Uso prático da interferência do RNA: Oral entrega de RNA Double-stranded em lipossomas transportadoras para baratas

O objetivo geral deste protocolo é esgotar a expressão gênica no intestino de baratas usando interferência de RNA por meio da ingestão oral de RNA de fita dupla encapsulado em transportadores de lipossomas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no desenvolvimento de novos métodos de controle de pragas, como derrubar genes essenciais em campo aberto pode matar pragas? A principal vantagem dessa técnica é que o lipossomo protege o RNA de fita dupla específico do gene para garantir sua entrega à célula-alvo.

Demonstrando o procedimento estarão Jia-Hsin Huang, um pós-doutorado, e Yun Liu, um técnico do meu laboratório. Para começar, anestesie as baratas no gelo até que elas não se movam por três minutos. Em seguida, pegue um inseto usando o polegar e o indicador para acessar seu lado ventral.

Em seguida, use uma tesoura de dissecação para cortar a ponta de uma coxa de uma perna traseira entre a coxa e o trocânter. O corte em outras partes da coxa é menos eficiente para as coleções de hemolinfa. Agora, posicione uma micropipeta de 10 microlitros na incisão e aperte o abdômen suavemente enquanto extrai a hemolinfa sangrando.

Repita esse processo até que a hemolinfa de cinco baratas tenha sido coletada em um único tubo de microcentrífuga. Em seguida, gire brevemente a hemolinfa acumulada por 10 segundos. Em seguida, combine 10 microlitros de hemolinfa com 50 microlitros de tampão salino 1x inseto.

Agora, centrifugue a hemolinfa diluída por 10 minutos para retirar os hemócitos da solução. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo. Por fim, quantifique a concentração total de proteínas usando um espectrofotômetro UV-Vis de microvolume e ajuste a concentração de cada amostra para seis miligramas de proteína por microlitro.

Para coletar o suco do intestino médio, primeiro anestesie as baratas no gelo. Em seguida, transfira um para uma placa de dissecação carregada com tampão salino de inseto 1x frio e use alfinetes de inseto para prendê-lo com o lado ventral para cima. Agora, disseque o abdômen usando uma pinça fina.

Em seguida, remova todo o intestino e transfira-o para um prato fresco com 1x tampão salino para insetos. Em seguida, isole o intestino médio, que é a região entre a cultura e os túbulos de Malpighi. Para fazer isso, remova a parte frontal do animal e remova o intestino grosso.

Em seguida, transfira rapidamente o intestino médio para um tubo de microcentrífuga com 100 microlitros de tampão salino de insetos. Colete o intestino médio de seis baratas no mesmo tubo. Em seguida, agite o tubo por 10 segundos.

Em seguida, centrifugue a mistura por 10 minutos para separar os hemócitos e os tecidos intestinais. Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo e ajuste a concentração para seis miligramas de proteína por microlitro. Os lipoplexos de RNA de fita dupla devem ser usados dentro de uma hora após a preparação.

Durante a preparação, certifique-se de combinar todo o reagente diluído com o RNA de fita dupla diluído ao mesmo tempo. Em seguida, bata rapidamente e incube a mistura. Quando estiver pronto, misture quatro microlitros da solução de RNA de fita dupla com 10 microlitros de tampão salino de inseto como controle, ou misture com 10 microlitros de enzimas extraídas retiradas da hemolinfa ou do suco do intestino médio.

Em seguida, faça um controle inibido por enzima adicionando dois microlitros de EGTA. Caso contrário, adicione dois microlitros de água sem RNase. Em seguida, incube as amostras por uma hora ou mais a 25 graus Celsius.

Após a incubação, adicione 200 microlitros de reagente de extração e 40 microlitros de clorofórmio e, em seguida, vórtice. Em seguida, centrifugue as amostras por 10 minutos. Em seguida, transfira 150 microlitros de cada sobrenadante para um novo tubo e precipite o RNA de fita dupla de cada amostra adicionando 150 microlitros de isopropanol e incubando as amostras no gelo por 15 minutos.

Após a incubação, centrifugue novamente as amostras e descarte o sobrenadante. Em seguida, lave os pellets de RNA duas vezes, adicionando 200 microlitros de etanol a 70% a cada pellet e centrifugando o tubo. Após a segunda lavagem, secar os grânulos de RNA de fita dupla usando um concentrador centrífugo a vácuo por três minutos.

Em seguida, ressuspenda os pellets em 10 microlitros de água livre de RNase. Finalmente, verifique a integridade do RNA de fita dupla tratado usando um gel de 1,5% de agarose. Alimente as baratas duas vezes por dia, uma hora após o acendimento das luzes e uma hora antes do apagar das luzes.

Faça isso por oito ou 16 dias sem pausas. Durante esse período, as baratas devem ficar sem água. Para a alimentação, ter lipoplexos de RNA de fita dupla recém-preparados e RNA de fita dupla nu disponíveis.

Para o bolus, use com quatro microlitros de lipoplexos de RNA de fita dupla ou 250 nanogramas de RNA de fita dupla nua. Para alimentar uma barata, primeiro agarre-a pelas asas usando uma pinça flexível. Não pegue as partes do corpo de uma barata.

Em seguida, pipete lentamente a gota de solução perto das peças bucais e observe como a barata ingere a gota. Após a última alimentação, forneça garrafas de água para as baratas. Durante todo o período de alimentação, avalie os insetos diariamente para verificar a mortalidade e remova as baratas que não estão mais se movendo do experimento.

A administração oral contínua de lipoplexos de tubo de fita dupla foi capaz de diminuir a expressão de tubulina no intestino médio de 40% no dia nove para 60% no dia 17. Em comparação, o RNA de fita dupla nu não teve efeito. Isso provavelmente se deve à descoberta de que a exposição do RNA de fita dupla nu ao suco do intestino médio resultou em degradação dentro de uma hora, enquanto o RNA de fita dupla conjugado com lipossomas permaneceu estável.

Não apenas os níveis de RNA diminuíram, mas a alimentação contínua dos lipoplexos de RNA de fita dupla da tubulina também resultou em letalidade significativa. É improvável que isso seja devido ao vetor, pois os lipoplexos que transportam RNA de fita dupla para EGFP não resultaram em letalidade. Ao tentar este sistema de entrega oral de interferência de RNA, é importante realizar uma alimentação contínua de RNA de fita dupla por vários dias.

Uma vez dominado, a etapa de alimentação pode ser feita em dois minutos por inseto se for realizada corretamente. Se necessário, diferentes formulações de nanopartículas de lipossomas podem ser aplicadas para melhorar o procedimento de alimentação e a eficiência do RNAi. Em última análise, essa técnica tornou viável para pesquisadores da área de manejo de pragas explorar novas estratégias de controle usando RNAi.