Artigo de método

Uso prático da interferência do RNA: Oral entrega de RNA Double-stranded em lipossomas transportadoras para baratas

DOI:

10.3791/57385

⸱

1 de maio de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, National Taiwan University, 2Biology Centre, Institute of Entomology, Czech Academy of Sciences, 3Faculty of Science, University of South Bohemia, 4Institute of Evolutionary Biology, CSIC-UPF

Neste artigo

Resumo

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Este manuscrito demonstra o esgotamento de expressão gênica no intestino da barata alemão através da ingestão oral de RNA double-stranded encapsulada em lipossomas.

Resumo

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RNA de interferência (RNAi) tem sido aplicado extensamente para descobrir as funções biológicas de numerosos genes e foi previsto como uma praga controle ferramenta de exploração por perturbação da expressão do gene essencial. Embora diferentes métodos, tais como a injeção, alimentação e imersão, têm sido relatados para entrega bem sucedida de RNA double-stranded (dsRNA), a eficiência de RNAi através de entrega oral do dsRNA é altamente variável entre os diferentes grupos de insetos. A baratinha, Blattella germanica, é altamente sensível à injecção de dsRNA, como mostrado por muitos estudos publicados anteriormente. O presente estudo descreve um método para demonstrar que o dsRNA encapsulado com transportadoras em lipossomas é suficiente para retardar a degradação do dsRNA por suco de intestino. Notavelmente, a alimentação contínua do dsRNA encapsulado por lipossomas significativamente reduz a expressão de tubulina no intestino e levou à morte de baratas. Em conclusão, a formulação e utilização dos lipoplexes dsRNA, que protegem o dsRNA contra nucleases, poderiam ser um uso prático de RNAi para controle de pragas de insetos no futuro.

Introdução

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RNAi tem sido demonstrado como um método eficaz para a expressão do gene "knockdown" através de um mecanismo de uma via de silenciamento pós-transcricional desencadeada por moléculas de dsRNA em muitos eucariotos1. Durante a última década de estudo, RNAi tornou-se uma ferramenta útil para estudar as funções dos genes de desenvolvimento para o comportamento por esgotar a expressão de genes específicos, através da injeção e/ou alimentação do dsRNA em vários táxons de insetos2,3. Devido a especificidade e a robustez do efeito de esgotamento, a aplicação de RNAi atualmente está sendo considerada como uma estratégia potencial para controle de pragas de gestão4,5. No entanto, a eficiência de RNAi varia amplamente entre as espécies de insetos, consoante os diferentes genes alvo e os métodos de entrega. Um corpo crescente de evidências sugere que a instabilidade do dsRNA, que é degradada por ribonucleases, é um fator crítico na eficácia limitada de RNAi5,6. Por exemplo, a baixa sensibilidade de RNAi em Manduca sexta foi explicada pelo fato de que o dsRNA misturado com hemolinfa foi rapidamente degradado dentro de 1 hora,7. Da mesma forma, a presença de nucleases alcalinas no intestino, que eficientemente degradar dsRNA ingerido, é fortemente correlacionada com baixa eficiência de RNAi em diferentes ordens de insetos8,9,10.

