Uso prático da interferência do RNA: Oral entrega de RNA Double-stranded em lipossomas transportadoras para baratas

RNAi tem sido demonstrado como um método eficaz para a expressão do gene "knockdown" através de um mecanismo de uma via de silenciamento pós-transcricional desencadeada por moléculas de dsRNA em muitos eucariotos¹. Durante a última década de estudo, RNAi tornou-se uma ferramenta útil para estudar as funções dos genes de desenvolvimento para o comportamento por esgotar a expressão de genes específicos, através da injeção e/ou alimentação do dsRNA em vários táxons de insetos^2,3. Devido a especificidade e a robustez do efeito de esgotamento, a aplicação de RNAi atualmente está sendo considerada como uma estratégia potencial para controle de pragas de gestão^4,5. No entanto, a eficiência de RNAi varia amplamente entre as espécies de insetos, consoante os diferentes genes alvo e os métodos de entrega. Um corpo crescente de evidências sugere que a instabilidade do dsRNA, que é degradada por ribonucleases, é um fator crítico na eficácia limitada de RNAi^5,6. Por exemplo, a baixa sensibilidade de RNAi em Manduca sexta foi explicada pelo fato de que o dsRNA misturado com hemolinfa foi rapidamente degradado dentro de 1 hora,⁷. Da mesma forma, a presença de nucleases alcalinas no intestino, que eficientemente degradar dsRNA ingerido, é fortemente correlacionada com baixa eficiência de RNAi em diferentes ordens de insetos^8,9,10.

A entrega oral de dsRNA é particularmente interessante para a aplicação de RNAi em uma estratégia de controle de pragas, mas um método para retardar a degradação do dsRNA pelas nucleases no intestino ainda não foi desenvolvido, que teria potencial para assegurar a eficaz RNAi através da alimentação. No entanto, a apatia de RNAi para entrega oral do dsRNA foi relatada por alimentação grande quantidade de dsRNA, por exemplo, 50 µ g/ml Bombyx mori, ou continuamente alimentando por 8 dias (8 µ g dsRNA no total) das espécies de gafanhoto. A baratinha, Blattella germinica, é altamente sensível a RNAi através da injeção de dsRNA^11,12,13,14, mas não é responsiva ao dsRNA através da alimentação. Recentemente, Lin et al. (2017) demonstraram que o dsRNA encapsulados com resultados de transportadoras em lipossomas em RNAi bem sucedida a nocaute a expressão do gene α-tubulina no intestino e gatilho mortalidade significativa da baratinha¹⁵. Como a degradação do dsRNA no intestino é o fator limitante para RNAi oral, os portadores de lipossoma servem como um veículo para proteger dsRNA de degradação, que é facilmente aplicável em outros insetos com atividades de nuclease forte no intestino. Digno de nota, o motivo para a escolha do reagente de transfeccao particular (ver Tabela de materiais) usamos como portador de lipossomas no atual protocolo é que ele foi testado para transfeccao de linha celular inseto com menor toxicidade, de acordo com o instruções do fabricante. De acordo com a comparação dos sistemas de transfeccao lipossoma diferentes no guerreiro et al (2013) ¹⁶, a eficiência do transfecting RNA de interferência pequeno (siRNA) é aproximadamente o mesmo entre este e a outros sistemas disponíveis comercialmente que têm sido utilizados para sistemas de entrega dsRNA em outros insetos^17,18 . Além disso, nosso método de alimentação é cuidadoso o suficiente para garantir a quantidade adequada de dsRNA é ingerida por cada barata, e que os resultados são robustos e confirmado. Em resumo, o presente protocolo e os resultados demonstram que usar dsRNA lipoplexes melhora a estabilidade do dsRNA e abre as portas para o design da entrega oral estratégia de RNAi, que é uma abordagem promissora para controle de pragas no futuro.

