Name: Uso prático da interferência do RNA: Oral entrega de RNA Double-stranded em lipossomas transportadoras para baratas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a depletar a expressão gênica no intestino de baratas usando interferência de RNA via ingestão oral de RNA de fita dupla encapsulado em lipossomas. Este método protege o RNA e garante sua entrega às células-alvo.

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Este estudo foi suportado por doações de Taiwan (Ministério da ciência e tecnologia, mais 100-2923-B-002-002-MY3 e 106-2313-B-002-011-MY3 para H.J.L.), República Checa (conceder a agência da Boémia do Sul, Universidade, Magali conceder 065/2017/P para Y.H.L) e Espanha ( Ministério da economia espanhola e competitividade, concede CGL2012-36251 e CGL2015-64727-P a X.B. e o governo catalão, conceder 2014 SGR 619 a X.B.); também recebeu apoio financeiro do Fundo Europeu para o desenvolvimento económico e Regional (fundos FEDER para X.B.).

1. síntese e preparação do dsRNA
<ol><li>Identifica os sites de destino do dsRNA da região untranslated 3' do gene-alvo. O dsTub é usado para o direcionamento do gene da α-tubulina (banheira) (número de adesão GenBank: KX228233), e dsEGFP como um controle negativo dsRNA destina-se a sequência de melhor proteína fluorescência verde (EGFP; Número de adesão GenBank: LC311024).</li>
	<li>Executar a amplificação por PCR padrão para sintetizar os modelos dsRNA com primers de gene-específico que contém a sequência de promotor T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). As condições de amplificação do PCR e informações de primeira demão usados são aqueles relatados por Lin et al. (2017) 12 (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Prosseguir com a preparação do dsRNA usando uma transcrição de T7 Kit (veja a Tabela de materiais), seguindo as instruções do fabricante. Nota: Para produzir quantidade elevada dsRNA, misture duas reações em um tubo (no total 40 µ l) e incubar a 37 ° C durante a noite.</li>
	<li>Adicionar 2 µ l de DNase (ver Tabela de materiais) em amostras de dsRNA por 15 min a 37 ° C para digerir modelos de DNA.</li>
	<li>Adicionar o reagente de extração 200 µ l (veja a Tabela de materiais) e clorofórmio 40 µ l, então o vórtice.</li>
	<li>Centrifugar durante 10 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, recolher o sobrenadante (150 µ l) em um novo tubo de microcentrifugadora.</li>
	<li>Precipitar dsRNA adicionando 150 µ l isopropanol e incubar por 15 min no gelo.</li>
	<li>Centrifugar por 15 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, remover o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 200 µ l de etanol 70% para lavar dsRNA Pelotas. Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Remover o etanol e repita as etapas de lavagem do etanol.</li>
	<li>Remover o etanol e o pellet seco dsRNA por concentradores centrífugos de vácuo por 3 min, em seguida, resuspenda dsRNA com água livre de RNase.</li>
	<li>Determinar a quantidade do dsRNA purificada usando um espectrofotômetro UV-Vis de micro-volume (ver Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante e ajustar para a concentração desejada (por exemplo, 0,25 µ g / µ l para a preparação de lipoplexes dsRNA).</li>
	<li>Armazene as amostras de dsRNA a-20 ° C por até 3 meses.</li>
</ol>2. preparação do dsRNA Lipoplexes
<ol><li>Dilua 4 µ l de reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais), adicionando 4 µ l de solução de glicose 5%. Dilua 4 µ l do dsRNA (1 µ g), adicionando 4 µ l de solução de glicose 5%.</li>
	<li>Adicione a solução de reagente diluído em lipossomas imediatamente na solução diluída dsRNA tudo de uma vez. Vórtice brevemente para misturá-los e, em seguida, incube por 15 min a 25 ° C. Nota: Não misture as soluções na ordem inversa.</li>