A entrega oral de dsRNA é particularmente interessante para a aplicação de RNAi em uma estratégia de controle de pragas, mas um método para retardar a degradação do dsRNA pelas nucleases no intestino ainda não foi desenvolvido, que teria potencial para assegurar a eficaz RNAi através da alimentação. No entanto, a apatia de RNAi para entrega oral do dsRNA foi relatada por alimentação grande quantidade de dsRNA, por exemplo, 50 µ g/ml Bombyx mori, ou continuamente alimentando por 8 dias (8 µ g dsRNA no total) das espécies de gafanhoto. A baratinha, Blattella germinica, é altamente sensível a RNAi através da injeção de dsRNA11,12,13,14, mas não é responsiva ao dsRNA através da alimentação. Recentemente, Lin et al. (2017) demonstraram que o dsRNA encapsulados com resultados de transportadoras em lipossomas em RNAi bem sucedida a nocaute a expressão do gene α-tubulina no intestino e gatilho mortalidade significativa da baratinha15. Como a degradação do dsRNA no intestino é o fator limitante para RNAi oral, os portadores de lipossoma servem como um veículo para proteger dsRNA de degradação, que é facilmente aplicável em outros insetos com atividades de nuclease forte no intestino. Digno de nota, o motivo para a escolha do reagente de transfeccao particular (ver Tabela de materiais) usamos como portador de lipossomas no atual protocolo é que ele foi testado para transfeccao de linha celular inseto com menor toxicidade, de acordo com o instruções do fabricante. De acordo com a comparação dos sistemas de transfeccao lipossoma diferentes no guerreiro et al (2013) 16, a eficiência do transfecting RNA de interferência pequeno (siRNA) é aproximadamente o mesmo entre este e a outros sistemas disponíveis comercialmente que têm sido utilizados para sistemas de entrega dsRNA em outros insetos17,18 . Além disso, nosso método de alimentação é cuidadoso o suficiente para garantir a quantidade adequada de dsRNA é ingerida por cada barata, e que os resultados são robustos e confirmado. Em resumo, o presente protocolo e os resultados demonstram que usar dsRNA lipoplexes melhora a estabilidade do dsRNA e abre as portas para o design da entrega oral estratégia de RNAi, que é uma abordagem promissora para controle de pragas no futuro.

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Protocolo

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1. síntese e preparação do dsRNA

  1. Identifica os sites de destino do dsRNA da região untranslated 3' do gene-alvo. O dsTub é usado para o direcionamento do gene da α-tubulina (banheira) (número de adesão GenBank: KX228233), e dsEGFP como um controle negativo dsRNA destina-se a sequência de melhor proteína fluorescência verde (EGFP; Número de adesão GenBank: LC311024).
  2. Executar a amplificação por PCR padrão para sintetizar os modelos dsRNA com primers de gene-específico que contém a sequência de promotor T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). As condições de amplificação do PCR e informações de primeira demão usados são aqueles relatados por Lin et al. (2017) 12 (ver Tabela de materiais).
  3. Prosseguir com a preparação do dsRNA usando uma transcrição de T7 Kit (veja a Tabela de materiais), seguindo as instruções do fabricante.
    Nota: Para produzir quantidade elevada dsRNA, misture duas reações em um tubo (no total 40 µ l) e incubar a 37 ° C durante a noite.
  4. Adicionar 2 µ l de DNase (ver Tabela de materiais) em amostras de dsRNA por 15 min a 37 ° C para digerir modelos de DNA.
  5. Adicionar o reagente de extração 200 µ l (veja a Tabela de materiais) e clorofórmio 40 µ l, então o vórtice.
  6. Centrifugar durante 10 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, recolher o sobrenadante (150 µ l) em um novo tubo de microcentrifugadora.
  7. Precipitar dsRNA adicionando 150 µ l isopropanol e incubar por 15 min no gelo.
  8. Centrifugar por 15 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, remover o sobrenadante.
  9. Adicione 200 µ l de etanol 70% para lavar dsRNA Pelotas. Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C.
  10. Remover o etanol e repita as etapas de lavagem do etanol.
  11. Remover o etanol e o pellet seco dsRNA por concentradores centrífugos de vácuo por 3 min, em seguida, resuspenda dsRNA com água livre de RNase.
  12. Determinar a quantidade do dsRNA purificada usando um espectrofotômetro UV-Vis de micro-volume (ver Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante e ajustar para a concentração desejada (por exemplo, 0,25 µ g / µ l para a preparação de lipoplexes dsRNA).
  13. Armazene as amostras de dsRNA a-20 ° C por até 3 meses.

