Artigo de método

Construindo Tioéter/sulfeto de vinil-amarrados induzida por peptídeos helicoidais Via foto Thiol-ene/ino Hydrothiolation

DOI:

10.3791/57356

⸱

1 de agosto de 2018

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Apresentamos um protocolo para a construção de vinil/Tioéter peptídeos helicoidais sulfeto-amarrados usando foto-induzido thiol-ene/thiol-ino hydrothiolation.

Resumo

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Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de peptídeos Tioéter-amarrados usando hydrothiolation em resina/intramolecular intermolecular thiol-ene. Além disso, este protocolo descreve a preparação de peptídeos de vinil-sulfeto-amarrados usando na solução intramolecular thiol-ino hydrothiolation entre amino acids que possuem cadeias laterais de alceno/alquino e resíduos de cisteína na eu, i + 4 posições. Peptídeos lineares foram sintetizados usando uma síntese do peptide de fase sólida baseada em Fmoc padrão (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation é realizado usando uma reação intramolecular thio-ene ou uma reação intermolecular thio-ene, dependendo do comprimento do peptide. Nesta pesquisa, é realizada uma reação intramolecular thio-ene no caso de peptídeos menores usando na resina desproteção dos grupos trityl de resíduos de cisteína, após a completa síntese do peptide linear. A resina é então definida como irradiação UV usando fotoiniciador 4-methoxyacetophenone (mapa) e 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). A reação intermolecular thiol-ene é realizada pela dissolução de Fmoc-Cys-OH em um solvente de N, N- dimetilformamida (DMF). Isto é então reagiu com o peptídeo usando o resíduo de alceno-rolamento na resina. Depois disso, o macrolactamization é executada utilizando Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) e 4-Methylmorpholine (NMM) como reagentes de ativação na resina. Após o macrolactamization, a síntese do peptide é continuou usando padrão SPPS. No caso do thio-ino hydrothiolation, o peptídeo linear é clivado da resina, seco e posteriormente dissolvido em DMF desgaseificado. Isto então é irradiado usando luz UV com fotoiniciador 2,2-dimetoxi-2-phenylacetophenone (DMPA). Após a reação, DMF é evaporado e o resíduo bruto é precipitado e purified usando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Esses métodos poderiam funcionar para simplificar a geração de péptidos cíclicos Tioéter-amarrados devido ao uso da química clique thio-ene/ino que possui tolerância superior grupo funcional e bom rendimento. A introdução de títulos Tioéter peptídeos aproveita-se da natureza nucleofílica de resíduos de cisteína e redox-inerte em relação a ligações de bissulfeto.

Introdução

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O desenvolvimento de ligantes para modular interações da proteína-proteína (PPIs) fornece uma abordagem atraente para descoberta de drogas modernas. Assim, uma grande quantidade de esforço tem sido investida em estudar modalidades chemical romance que podem eficientemente modular PPIs1,2,3. IPP consiste geralmente em superfícies de interação superficiais, grandes e/ou descontinuadas, e pequenas moléculas são normalmente consideradas ligantes impróprios para a modulação de PPIs4,5. Com uma adequada expostas interação superfície, peptides curtos que imitam as características estruturais das interfaces de proteína representam candidatos ideais para abordar este problema6,7. No entanto, peptides curtos são tipicamente não-estruturados em uma solução aquosa. Isto é devido ao fato de que as moléculas de água que competem com a rede de ligação de hidrogênio intramolecular da espinha dorsal do peptide e conformações bem-definidos são entropically desfavoráveis em água8. Além disso, os peptídeos inerentemente baixa estabilidade e propriedades de permeabilidade da célula, em grande parte, limitar seu uso em aplicações biológicas9,10. De acordo com a análise de banco de dados (PDB) de proteína, > 50% de IPP envolvem interações de α-hélice curta11. Assim, foram desenvolvidos métodos químicos diferentes em relação à estabilização da hélice. Estes incluem bissulfeto/Tioéter vínculo formação12,13,14, anel-fechamento metátese15, lactam anel formação16, "clique em" química17, adição de perfluoroarenes18,19e vinil-sulfureto formação20.