	<li>Os dsRNA lipoplexes estão prontas para uso. Use dentro de 1 hora de preparação e descartar depois de 1 hora. Nota: De acordo com as instruções do fabricante, os lipoplexes deve ser usado logo que possível.</li>
</ol>3. coleção de enzimas extracelulares de hemolinfa e suco Midgut
<ol><li>
Inseto tampão salino (estoque de x 10)
	<ol>
<li>Misture 900 mL de água bidestilada com 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl, 6,3 g de CaCl2e 8,3 g MgCl2·6H2O.</li>
		<li>Ajustar o pH para 6,8 e preencher até 1.000 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coleção de hemolinfa
	<ol>
<li>Anestesia as baratas no gelo até que eles não se movem por 3 min.</li>
		<li>Segurar a barata com dois dedos (polegar e dedo indicador) e aparece do lado ventral da barata.</li>
		<li>Use a dissecação tesoura para cortar a ponta de uma coxa de uma pata traseira. Nota: Corte o cruzamento conectado entre a coxa e o trocânter. A excisão da outra parte da coxa foi menos eficiente para coletar a hemolinfa.</li>
		<li>Aperte o abdômen suavemente com o dedo médio e recolher a hemolinfa sangramento da incisão com uma micropipeta de 10 µ l.</li>
		<li>Piscina a hemolinfa de várias baratas (5 pessoas) em um tubo de microcentrifugadora. Nota: Manter os tubos microcentrifuga no gelo para evitar melanização. O volume médio de hemolinfa obtido de uma barata masculina é 2-3 µ l.</li>
		<li>Spin para baixo a hemolinfa brevemente com uma centrífuga de bancada de 10 s.</li>
		<li>Transferir o volume desejado de hemolinfa (ou seja, 10 µ l) e misturá-lo com 50 µ l de tampão salino inseto 1 de x.</li>
		<li>Centrifugação por 10min a 1.000 x g a 4 ° C a girar para baixo hemócitos. Transferi o sobrenadante para um tubo limpo microcentrifuga.</li>
		<li>Quantificar a concentração de proteína total usando um espectrofotômetro UV-Vis de micro-volume medindo A28015.</li>
		<li>Ajuste cada amostra para ter a mesma concentração de proteína (6 mg / µ l de proteínas totais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coleção de suco do intestino
	<ol>
<li>Anestesia as baratas no gelo. Arrumar as baratas lado ventral na placa de dissecação com insetos tampão salino de frio 1x usando pinos de insetos.</li>
		<li>Disse o abdômen com uma pinça fina. Remova o intestino inteiro (incluindo o intestino frontal, meados e patas traseiro) para um prato fresco com 1x tampão salino de insetos.</li>
		<li>Remover o intestino dianteiro e traseiro e transferir rapidamente o intestino para um tubo de microcentrifugadora que contém o tampão salino inseto de 100 µ l.</li>
		<li>Piscina do midguts de seis baratas no mesmo tubo e vórtice por 10 s.</li>
		<li>Centrifugação por 10min a 1.000 x g a 4 ° C a girar para baixo o hemócitos e tecidos do intestino. Transferi o sobrenadante para um tubo limpo microcentrifuga.</li>
		<li>Quantificar a concentração de proteína total usando um espectrofotômetro UV-Vis de micro-volume medindo A28015.</li>
		<li>Ajuste cada amostra para ter a mesma concentração de proteína (6 mg / µ l de proteínas totais).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. dsRNA ensaio de degradação
<ol><li>Recentemente a preparar 4 µ l do dsRNA nua ou lipoplexes dsRNA (1 µ g).</li>
	<li>Misture dsRNA enzimas de soluções com 10 µ l de tampão salino de insetos (controle), extraídas de hemolinfa, ou intestino suco.</li>
	<li>Adicione 2 µ l de EGTA (20mm) ou água livre de RNase para separar amostras como controles para inibição de actividades enzimáticas.</li>
	<li>Incubar durante 1 hora ou mais (6, 12 ou 24 horas) a 25 ° C.</li>
	<li>Adicione 200 µ l extração reagente e clorofórmio 40 µ l, então o vórtice.</li>
	<li>Centrifugar durante 10 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, recolher o sobrenadante (150 µ l) em um novo tubo de microcentrifugadora.</li>
	<li>Precipitar dsRNA adicionando 150 µ l isopropanol e incubar por 15 min no gelo.</li>