2. preparação do dsRNA Lipoplexes

  1. Dilua 4 µ l de reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais), adicionando 4 µ l de solução de glicose 5%. Dilua 4 µ l do dsRNA (1 µ g), adicionando 4 µ l de solução de glicose 5%.
  2. Adicione a solução de reagente diluído em lipossomas imediatamente na solução diluída dsRNA tudo de uma vez. Vórtice brevemente para misturá-los e, em seguida, incube por 15 min a 25 ° C.
    Nota: Não misture as soluções na ordem inversa.
  3. Os dsRNA lipoplexes estão prontas para uso. Use dentro de 1 hora de preparação e descartar depois de 1 hora.
    Nota: De acordo com as instruções do fabricante, os lipoplexes deve ser usado logo que possível.

3. coleção de enzimas extracelulares de hemolinfa e suco Midgut

  1. Inseto tampão salino (estoque de x 10)
    1. Misture 900 mL de água bidestilada com 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl, 6,3 g de CaCl2e 8,3 g MgCl2·6H2O.
    2. Ajustar o pH para 6,8 e preencher até 1.000 mL.
  2. Coleção de hemolinfa
    1. Anestesia as baratas no gelo até que eles não se movem por 3 min.
    2. Segurar a barata com dois dedos (polegar e dedo indicador) e aparece do lado ventral da barata.
    3. Use a dissecação tesoura para cortar a ponta de uma coxa de uma pata traseira.
      Nota: Corte o cruzamento conectado entre a coxa e o trocânter. A excisão da outra parte da coxa foi menos eficiente para coletar a hemolinfa.
    4. Aperte o abdômen suavemente com o dedo médio e recolher a hemolinfa sangramento da incisão com uma micropipeta de 10 µ l.
    5. Piscina a hemolinfa de várias baratas (5 pessoas) em um tubo de microcentrifugadora.
      Nota: Manter os tubos microcentrifuga no gelo para evitar melanização. O volume médio de hemolinfa obtido de uma barata masculina é 2-3 µ l.
    6. Spin para baixo a hemolinfa brevemente com uma centrífuga de bancada de 10 s.
    7. Transferir o volume desejado de hemolinfa (ou seja, 10 µ l) e misturá-lo com 50 µ l de tampão salino inseto 1 de x.
    8. Centrifugação por 10min a 1.000 x g a 4 ° C a girar para baixo hemócitos. Transferi o sobrenadante para um tubo limpo microcentrifuga.
    9. Quantificar a concentração de proteína total usando um espectrofotômetro UV-Vis de micro-volume medindo A28015.
    10. Ajuste cada amostra para ter a mesma concentração de proteína (6 mg / µ l de proteínas totais).
  3. Coleção de suco do intestino
    1. Anestesia as baratas no gelo. Arrumar as baratas lado ventral na placa de dissecação com insetos tampão salino de frio 1x usando pinos de insetos.
    2. Disse o abdômen com uma pinça fina. Remova o intestino inteiro (incluindo o intestino frontal, meados e patas traseiro) para um prato fresco com 1x tampão salino de insetos.
    3. Remover o intestino dianteiro e traseiro e transferir rapidamente o intestino para um tubo de microcentrifugadora que contém o tampão salino inseto de 100 µ l.
    4. Piscina do midguts de seis baratas no mesmo tubo e vórtice por 10 s.
    5. Centrifugação por 10min a 1.000 x g a 4 ° C a girar para baixo o hemócitos e tecidos do intestino. Transferi o sobrenadante para um tubo limpo microcentrifuga.
    6. Quantificar a concentração de proteína total usando um espectrofotômetro UV-Vis de micro-volume medindo A28015.
    7. Ajuste cada amostra para ter a mesma concentração de proteína (6 mg / µ l de proteínas totais).