Peptídeos helicoidais estabilizados são amplamente utilizados para vários alvos intracelulares, incluindo p53, família proteínas do estrogênio receptores, Ras, BCL-2 e outros21,22,23,24. ALRN-6924, um hidrocarboneto-tudo grampeado inibidor duplo de peptídeo de MDM2 e MDMX, atualmente está sendo usado para investigações clínicas25. Nos últimos anos, nosso grupo tem focado o desenvolvimento de métodos de estabilização de peptídeo romance usando thiol-Eno e ino-tiol reações26,,27,28. Em geral, temos demonstrado que estas reações foto-iniciada são eficientes em condições suaves quando naturalmente abundante cisteína é usada. Além disso, mostramos que essas reações têm uma tolerância de excelente grupo funcional, são ortogonais-bio e tem sido provadas para ser aplicável para modificações de peptídeos e proteínas29. Os peptídeos de sulfeto amarrado Tioéter/vinil resultante em grande parte melhorar o espaço químico de peptídeos de restrição, fornecem um centro lábil em-baraço de modificação e provou para ser aplicável para usos em numerosas aplicações biológicas30 ,31,32. Até à data, apenas limitados relatórios têm sido descritos em relação a ciclização de peptídeo thiol-ene/thiol-ino. Em um estudo publicado por Anseth et al , em 2009, uma reação na resina intramolecular thiol-ene para ciclização de peptídeo entre alquenos ativados com cisteína foi demonstrada33. Em 2015, Chou et al. descreveu uma reação de dois componentes radicais tiol iniciados-ene para peptídeo grampeamento34 e uma reação de acoplamento de thiol-ino/ene subsequentes, sequencial35. Recentemente, nós descrevemos uma série de trabalhos baseados em vinil/Tioéter sulfeto amarrado peptídeos20,26,27. Este protocolo descreve uma síntese detalhada dos peptides sulfeto amarrado acima mencionados Tioéter/vinil na esperança que será útil para a comunidade de pesquisa mais ampla.

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Protocolo

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1. preparação do material

  1. Para o aparelho manual do peptide-síntese, coloca um distribuidor de vácuo (Tabela de materiais) em uma coifa eficiente. Em seguida, colocar torneiras de três vias para o distribuidor de vácuo e conectá-los a uma linha de gás nitrogênio ou argônio. Cap todas as entradas não utilizadas, usando os septos de borracha.
  2. Ligar colunas cheias de resina (0,8 x 4 cm, 10 mL de reservatório, consulte Tabela de materiais) para o distribuidor usando as torneiras de três vias (Figura 1). Use uma bomba conectada a um sistema de vácuo como filtração de vácuo ou uma lâmpada de pipeta de borracha por extrusão para remover o solvente nas colunas.
  3. Uso um photoreactor (Figura 2), equipados com lâmpadas de dez 350 nm (Tabela de materiais) para irradiação UV. Conecte estes a um tanque de gás argônio através da entrada de ar de photoreactor para garantir que o photoreactor é preenchido com gás argônio antes e durante as photoreactions.
  4. Antes de ligar a lâmpada de UV da photoreactor, certifique-se de que a porta de photoreactor é fechada no caso de irradiação da luz UV.

2. preparação da resina

Nota: em geral, a construção de substratos de peptídeo é executada utilizando protocolos de síntese do peptide de fase sólida baseada em Fmoc. Estas são realizadas usando a resina de amida de pista que deixa uma C-terminal Amida restantes seguinte peptídeo clivagem. Este protocolo é usado em todo o papel.

Cuidado: N, N- dimetilformamida (DMF), diclorometano (DCM), 4-methylmorpholine (NMM) e N, N- diisoproylethylamine (DIPEA) são tóxicos e nocivos por inalação, ingestão ou contacto com a pele. Éter etílico é altamente inflamável. Ácido trifluoroacético (TFA) é corrosivo. 1,2-Etanoditiol (EDT) é altamente malcheirosa. Portanto, todos os solventes orgânicos e produtos químicos devem ser manuseados com equipamento de protecção adequado (luvas de nitrilo, jaleco e óculos de protecção) e manipulados dentro de uma coifa de química.