1. síntese e preparação do dsRNA

1. Identifica os sites de destino do dsRNA da região untranslated 3' do gene-alvo. O dsTub é usado para o direcionamento do gene da α-tubulina (banheira) (número de adesão GenBank: KX228233), e dsEGFP como um controle negativo dsRNA destina-se a sequência de melhor proteína fluorescência verde (EGFP; Número de adesão GenBank: LC311024).
2. Executar a amplificação por PCR padrão para sintetizar os modelos dsRNA com primers de gene-específico que contém a sequência de promotor T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). As condições de amplificação do PCR e informações de primeira demão usados são aqueles relatados por Lin et al. (2017) ¹² (ver Tabela de materiais).
3. Prosseguir com a preparação do dsRNA usando uma transcrição de T7 Kit (veja a Tabela de materiais), seguindo as instruções do fabricante.
   Nota: Para produzir quantidade elevada dsRNA, misture duas reações em um tubo (no total 40 µ l) e incubar a 37 ° C durante a noite.
4. Adicionar 2 µ l de DNase (ver Tabela de materiais) em amostras de dsRNA por 15 min a 37 ° C para digerir modelos de DNA.
5. Adicionar o reagente de extração 200 µ l (veja a Tabela de materiais) e clorofórmio 40 µ l, então o vórtice.
6. Centrifugar durante 10 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, recolher o sobrenadante (150 µ l) em um novo tubo de microcentrifugadora.
7. Precipitar dsRNA adicionando 150 µ l isopropanol e incubar por 15 min no gelo.
8. Centrifugar por 15 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, remover o sobrenadante.
9. Adicione 200 µ l de etanol 70% para lavar dsRNA Pelotas. Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C.
10. Remover o etanol e repita as etapas de lavagem do etanol.
11. Remover o etanol e o pellet seco dsRNA por concentradores centrífugos de vácuo por 3 min, em seguida, resuspenda dsRNA com água livre de RNase.
12. Determinar a quantidade do dsRNA purificada usando um espectrofotômetro UV-Vis de micro-volume (ver Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante e ajustar para a concentração desejada (por exemplo, 0,25 µ g / µ l para a preparação de lipoplexes dsRNA).
13. Armazene as amostras de dsRNA a-20 ° C por até 3 meses.

2. preparação do dsRNA Lipoplexes

1. Dilua 4 µ l de reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais), adicionando 4 µ l de solução de glicose 5%. Dilua 4 µ l do dsRNA (1 µ g), adicionando 4 µ l de solução de glicose 5%.
2. Adicione a solução de reagente diluído em lipossomas imediatamente na solução diluída dsRNA tudo de uma vez. Vórtice brevemente para misturá-los e, em seguida, incube por 15 min a 25 ° C.
   Nota: Não misture as soluções na ordem inversa.
3. Os dsRNA lipoplexes estão prontas para uso. Use dentro de 1 hora de preparação e descartar depois de 1 hora.
   Nota: De acordo com as instruções do fabricante, os lipoplexes deve ser usado logo que possível.

3. coleção de enzimas extracelulares de hemolinfa e suco Midgut

1. Inseto tampão salino (estoque de x 10)
   1. Misture 900 mL de água bidestilada com 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl, 6,3 g de CaCl₂e 8,3 g MgCl₂·6H₂O.
   2. Ajustar o pH para 6,8 e preencher até 1.000 mL.
2. Coleção de hemolinfa
   1. Anestesia as baratas no gelo até que eles não se movem por 3 min.
   2. Segurar a barata com dois dedos (polegar e dedo indicador) e aparece do lado ventral da barata.
   3. Use a dissecação tesoura para cortar a ponta de uma coxa de uma pata traseira.
      Nota: Corte o cruzamento conectado entre a coxa e o trocânter. A excisão da outra parte da coxa foi menos eficiente para coletar a hemolinfa.
   4. Aperte o abdômen suavemente com o dedo médio e recolher a hemolinfa sangramento da incisão com uma micropipeta de 10 µ l.
   5. Piscina a hemolinfa de várias baratas (5 pessoas) em um tubo de microcentrifugadora.
      Nota: Manter os tubos microcentrifuga no gelo para evitar melanização. O volume médio de hemolinfa obtido de uma barata masculina é 2-3 µ l.
   6. Spin para baixo a hemolinfa brevemente com uma centrífuga de bancada de 10 s.
   7. Transferir o volume desejado de hemolinfa (ou seja, 10 µ l) e misturá-lo com 50 µ l de tampão salino inseto 1 de x.
   8. Centrifugação por 10min a 1.000 x g a 4 ° C a girar para baixo hemócitos. Transferi o sobrenadante para um tubo limpo microcentrifuga.
   9. Quantificar a concentração de proteína total usando um espectrofotômetro UV-Vis de micro-volume medindo A280¹⁵.
   10. Ajuste cada amostra para ter a mesma concentração de proteína (6 mg / µ l de proteínas totais).
3. Coleção de suco do intestino
   1. Anestesia as baratas no gelo. Arrumar as baratas lado ventral na placa de dissecação com insetos tampão salino de frio 1x usando pinos de insetos.
   2. Disse o abdômen com uma pinça fina. Remova o intestino inteiro (incluindo o intestino frontal, meados e patas traseiro) para um prato fresco com 1x tampão salino de insetos.
   3. Remover o intestino dianteiro e traseiro e transferir rapidamente o intestino para um tubo de microcentrifugadora que contém o tampão salino inseto de 100 µ l.
   4. Piscina do midguts de seis baratas no mesmo tubo e vórtice por 10 s.
   5. Centrifugação por 10min a 1.000 x g a 4 ° C a girar para baixo o hemócitos e tecidos do intestino. Transferi o sobrenadante para um tubo limpo microcentrifuga.
   6. Quantificar a concentração de proteína total usando um espectrofotômetro UV-Vis de micro-volume medindo A280¹⁵.
   7. Ajuste cada amostra para ter a mesma concentração de proteína (6 mg / µ l de proteínas totais).