4. dsRNA ensaio de degradação

  1. Recentemente a preparar 4 µ l do dsRNA nua ou lipoplexes dsRNA (1 µ g).
  2. Misture dsRNA enzimas de soluções com 10 µ l de tampão salino de insetos (controle), extraídas de hemolinfa, ou intestino suco.
  3. Adicione 2 µ l de EGTA (20mm) ou água livre de RNase para separar amostras como controles para inibição de actividades enzimáticas.
  4. Incubar durante 1 hora ou mais (6, 12 ou 24 horas) a 25 ° C.
  5. Adicione 200 µ l extração reagente e clorofórmio 40 µ l, então o vórtice.
  6. Centrifugar durante 10 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, recolher o sobrenadante (150 µ l) em um novo tubo de microcentrifugadora.
  7. Precipitar dsRNA adicionando 150 µ l isopropanol e incubar por 15 min no gelo.
  8. Centrifugar por 15 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, remover o sobrenadante.
  9. Adicione 200 µ l de etanol 70% para lavar dsRNA Pelotas. Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C.
  10. Remover o etanol e repita as etapas de lavagem do etanol.
  11. Remova o etanol e o pellet seco dsRNA por concentradores de vácuo centrífugas para 3 min. Ressuspender dsRNA com água livre de RNase a µ l 10.
  12. Verificar a integridade do dsRNA Tratado através de eletroforese em gel em um gel de agarose 1,5%.

5. oral administração do dsRNA

  1. Manter as baratas em uma dieta ad libitum do alimento seco (comida). Priva o abastecimento de água desde as baratas um dia antes experimentos de ingestão do dsRNA.
  2. Segure uma barata, agarrando suas asas com as pinças flexíveis (Figura 1, passo 5).
    Nota: Não pegue as partes do corpo das baratas.
  3. Prepare o dsRNA lipoplexes, bem como dsRNA nua, para a alimentação, conforme descrito na seção 2.
    Nota: O dsRNA lipoplexes deve ser preparado na hora antes da alimentação.
  4. Alimentar 4 µ l de lipoplexes dsRNA ou nu dsRNA (250 ng) com uma micropipeta.
  5. Lentamente, pipetar a gota da solução dsRNA perto o aparelho bucal de baratas e deixe as baratas ingerir a gota completamente.
  6. Realizar os experimentos de ingestão de duas vezes por dia (1h Após luzes acesas e 1h antes de luzes apagadas) por 8 dias ou 16 dias continuamente.
    Nota: Todas as baratas adquiriram água apenas através de alimentação manual com reagentes dsRNA solução ou controle (por exemplo, água livre de nuclease, solução de glicose e reagente lipossoma) durante experimentos de ingestão.
  7. Fornecem garrafas de água para as baratas após 16 dias de ingestão das experiências de dsRNA.

6. avaliar Knockdown

  1. No tempo escolhido pontos (2, 9 e 17 dias depois do ensaio de ingestão do dsRNA), coletar os insetos dsEGFP - e dsTub-tratada e dissecar os tecidos escolhidos (por exemplo, intestino).
  2. Realize o PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). As condições de amplificação de qRT-PCR e informações da primeira demão, conforme relatado por Lin et al. (2017) 12.
  3. Avalie o controle e o dsRNA-tratados insetos diariamente para verificar a mortalidade e remover as baratas que já não se move.

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Resultados

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Um esquema simplificado do protocolo de entrega oral do dsRNA é apresentado na Figura 1, onde as principais etapas para a preparação dos lipoplexes dsRNA são mostradas.

A fim de investigar a protecção dada pelas transportadoras em lipossomas em cima dsRNA degradação no suco de intestino de b. germanica, um ensaio ex vivo , onde foi realizado o dsTub lipoplexes foram incubados com s...