  1. Calcule a quantidade de resina necessária usando a seguinte fórmula:
    escala (mmol) / (resina capacidade de carregamento (mmol/g) 1.000 (mg/g)) = massa de resina (mg)
    Por exemplo, a quantidade de pista Amida MBHA resina (0,5 mmol/g) para 25 µmol = 0.025 mmol / (0,5 mmol/g 1.000 mg/g) = 50 mg. Em seguida, pesar 50 mg de resina em uma coluna e configurá-lo em um tubo de vácuo usando torneiras de três vias.
  2. Adicione 1-2ml de DCM para a resina em uma coluna (0,8 x 4 cm, reservatório de 10 mL). Para inchar a resina, agite suavemente usando um fluxo de nitrogênio ou argônio por 10 min. Em seguida, remova o solvente usando filtragem de vácuo.

3. lavagem e desproteção Fmoc N-terminal

  1. Preparar o Fmoc N-terminal deprotecting solução: prepare um volume adequado (200 mL) de 50% (v/v) morfolina em DMF num frasco de vidro.
  2. Adicionar 1 a 2 mL da solução de desproteção à resina, delicadamente agite-a por 10 min e em seguida, drenar a solução usando um vácuo. Usando DMF (1-2 mL) e DCM (1-2 mL) nessa ordem, lave a resina e o recipiente de reação completamente para um total de 3 x. Em seguida, repita os procedimentos de desproteção e lavagem 1 x.

4. Fmoc protegido aminoácido acoplamento

  1. Usando o acoplamento de resíduo de alanina como um exemplo, no caso de uma síntese de 25 µmol-escala manual, pesar Fmoc-Ala-OH (equiv. 5, 41,4 mg), Hexafluorofosfato de 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium (HCTU; 4,9 equiv, 50,5 mg) em um recipiente de polipropileno e dissolvê-lo em DMF (0,5 mL).
  2. Adicionar DIPEA (10 equiv, 43,5 µ l) a fim de gerar um 0,25 M ativado solução de aminoácido (tabela 1). Seguindo uma pré-ativação aproximada de 1 minuto, adicionar a solução para a resina, e em seguida como bolha-com N2 para aproximadamente 1-2 h.
  3. Desta etapa em, incorporar cada aminoácido da cadeia peptídica como uma sequência de etapas: primeiro a desproteção de Fmoc-Grupo N-terminal e então a lavagem, seguido da junção de aminoácidos através da ativação usando o HCTU.
    Nota: Um acoplamento tempo (EG., h 2) recomenda-se acoplamento na sequência de um resíduo de aminoácido impedido estericamente [EG., Fmoc-Thr (tBu) - OH, Fmoc-Cys (Trt) - OH, Fmoc-His (Trt) - OH, Fmoc-Arg (Pbf) - OH]. O alceno/alquino rolamento antinatural aminoácidos são utilizados em 3 equivalentes ao invés de 5 e são deixados a reagir durante 3 h.
  4. Monitorar o progresso de síntese do peptide usando testes de Kaiser ou Cloranil conforme descrito por Arora et al . 36 estes testes fornecem avaliações qualitativas da presença ou ausência de livre aminas primárias e secundárias. Alternativamente, aproximadamente 2-3 mg do peptide pode ser clivada da resina e analisado por LC-MS.