4. dsRNA ensaio de degradação

1. Recentemente a preparar 4 µ l do dsRNA nua ou lipoplexes dsRNA (1 µ g).
2. Misture dsRNA enzimas de soluções com 10 µ l de tampão salino de insetos (controle), extraídas de hemolinfa, ou intestino suco.
3. Adicione 2 µ l de EGTA (20mm) ou água livre de RNase para separar amostras como controles para inibição de actividades enzimáticas.
4. Incubar durante 1 hora ou mais (6, 12 ou 24 horas) a 25 ° C.
5. Adicione 200 µ l extração reagente e clorofórmio 40 µ l, então o vórtice.
6. Centrifugar durante 10 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, recolher o sobrenadante (150 µ l) em um novo tubo de microcentrifugadora.
7. Precipitar dsRNA adicionando 150 µ l isopropanol e incubar por 15 min no gelo.
8. Centrifugar por 15 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, remover o sobrenadante.
9. Adicione 200 µ l de etanol 70% para lavar dsRNA Pelotas. Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C.
10. Remover o etanol e repita as etapas de lavagem do etanol.
11. Remova o etanol e o pellet seco dsRNA por concentradores de vácuo centrífugas para 3 min. Ressuspender dsRNA com água livre de RNase a µ l 10.
12. Verificar a integridade do dsRNA Tratado através de eletroforese em gel em um gel de agarose 1,5%.

5. oral administração do dsRNA

1. Manter as baratas em uma dieta ad libitum do alimento seco (comida). Priva o abastecimento de água desde as baratas um dia antes experimentos de ingestão do dsRNA.
2. Segure uma barata, agarrando suas asas com as pinças flexíveis (Figura 1, passo 5).
   Nota: Não pegue as partes do corpo das baratas.
3. Prepare o dsRNA lipoplexes, bem como dsRNA nua, para a alimentação, conforme descrito na seção 2.
   Nota: O dsRNA lipoplexes deve ser preparado na hora antes da alimentação.
4. Alimentar 4 µ l de lipoplexes dsRNA ou nu dsRNA (250 ng) com uma micropipeta.
5. Lentamente, pipetar a gota da solução dsRNA perto o aparelho bucal de baratas e deixe as baratas ingerir a gota completamente.
6. Realizar os experimentos de ingestão de duas vezes por dia (1h Após luzes acesas e 1h antes de luzes apagadas) por 8 dias ou 16 dias continuamente.
   Nota: Todas as baratas adquiriram água apenas através de alimentação manual com reagentes dsRNA solução ou controle (por exemplo, água livre de nuclease, solução de glicose e reagente lipossoma) durante experimentos de ingestão.
7. Fornecem garrafas de água para as baratas após 16 dias de ingestão das experiências de dsRNA.

6. avaliar Knockdown

1. No tempo escolhido pontos (2, 9 e 17 dias depois do ensaio de ingestão do dsRNA), coletar os insetos dsEGFP - e dsTub-tratada e dissecar os tecidos escolhidos (por exemplo, intestino).
2. Realize o PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). As condições de amplificação de qRT-PCR e informações da primeira demão, conforme relatado por Lin et al. (2017) ¹².
3. Avalie o controle e o dsRNA-tratados insetos diariamente para verificar a mortalidade e remover as baratas que já não se move.

