloração.
6. Imagens de worms manchadas de ORO
   1. Use uma câmera compatível com cor para vermes de imagem manchada de ORO.
   2. Use 5 ampliação de X para vários vermes em um campo de visão da imagem.
   3. Alternar para ampliação de 10x para melhor exame de vermes individuais.
   4. Exportação de imagens em formato TIF para evitar perda de dados devido à compressão.
      Nota: Se manchar com ORO + DAPI, ligue a câmera capaz de cor para uma que pode capturar a fluorescência.
7. Análise de imagens de worms manchadas de ORO
   1. Envie micrograph(s) para o ImageJ. No menu suspenso de Plugins, use a função de Bio-formatos se o arquivo de imagem não é reconhecido.
   2. Na imagem menu pull-down, sob a função de pilhas, use imagens-para-Stack para criar uma pilha de imagem quando várias micrografias são comparadas.
   3. Ajuste o brilho/contraste sob o mesmo menu pull-down para melhorar a visibilidade das gotículas lipídicas.
   4. Categorize as imagens de acordo com o acúmulo de lipídios por todo o corpo do animal ou em tecidos específicos.
   5. Para melhor avaliação da localização de lipídios e para a identificação de artefatos de imagem específico usando o ImageJ, seleccionar a função de cor sob o menu pull-down de imagem e clique na pilha para RGB para mostrar os sinais de cada componente RGB.

Resultados

SKN-1 é um bZip, fator de transcrição de tilacoides que compartilha homologia com mamíferos NRF2 e foi mostrado para mediar a oxidação de ácidos graxos. Dependendo da concentração de glicose em sua dieta, vermes com um alelo constitutivamente ativado skn-1 mostram níveis lipídicos diferentes quando corados com Nilo vermelho⁷. Figura 1A -C mostra ativado skn-1 animais expostos a condições que levam ao ...

Discussão

O aumento da obesidade e doenças metabólicas tarifas faz c. elegans , um modelo adequado para estudar os mecanismos que regulam a acumulação de gordura nas células e tecidos. Recentes sugerem que as mudanças nos níveis de lipídios são correlacionadas com processos celulares que variam de⁸, a ativação de receptores hormonais², a saída reprodutivo⁵a sinalização de insulina. Comparado com rótulo livre microscopia e métodos de cromatografia, Nil...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Imager.M2m Microscópio	Zeiss	n/a	Microscópio de fluorescência
Câmera ERC5s	Axiocam	n/a	com capacidade de cor
	Axiocam	n/a	com capacidade de fluorescência
	Thermo Fisher	N1142	Mancha lipídica
Óleo vermelho O	Alfa Aesar	A12989	Mancha lipídica
DAPI	Thermo Fisher	D1306	DNA stain
Álcool Isopropílico	BDH	BDH1133-1LP	Solução fixadora
0.2 µ m filtro de seringa	de seterile VWR	28145-477	Filtro de acetato de celulose
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Shaker Rotisserie	Lab Quake	400110Q
Shaker Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator
K2HPO4	Sigma-Aldrich	7758-11-4	NGM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	7778-77-0	NGM
MgSO4	Alfa Aesar	7786-30-3	NGM
CaCl2	Sigma-Aldrich	10035-04-8	NGM
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5	NGM
Colesterol	Sigma-Aldrich	57-88-5	NGM
Peptona	BD Biosciences	211677	NGM
Agar	Teknova	L9110	NGM
LB mídia	Sigma-Aldrich	L3147	Crescimento bacteriano