Artigo de método

Rastreamento do comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenética de neurônios olfativos

DOI:

10.3791/57353

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21 de março de 2018

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1Department of Biology, MS-0314, University of Nevada, 2Integrated Neuroscience Graduate Program, University of Nevada

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo analisa comportamento de navegação de larvas de Drosophila em resposta à estimulação optogenetic simultânea de seus neurônios olfativos. Luz de comprimento de onda de 630 nm é usada para ativar individuais neurônios olfativos expressando uma rodopsina canal avermelhado. Larval movimento simultaneamente é controlado digitalmente gravado e analisados utilizando o software personalizados.

Resumo

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A capacidade de insetos para navegar em direção a fontes de odor baseia-se as atividades de seus neurônios olfactory do receptor de primeira ordem (ORNs). Gerou-se uma quantidade considerável de informações sobre ORN respostas a odorantes, o papel de ORNs específicas na condução de respostas comportamentais permanece mal compreendido. As complicações em análises de comportamento surgem devido a diferentes volatilidades dos odorantes que ativam ORNs individuais, vários ORNs ativados pelo único odorantes e da dificuldade em replicar naturalmente observadas variações temporais em estímulos olfactory usando métodos convencionais de odor-entrega no laboratório. Aqui, descrevemos um protocolo que analisa comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenetic simultânea de suas ORNs. A tecnologia de optogenetic usada aqui permite a especificidade da ativação de ORN e controle preciso de padrões temporais de ativação ORN. Correspondente movimento larval é controlado digitalmente gravado e analisado usando personalizado escrito software. Substituindo a estímulos de odor com estímulos de luz, esse método permite que para um controle mais preciso da ativação de ORN individual a fim de estudar o seu impacto no comportamento larval. Nosso método para estudar o impacto de neurônios de projeção de segunda ordem (PNs) bem como neurônios locais (LNs) no comportamento larval poderia, ser novamente prorrogado. Este método permitirá, assim, uma dissecação completa da função olfativa circuito e complemento estudos sobre atividades de neurônio olfatório como traduzir em respostas de comportamento.

Introdução

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Informação olfativa no ambiente da larva uma drosófila é detetada por apenas 21 ORNs funcionalmente distintos, as atividades de que, finalmente, determinar o comportamento larval1,2,3,4. No entanto, relativamente pouco é conhecido sobre a lógica pela qual informação sensorial é codificada nas atividades destas 21 ORNs. Assim, há uma necessidade de medir experimentalmente as contribuições funcionais de cada ORN larval de comportamento.

Embora o perfil de resposta sensorial do repertório inteiro de Dros....

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Protocolo

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1. construção de uma Arena de comportamento e preparação de Hardware para habilitar Optogenetic estimulação na Arena de comportamento

  1. Para construir uma arena de comportamento privado de luz, construir uma caixa com uma dimensão de 89 x 61 x 66 cm3 (L 35" x 24" W x 26" H) feito de chapas de acrílico de acrílico colorido preto (espessura de 3 mm) (ver Tabela de materiais). Materiais para construir uma caixa tão grande devem estar disponíveis em lojas de ferragem locais. Coloque esta caixa em uma mesa na sala de comportamento (Figura 1A).
  2. Monte uma câmera USB 3.0 CCD monocromá....

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Resultados

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Para demonstrar a especificidade da ativação de ORN, nosso método foi aplicado com sucesso para determinar o impacto de duas diferentes ORN (ORN::7a & ORN::42a) ativação (ORNs expressando ou Or7a ou Or42a) sobre o comportamento de larva (Figura 3). Consistente com estudos recentes daquele indivíduo ORNs larvas são funcionalmente distintos1,10,13, nossos dados rep.......

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Discussão

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Aqui, descrevemos um método que permite a medição do comportamento larval de Drosophila em resposta à ativação simultânea optogenetic dos neurônios olfativos. Descrito anteriormente larval de rastreamento métodos1,8 usar tecnologia de entrega de odor diferente para ativar ORNs. No entanto, esses métodos não podem controlar para a especificidade ou padrões temporais de ativação ORN. Nosso método supera esses défices usando estímulos de luz em vez de estím.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização da Universidade de Nevada, Reno e pelo NIGMS do Instituto Nacional de saúde, sob número de concessão GM103650 P20.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Câmera de vídeo para capturar o movimento larval
Câmera CCD Edmund Optics106215
M52 para M55Edmund Optics59-446
Suporte de Filtro de Rosca Quadrada de 2" para Lentes de Imagem Edmund Optics59-445
RG-715, 2" Sq.Edmund Optics46-066
Electronics para configuração optogenética
Raspberry Pi 2BRASPBERRY-PI.orgRPI2-MODB-V1.2
Fonte de alimentação programável de 3 canaisnewegg.com9SIA3C62037092
8 Relé de optoacoplador de canalamazon.com6454319
630nm Quad-row LED strip lightsenvironmentallights.comvermelho3528-450-reel
850nm LEDstrips environmentallights.comwp-4000K-CC5050-60x2-kit
Software 
MatlabMathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04Nubuntuhttps://github.com/yslo/nubuntu
Outros itens
Plexiglass acrílico pretoHome DepotMC1184848bl
Comida para moscas e outros reagentes
Comida para moscas NutriflyGenesee Scientific66-112
Agarose em póGenesee Scientific20-102
22cm X 22cm placa de Petri quadradaVWR Inc.25382-327
DMSOSigma-AldrichD2650
SacaroseSigma-Aldrich84097
Todos os trans-retinianosSigma-AldrichR2500
Moscas
UAS-IVS-CsChrimson  Bloomington Drosophila Stock Center55134
Orco-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center26818
Or42a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center9970
Or7a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center23907
Adaptador de Rosca de Filtro Filtro Longpass de 2"

Referências

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  1. Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
  2. Ramaekers, A., et al.

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