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Discussão

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Este protocolo apresenta um método para RNAi eficaz através de entrega oral dos lipoplexes dsRNA, envolvendo proteção contra digestão ribonuclease no suco de intestino da barata alemão. Como mostrado em outros estudos em várias espécies de insetos, o efeito de RNAi pobre através de entrega oral do dsRNA principalmente é contabilizado pela degradação de dsRNA8,9,10. Este protocolo produz lipossomas que servem como proteção veícul...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este estudo foi suportado por doações de Taiwan (Ministério da ciência e tecnologia, mais 100-2923-B-002-002-MY3 e 106-2313-B-002-011-MY3 para H.J.L.), República Checa (conceder a agência da Boémia do Sul, Universidade, Magali conceder 065/2017/P para Y.H.L) e Espanha ( Ministério da economia espanhola e competitividade, concede CGL2012-36251 e CGL2015-64727-P a X.B. e o governo catalão, conceder 2014 SGR 619 a X.B.); também recebeu apoio financeiro do Fundo Europeu para o desenvolvimento económico e Regional (fundos FEDER para X.B.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
GenJe Plus DNA in vitro Reagente de transfecçãoSignaGenSL100499para preparação de lipoplexos
Blend Taq plusTOYOBO BTQ-201para PCR
Fast SYBR Green Master MixABI 4385612para qPCR
FirstChoice RLM-RACE KitInvitrogenAM1700para identificação UTR de 3' 
Kit de Transcrição MEGAscript T7InvitrogenAMB13345para síntese de dsRNA
TURBO DNaseInvitrogenAM2239remove o molde de DNA do dsRNA
TRIzolInvitrogen15596018para extração de dsRNA ou RNA total
RQ1 Dnase-Free DnasePromegaM6101remove o molde de DNA do RNA total 
clorofórmio Sigma-AldrichC2432para extração de dsRNA ou RNA total
2-PropanolSigma-AldrichI9516para dsRNA ou etanol de extração de RNA total
Sigma-Aldrich24102para extração de dsRNA ou RNA total
Dietilpirocarbonato, DEPCSigma-AldrichD5758para solução de glicose de preparação de água livre de RNase
Sigma-AldrichG3285para preparação de lipoplexos
Cloreto de sódio, NaCltampão salino de insetosSigma-AldrichS7653
fórmula de tampão de solução salina de insetosKClSigma-AldrichP9333
Cloreto de cálcio, CaCl2Sigma-AldrichC1016fórmula
de tampão salino de insetosCloreto de magnésio hexahidratado, MgCl2.6H2OSigma-AldrichM2670de tampão salino para insetos
EGTA Inibidor da enzima Sigma-AldrichE3889
tesoura de dissecaçãoF.S.T.pinças finas de dissecação
baratasF.S.T.dissecação de baratas
F.S.T.Barata segurando 
pipetmanRAININP10microcentrífuga para preparação de amostras
AxygenMCT175C, PCR02Cpara preparação de amostras
ponta de pipeta preparação de amostrasAxygen
Digisystemvm1000
centrífuga Minispinde preparação de amostras O Grupo GruffinGMC 206para redução de rotação líquida 
CentrífugaALCPK121Rpreparação de amostras
Medidor de pH JENCO6071para
espectrofotômetro de micro-volumeQuawellQ3000ácido nucleico PCR quantitativo
TermocicladorABI 2720para PCR modelo ou  síntese de dsRNA incubação 
PCR quantitativo em tempo realABI Concentradoresa Vácuo quantitativos de expressão gênica
StepOne plus eppendorf5301para extração de dsRNA ou RNA total
Multipette eppendorfxstreampara carregamento de amostras de PCR em tempo real 
Agarose Iamresco0710para eletroforese de ácido nucleico
tub gene specfifc forward preimertri-I biotechGGG ACA AGC CGG AGT GCA GA
tub gene specfifc reverse preimertri-I biotechTCC TGC TCC TGT CTC GCT GA
dsTub template forward primertri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG 
modelo dsTub reverse primertri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG 
dsEGFP modelo para a frente preimertri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG
dsEGFP modelo reverse preimertri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC
tub qPCR forward primertri-I biotechGGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC
banheira qPCR reverse preimertri-I biotechCCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC
ef1 qPCR forward primertri-I biotechCGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A
ef1 qPCRreverse preimertri-I biotechCCT GCA GAG GAA GAC GAA G
Fórmula de Cloreto de potássio, fórmula de pinça flexível para tubo de Vortexter de de ajuste de pH Centrífugos

Referências

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