Geração de um grande número de progenitores mieloides e células dendríticas precursores de murino medula óssea usando um celular romance classificação estratégia

Summary

Aqui nós fornecemos um método para identificar e isolar um grande número de GM-CSF dirigido pilhas myeloid usando a classificação de células de alta velocidade. Cinco populações distintas (comuns progenitores mieloides progenitoras granulócitos/macrófagos, monócitos, macrófagos derivados de monócitos e DCs derivados de monócitos) podem ser identificadas com base na expressão Ly6C e CD115.

Abstract

Culturas de derivados de monócitos células dendríticas (moDC) geradas a partir da medula óssea de rato usando colônia Granulócito-macrófago estimulando Factor (GM-CSF) têm sido reconhecidas recentemente para ser mais heterogêneo do que anteriormente apreciado. Essas culturas rotineiramente contêm moDC também derivados de monócitos macrófagos (moMac) e até mesmo alguns menos desenvolvidas células como monócitos. O objetivo do presente protocolo é fornecer um método consistente para identificação e separação dos diversos tipos de célula presentes nestas culturas como desenvolvem, para que suas funções específicas podem ser mais investigadas. A estratégia de classificação apresentada aqui separa células primeiro em quatro populações com base na expressão de Ly6C e CD115, ambos os quais são expressas transitoriamente pelas células desenvolvem-se na cultura de GM-CSF-driven. Essas quatro populações incluem comuns progenitores mieloides ou CMP (Ly6C, CD115), progenitores de granulócitos/macrófagos ou GMP (Ly6C +, CD115-), monócitos (Ly6C +, CD115 +) e macrófagos derivados de monócitos ou moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c também é adicionado para a estratégia de classificação para distinguir duas populações dentro da Ly6C-, CD115-população: CMP (CD11c-) e moDC (CD11c +). Finalmente, duas populações podem distinguir ainda mais dentro da Ly6C-, CD115 + população com base no nível de classe de MHC expressão II. MoMacs express níveis inferiores de MHC-classe II, enquanto um precursor de DC derivados de monócitos (moDP) expressa a maior classe de MHC II. Este método permite o isolamento confiável de várias populações distintas desenvolvente em números suficiente para uma variedade de análises funcionais e do desenvolvimento. Destaca-se uma tal leitura funcional, as diferenciais respostas estes tipos de células a estimulação com Pathogen-Associated padrões moleculares (PAMPs).

Introduction

Cultivo de células de medula murino com a citocina fator de estimular colônia granulócitos-macrófagos (GM-CSF) é amplamente utilizado como um método para gerar células dendríticas derivadas de monócitos (moDC; também conhecido como DC inflamatória) em grande número ^{1, 2,3,4,5}. Estas células têm sido extremamente útil em uma variedade de estudos de células dendríticas (DC) função ^6,7,8. Normalmente, estas células d....

Protocol

Todo o trabalho animal foi aprovado pelo Comitê de uso e Auburn University institucional Cuidado Animal em conformidade com as recomendações descritas no guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório do institutos nacionais da saúde.

1. preparação para coleta de medula óssea

1. Preparar a mídia completa 250 mL pela adição de uma solução de meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com soro fetal bezerro de 10%, glutamina 2 mM e 50 µM 2-Mercaptoetanol ao topo de uma unidade de balão de vácuo filtro µm 0.22 e aplicar vácuo.
   Nota: O meio completo pode ser armazenado a 4 ° C por até 2 meses.
2. Pr....

Results

Em um esforço para manter tantos canais disponíveis para análise como células viáveis, possíveis rotineiramente foram selecionados com base na dispersão para a frente e lateral, excluindo eventos muito pequenos e muito granulares (um portão típico é aplicado a todos o ponto parcelas na figura 1A). Para determinar se esta estratégia associada confiantemente excluído as células mortas, nós manchada com o 7-Amino actinomicina D (7-AAD) (figu.......

Discussion

Este protocolo facilita o isolamento de GM-CSF-driven progenitor e precursor tipos de células em número suficiente para vários tipos de análises, incluindo ensaios bioquímicos, ensaios de função celular em vitro, ou instilação em vivo. Este método representa um avanço significativo no campo do desenvolvimento de células dendríticas derivadas de monócitos, permitindo o isolamento confiável e identificação de células no início deste caminho do desenvolvimento, bem como os tipos de células diferenciadas, m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS)	HyClone	SV30014.04	para complementar o meio completo e FWB
GlutaMAX	Gibco	35050	para suplementar o meio completo
2-mercaptoetanol (2-ME)	MP Biomedical	190242	complementar o meio completo
75 mM Filtro de Vácuo	Thermo Scientific	156-4045	para esterilizar meios completos
ACK Lysis Buffer	Lonza	10-548E	para lisar glóbulos
vermelhos HBSS tampão	Corning	21-020-CM	para resgatar leucócitos após lise de glóbulos
vermelhos Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's	Lonza	17-512F	deve ser livre de endotoxinas; resfriado a 4 ° C
35 µ m Filtro de células	Falcon	352235	para quebrar aglomerados antes de passar pelo citômetro.
GM-CSF	Biosource	PMC2011	concentração utilizável de 10 ng/mL
Placa tratada com cultura de tecidos	VWR	10062-896	para células da medula óssea após a colheita
Anti-Ly6C, Clone HK1.4	Biolegend	128018
Anti-CD115, Clone AFS98	Tonbo Bioscience	20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3	BD Biosciences	557400	para diferenciar CMP e MoDCs
MoFlo XPD Citômetro de Fluxo	Beckman Coulter	ML99030
BD Accuri C6	BD Biosciences	660517
100% Etanol	Pharmco-Aaper	111000200CSPP
60 mm Placa de Petri	Corning, Inc	353002
Tubo cônico de 50 mL	VWR	21008-242
C57BL/6 Camundongos	The Jackson Laboratory	000664	10-20 semanas de idade
Seringa de 10 mL
agulha de 23 G	BD Biosciences	305145
R	eppendorf	22625501
FlowJo Software v10	BD Biosciences	Versão 10	flowjo.com