Um esquema simplificado do protocolo de entrega oral do dsRNA é apresentado na Figura 1, onde as principais etapas para a preparação dos lipoplexes dsRNA são mostradas.

A fim de investigar a protecção dada pelas transportadoras em lipossomas em cima dsRNA degradação no suco de intestino de b. germanica, um ensaio ex vivo , onde foi realizado o dsTub lipoplexes foram incubados com suco de intestino e a integridade do dsRNA posteriormente foi analisada em um gel de agarose 1,5%. A Figura 2 mostra que forte atividade de nuclease RNA estava presente no suco de intestino de b. germanica (Figura 2),Considerando que as transportadoras de lipossomas foram capazes de proteger dsRNA contra degradação pelo menos por 1 hora no ex vivo incubação (Figura 2A, B). Como resultado, a ingestão oral de dsRNA lipoplexes foi aplicada duas vezes por dia para aumentar a susceptibilidade dos tecidos do intestino de RNAi nos experimentos seguintes.

Validação de RNAi resposta através de entrega oral do dsRNA foi avaliada medindo-se o efeito de depleção de expressão de RNAm de Cuba no intestino em pontos diferentes de tempo após a ingestão contínua do dsRNA(Figura 3). A expressão de Cuba no intestino foi esgotada significativamente após a ingestão contínua de dsTub lipoplexes para 8 dias. Enquanto a alimentação contínua do dsRNA durou 16 dias, a expressão de Cuba no intestino foi significativamente esgotada no dsTub nu e dsTub lipoplexes grupos (cerca de 24 e 60%, respectivamente) em contraste com os controles. Figura 3 B mostra um aumento consistente e significativo da mortalidade após a administração oral de dsTub lipoplexes para 16 dias.

Figura 1 : Regime simplificado de entrega oral do dsRNA lipoplexes para baratas. As principais etapas para a preparação dos lipoplexes dsRNA são representadas para as etapas 1 a 4. A técnica de alimentação (passo 5) é mostrada na foto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Ex vivo degradação do dsRNA pela b. germanica hemolinfa (Hemo) ou suco de midgut. (A), 1 µ g do dsTub nu ou lipossoma-cojugated foi incubada durante 1 h com tampão salino e enzimas extraídas de hemolinfa (hemo) ou suco de intestino, respectivamente. O nu dsTub, mas dsTub não conjugada com lipossomas, foi degradada completamente quando incubadas com 1 x suco de intestino. São indicados os fatores diferentes de diluição do suco original midgut (1x). A degradação foi inibida por quelação de íons devido ao tratamento de EGTA como um controle. (B) proteção dependente do tempo de dsTub encapsulada em lipossomas (1 µ g) contra degradação ex vivo em suco de hemolinfa ou intestino. Digno de nota, a dsTub conjugada com lipossoma foi degradada completamente quando incubadas com suco intestino após 24 h. O suco hemolinfa e intestino foram utilizados em diferentes períodos de incubação, a concentração original. Os resultados são adaptados de Lin et al. (2017) 12. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Efeitos de RNAi resposta pela ingestão de dsRNA na b. germanica. (A) real-time PCR quantitativo (qRT-PCR) para determinar a expressão relativa banheira no intestino da barata alemão após diferentes tratamentos de alimentação. Os níveis de expressão de diferentes tratamentos foram normalizados para o grupo de glicose no dia 2. Os valores são a média ± SE de três experimentos independentes (n = 3), cada um com 3-5 repetições biológicas. Letras diferentes das barras indicam diferenças significativas no p < 0,05 (ANOVA após teste de Tukey HSD Post Hoc) entre os grupos de tratamento diferente. (B) sobrevivência das baratas que ingeriu nu dsTub ou dsTub lipoplexes para 8 dias (8 d) ou 16 dias (16D) (cada coorte de indivíduos de 12-15; n = 3 experimentos independentes). Os valores são a média ± SE. Different cartas sobre o grupo de tratamento indicam diferenças significativas no p < 0,05 (teste de Kruskal-Wallis) para a sobrevivência. Os resultados são adaptados de Lin et al. (2017) 12. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.