5. tiol-ene Hydrothiolation e ciclização Thiol-ino

  1. Construa o vinculador Tioéter com ciclização na resina (Figura 3).
    1. Prepare-se aproximadamente 50 mL da solução de desproteção de Trt (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0). Tratar a Cys - e mS5-rolamento resina [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys (Trt)-R'-resina, mg 50] com 1-2 mL da solução de desproteção de Trt em uma coluna de 10 mL. Suavemente agite a solução durante 10 minutos usando N2. Finalmente, lave-o com DCM (1-2 mL) para um total de 3 x.
      Nota: MS5 representa o bloco de construção de Alquileno-rolamento (veja a estrutura representada na Figura 6) usado para peptídeo acoplamento e thio-ene ciclização38.
    2. Repita o procedimento descrito acima, para um total de aproximadamente 6 x, a fim de remover o grupo de proteção trityl de cisteína, até a cor da solução não é mais amarela.
    3. Borbulhava com N2, lavar a R-mS5- uma-A-A-Cys(-SH)-R'-resina [cisteína com thio livre (-SH)] com DMF (1-2 mL) e DCM (1-2 mL), nessa ordem. Encolher a resina usando metanol (1-2 mL) por 2 min e remova o solvente usando filtragem. Em seguida, sequencialmente seca a resina sob um vapor de gás de2 N por aproximadamente 5 min na coluna.
    4. Prepare DMF desgaseificado antes, dentro de um frasco de boca, borbulhar gás nitrogênio para cerca de 1 h, através de uma agulha longa que foi esticada em solvente.
    5. Transferi a resina em um balão de fundo redondo de 10 mL por papel de pesagem. Suspender a resina em 2 mL do DMF desgaseificado, seguido pela adição de 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone o fotoiniciador (MMP; 1 equiv, 5,6 mg), 4-methoxyacetophenone (mapa; 1 equiv, 3,8 mg).
    6. Adicionar uma celeuma bar (0,3 cm) para o frasco e tampa do frasco com um plug de borracha adequada e, em seguida, deslocar o ar no balão com gás de nitrogênio, usando uma bomba de óleo.
      Nota: A atmosfera inerte não é estritamente necessária para a é eficaz thio-ene em uma fase sólida. No entanto, é muito necessário para o thio-ino é na fase de solução na Figura 5. Caso contrário, o enxofre irá oxidar durante a irradiação UV.
    7. Definir o balão de reação para o photoreactor e misture a resina por 1h sob irradiação UV à temperatura ambiente (Figura 2).
      Cuidado: Antes de ligar a lâmpada de UV photoreactor, certifique-se que a porta de photoreactor é fechada no caso de irradiação prejudicial da luz UV.
      Nota: Com frequência de amostragem a mistura de reação durante os photoreactions é recomendado para novas sequências, como o precursor do peptídeo linear tem o peso molecular idêntico do produto. Em geral, lineares e cíclicos de peptídeos exibem Hidrofilia significativamente diferente. Isto pode ser facilmente identificado usando HPLC. Alternativamente, a 5, 5' - dithiobis-(ácido 2-nitrobenzoic) reagente (DTNB) também pode ser usado para estudar a presença de tiol livre37.
    8. Transferir a resina do recipiente a coluna e remova o solvente usando filtragem de vácuo. Lave e seque a resina conforme descrito na etapa 5.1.3.
    9. Prepare-se cerca de 10 mL da clivagem cocktail (TFA/dicas/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) na coifa.
    10. Transferir a resina em um recipiente de polipropileno de 2 mL, adicionar 1 mL de clivagem cocktail (TFA/dicas/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) ao contêiner e selar o recipiente firmemente usando uma tampa de rosca. Em seguida, delicadamente agite o recipiente em um agitador orbital a uma velocidade de 60 rpm na coifa para 1,5 a 2 h.
      Atenção: O TFA é altamente corrosivo. Utilizar vestuário de protecção e trabalhar em uma coifa eficiente. EDT é uma substância altamente malcheirosa e deve ser manipulado em uma coifa eficiente.
    11. Remova o coquetel TFA por evaporação sob um fluxo de gás de2 N na coifa. Em seguida, precipitar o resíduo usando éter dietílico frio (1 mL) por 30 s e isolar isso através de centrifugação a 12.000 x g por 2 min. Após a centrifugação, delicadamente despeje o componente de éter. Repita as etapas de precipitado e centrifugação para 2x. Evapore o resíduo à secura.
