Artigo de método

Quantificação de lipídios abundância e avaliação da distribuição de lipídios em Caenorhabditis elegans por Nilo vermelho e coloração do óleo vermelho O

DOI:

10.3791/57352

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5 de março de 2018

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1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California, 2Molecular & Computational Biology Section, University of Southern California, 3Integrative Program for Biological & Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill

Neste artigo

Resumo

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Nile vermelho coloração do fixo Caenorhabditis elegans é um método para a medição quantitativa de depósitos de lipídios neutros, enquanto o óleo vermelho O coloração facilita a avaliação qualitativa da distribuição de lipídios entre tecidos.

Resumo

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Caenorhabditis elegans é um organismo modelo excepcional em que para estudar o metabolismo lipídico e homeostase de energia. Muitos dos seus genes de lipídios são conservados em seres humanos e estão associados com a síndrome metabólica ou outras doenças. Exame do acúmulo de lipídios neste organismo pode ser realizada por corantes fixador ou métodos livre de rótulo. Manchas de fixador como Nilo vermelho e O vermelho de óleo são maneiras de baixo custo, confiáveis para medir quantitativamente os níveis de lipídios e observar qualitativamente distribuição de lipídios através de tecidos, respectivamente. Além disso, estas manchas permitem para elevado-throughput screening de vários genes do metabolismo de lipídios e caminhos. Além disso, sua natureza hidrofóbica facilita a solubilidade lipídica, reduz a interação com tecidos circundantes e impede que a dissociação em solvente. Embora esses métodos são eficazes em examinar o teor lipídico geral, eles não fornecem informações detalhadas sobre a composição química e diversidade dos depósitos de lipídios. Para estes fins, livre de rótulo métodos tais como a microscopia de GC-MS e carros estão melhores adequado, os seus custos, não obstante.

Introdução

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Lipídios são essenciais para a vida. Eles são componentes integrais das membranas, atuam como mensageiros secundários e Transdutores de sinal e têm funções cruciais no armazenamento de energia. Quando o metabolismo lipídico é prejudicado, leva a doenças como obesidade e diabetes tipo II, que estão pressionando as preocupações de saúde pública9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um organismo modelo excelente em que para estudar o metabolismo lipídico, porque tem um ciclo de vida relativamente curto, um corpo transparente, uma linhagem de células conhecidas e um genoma completamente sequenciado. Principalmente uma hermafrodi....

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Protocolo

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1. Nilo vermelho (NR) coloração de lipídios

  1. Preparação de NR de 5 mg/mL de solução
    1. Em uma garrafa de 500 mL, adicione 100 mg de pó NR para 200 mL de acetona 100%.
    2. Cubra o frasco com papel de alumínio para evitar qualquer exposição à luz.
    3. Antes de usar, misture a solução por 2 h no escuro.
    4. Para uso a longo prazo, armazene a solução estoque NR em um frasco hermeticamente selado sem qualquer exposição à luz. Escala NR solução-mãe de acordo com as necessidades de pesquisa. Certifique-se de que a mesma solução estoque é usada através de experimentos NR-coloração para obter a coloração consistente e os resultados de imagem.....

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Resultados

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SKN-1 é um bZip, fator de transcrição de tilacoides que compartilha homologia com mamíferos NRF2 e foi mostrado para mediar a oxidação de ácidos graxos. Dependendo da concentração de glicose em sua dieta, vermes com um alelo constitutivamente ativado skn-1 mostram níveis lipídicos diferentes quando corados com Nilo vermelho7. Figura 1A -C mostra ativado skn-1 animais expostos a condições que levam ao .......

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Discussão

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O aumento da obesidade e doenças metabólicas tarifas faz c. elegans , um modelo adequado para estudar os mecanismos que regulam a acumulação de gordura nas células e tecidos. Recentes sugerem que as mudanças nos níveis de lipídios são correlacionadas com processos celulares que variam de8, a ativação de receptores hormonais2, a saída reprodutivo5a sinalização de insulina. Comparado com rótulo livre microscopia e métodos de cromatografia, Nil.......

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Divulgações

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Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Este trabalho foi feito possível pela subvenção NIH: R01GM109028 (S.P.C.)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Imager.M2m MicroscópioZeissn/aMicroscópio de fluorescência
Câmera ERC5sAxiocamn/acom capacidade de cor
Axiocamn/acom capacidade de fluorescência
Thermo FisherN1142Mancha lipídica
Óleo vermelho OAlfa AesarA12989Mancha lipídica
DAPIThermo FisherD1306DNA stain
Álcool IsopropílicoBDHBDH1133-1LPSolução fixadora
0.2 µ m filtro de seringade seterile VWR28145-477Filtro de acetato de celulose
Centrifuge 5430Eppendorf5428000015Centrifuge
Shaker RotisserieLab Quake400110Q
Shaker Tube RotatorVWR10136-084Rotator
K2HPO4Sigma-Aldrich7758-11-4NGM
KH2PO4Sigma-Aldrich7778-77-0NGM
MgSO4Alfa Aesar7786-30-3NGM
CaCl2Sigma-Aldrich10035-04-8NGM
NaClSigma-Aldrich7647-14-5NGM
ColesterolSigma-Aldrich57-88-5NGM
PeptonaBD Biosciences211677NGM
AgarTeknovaL9110NGM
LB mídiaSigma-AldrichL3147Crescimento bacteriano
Câmera MRm Vermelho do Nilo

Referências

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  1. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  2. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).
  3. Horobin....

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Etiquetas

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