    12. Finalmente, dissolver o resíduo em 1 mL de H2O e acetonitrilo (2:1) e purificar por HPLC usando uma coluna analítica C18 (4,6 x 250 mm, taxa de fluxo de 1,0 mL/min). Uso de H2O (contendo 0,1% TFA) e acetonitrila pura como solventes em um gradiente linear de 2%/min de 20% para 70% acetonitrila sobre espectros de Monitor HPLC 25 min. usando UV 280 nm e 220 nm comprimentos de onda (tabela 2).
  2. Construa o vinculador Tioéter através de reação intermolecular thio-ene e, em seguida, cyclize o peptídeo por macrolactamization (Figura 4).
    1. Sintetizar o resíduo de Alquileno tendo o peptídeo linear H2N-A-A-A-mS5(2-R ')-R'-resina (50 mg) usando a síntese do peptide de fase sólida baseada em Fmoc padrão (SPPS) conforme descrito nos passos 2-4. Em seguida, lavar e secar a resina, conforme descrito na etapa 5.1.3.
    2. Suspenda a resina em um balão de fundo redondo de 10 mL contendo 2 mL do DMF desgaseificado, conforme descrito na etapa 5.1.4.
    3. Adicionar o fotoiniciador MMP e mapa (MMP: 1 equiv, 5,6 mg; MAPA: 1 equiv, 3,8 mg), Fmoc-Cys-OH (equiv. 3, 25,7 mg) e uma celeuma bar (0,3 cm) para o balão. Tampe o balão usando um plug de borracha adequada e então usar a bomba de óleo para substituir o ar no frasco com nitrogênio.
    4. Defina o balão de reação para o photoreactor. Mexa por 1-2 h sob irradiação UV, à temperatura ambiente (Figura 2).
    5. Monitorar a reação sob uma análise de LC-MS: cleave 2-3 mg de resina usando o coquetel de clivagem. Então precipitar o resíduo com éter dietílico frio (300 µ l), isolar o resíduo por centrifugação e evaporar o resíduo à secura, conforme descrito na etapa 5.1.11. Depois disso, dissolva o resíduo em 100 µ l de H2O e acetonitrilo (2:1). Filtrar a solução de peptídeo usando uma película microporous de 0,22 µm e analisá-lo usando LC-MS com o composto ionizado na ionização electrospray (ESI) e operado no modo positivo.
    6. Se necessário, repito os passos 5.2.2 - 5.2.4 para assegurar a reação é realizada para conclusão.
    7. Após a conclusão da foto-reação, transferir a resina do recipiente a coluna e remova o solvente usando filtragem de vácuo. Lave e seque a resina conforme descrito na etapa 5.1.3.
    8. Adicionar a solução DMF de Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBob; 2,4 equiv, 31,2 mg), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt; 2,4 equiv, 8,1 mg) e o NMM (4 equiv., 11 µ l) para a resina na coluna para o macrolactamization. Bolha esta solução com N2 por 2 h.
      1. Além disso, monitore esta reação de acoplamento utilizando LC-MS, conforme descrito na etapa 5.2.3. Se necessário, repita esta etapa para assegurar a reação é realizada para conclusão.
    9. Alongar o peptídeo usando padrão SPPS Fmoc-baseado conforme descrito nas etapas 3 e 4.
    10. Após a montagem de todos os resíduos de aminoácidos, cleave o peptídeo da resina, conforme descrito nas etapas 5.1.10 e 5.1.11 e purificá-la conforme descrito na etapa 5.1.12.
  3. Construa o vinculador de sulfeto de vinil em fase de solução (Figura 5).
    1. Sintetiza o resíduo de alquino rolamento linear do peptide usando padrão SPPS Fmoc-baseado como descrito nos passos 2-4. Sintetiza o alquino rolamento aminoácidos de acordo com um protocolo bem estabelecido, conforme descrito no estudo anterior20.
    2. Cleave o peptídeo da resina e usando o frio éter dietílico, conforme descrito nas etapas 5.1.9 - 5.1.11 precipitar. Após a clivagem e a precipitação da resina, colete o peptídeo usando centrifugação a 12.000 x g por 2 min.
    3. Seca o resíduo resultante em um vácuo. Dissolver o resíduo em DMF o libertos (50 mL) em um balão de fundo redondo de 100 mL para atingir uma concentração final de 0.5 mM (com base na carga da resina, 0.025 mmol (1000 mL/L / 0.5 mmol/L) = 50 mL).
      1. Adicionar o fotoiniciador DMPA (0,5 equiv, 3,2 mg) e em seguida desgaseificar a solução de reação para 10 min usando N2 através de uma agulha longa, esticada na solução. Em seguida, irradiar a amostra sob UV luz à temperatura ambiente para 0,5 - 1 h sem agitação.
    4. Remover o DMF de alto vácuo e precipitar o resíduo bruto acrescentando éter dietílico para dissolver seus derivados orgânicos. Em seguida, isole o resíduo usando centrifugação a 12.000 x g por 2 min. Após a centrifugação, delicadamente despeje o componente de éter. Evapore o resíduo à secura. Finalmente, dissolver o resíduo em 1 mL de H2O e acetonitrilo (2:1) e purificá-la usando HPLC conforme descrito na etapa 5.1.7.

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Resultados

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Os espectros HPLC e MS do peptide Ac-Aderson5AAAC-NH2 e seu produto ciclizada Ac - Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] - NH2 que foram gerados usando o é em resina intramolecular thiol-ene são retratados em Figura 6B. O peptídeo cíclico foi encontrado para ter um peso molecular idêntico em relação ao seu precursor linear. No entanto, observou-se seu tempo de retenção HPLC para ser aproximadamente 2 min mais cedo do que de seus ...

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Discussão

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Na ciclização em resina intramolecular thio-ene descrita na Figura 3, a remoção do grupo trityl de um resíduo de cisteína foi encontrada para ser um passo fundamental para a posterior é. Além disso, o peso molecular de peptídeo antes e seguintes, que a reação foi encontrada para ser idênticos como representado na Figura 6B. Portanto, o uso de uma identificação de HPLC ou um ensaio DTNB é necessário para monitorar a reação. No caso da reação intermolecular thio-e...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores reconhecem apoio financeiro por parte da ciência Natural da China subsídios da Fundação (n. º 21372023, 21778009 e 81701818); o Ministério da ciência e tecnologia da República Popular da China (n. º 2015DFA31590); a ciência de Shenzhen e tecnologia inovação Comitê (n. º JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 e GJHS20170310093122365); e a Fundação de ciência Postdoctoral China (n. º 2017 M 610704).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Resina MBHA de amida de pista (0,53 mmol / g)HECHENGGRM50407
Aminoácidos protegidos com Fmoc padrãoGL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Metil-2-pirrolidinonaShenzhen endi Biotechnology Co.Ltd.3230
N,N-Dimetilformamidanocivo à pele EnergiaB020051prejudicial à pele
DiclorometanoEnergiaW330229
N,N-Diisoproiletilaminaprejudicial à pele Aldrich9578irritante
Ácido trifluoroacéticoJ& K101398corrosivo
TriisopropilsilanoJ& K973821
1,2-EthanedithiolJ& K248897Fedor
2-(6-Cloro-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilamônio hexafluorofosfato GL Biochem (Xangai) Ltda.
MorfolinaAldrichM109062irritante
Éter dietílicoAldrich673811inflamável
AcetonitrilaAldrich9758toxicidade
MetanolAldrich9758toxicidade
2-hidroxi-1-[4-(2-hidroxietoxi)-fenil]-2-metil-1-propanonaEnergiaA050035
4-metoxiacetofenonaEnergiaA050098
2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenonaEnergiaD070132
5,5'-Dithiobis-(ácido 2-nitrobenzóico)J& K281281
Benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfônio hexafluorofosfatoEnergiaE020172
1-hidroxibenzotriazolEnergiaD050256
4-metilmorfolinaEnergiaW320038
Cromatografia líquida de alto desempenhoSHIMADZULC-30AD
Massa de ionização por eletrospraySHIMADZULCMS-8030
LiofilizadorLabconcoFreeZone
Sistema de concentração SpeedVacThermoSavant
manifold de vácuopromegaA7231
torneiras de três viasBio-Rad7328107
colunas de cromatografia poli-preparativa Bio-Rad7311550
851012

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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