	<li>Centrifugar por 15 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, remover o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 200 µ l de etanol 70% para lavar dsRNA Pelotas. Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Remover o etanol e repita as etapas de lavagem do etanol.</li>
	<li>Remova o etanol e o pellet seco dsRNA por concentradores de vácuo centrífugas para 3 min. Ressuspender dsRNA com água livre de RNase a µ l 10.</li>
	<li>Verificar a integridade do dsRNA Tratado através de eletroforese em gel em um gel de agarose 1,5%.</li>
</ol>5. oral administração do dsRNA
<ol><li>Manter as baratas em uma dieta ad libitum do alimento seco (comida). Priva o abastecimento de água desde as baratas um dia antes experimentos de ingestão do dsRNA.</li>
	<li>Segure uma barata, agarrando suas asas com as pinças flexíveis (Figura 1, passo 5). Nota: Não pegue as partes do corpo das baratas.</li>
	<li>Prepare o dsRNA lipoplexes, bem como dsRNA nua, para a alimentação, conforme descrito na seção 2. Nota: O dsRNA lipoplexes deve ser preparado na hora antes da alimentação.</li>
	<li>Alimentar 4 µ l de lipoplexes dsRNA ou nu dsRNA (250 ng) com uma micropipeta.</li>
	<li>Lentamente, pipetar a gota da solução dsRNA perto o aparelho bucal de baratas e deixe as baratas ingerir a gota completamente.</li>
	<li>Realizar os experimentos de ingestão de duas vezes por dia (1h Após luzes acesas e 1h antes de luzes apagadas) por 8 dias ou 16 dias continuamente. Nota: Todas as baratas adquiriram água apenas através de alimentação manual com reagentes dsRNA solução ou controle (por exemplo, água livre de nuclease, solução de glicose e reagente lipossoma) durante experimentos de ingestão.</li>
	<li>Fornecem garrafas de água para as baratas após 16 dias de ingestão das experiências de dsRNA.</li>
</ol>6. avaliar Knockdown
<ol><li>No tempo escolhido pontos (2, 9 e 17 dias depois do ensaio de ingestão do dsRNA), coletar os insetos dsEGFP - e dsTub-tratada e dissecar os tecidos escolhidos (por exemplo, intestino).</li>
	<li>Realize o PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). As condições de amplificação de qRT-PCR e informações da primeira demão, conforme relatado por Lin et al. (2017) 12.</li>
	<li>Avalie o controle e o dsRNA-tratados insetos diariamente para verificar a mortalidade e remover as baratas que já não se move.</li>
</ol>

<ol><li>Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicing+and+slicing%3A+The+core+machinery+of+the+RNA+interference+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway.</a> FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J. Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/journal/19376448/312">International Review of Cell and Molecular Biology</a>. Jeon, K. W. 312, Academic Press. 139-167 (2014).</li>
<li>San Miguel, K., Scott, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+generation+of+insecticides%3A+dsRNA+is+stable+as+a+foliar-applied+insecticide%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide.</a> Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).</li>
<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).</li>
<li>Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+efficiency%2C+systemic+properties%2C+and+novel+delivery+methods+for+pest+insect+control%3A+What+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far.</a> Front. Physiol. 7, (2016).</li>
<li>Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success%3A+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).</li>
<li>Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+a+cDNA+encoding+extracellular+dsRNase+and+its+expression+in+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).</li>
<li>Wynant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+functional+characterization+and+phylogenetic+analysis+of+double+stranded+RNA+degrading+enzymes+present+in+the+gut+of+the+desert+locust%2C+Schistocerca+gregaria%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).</li>
<li>Huang, J. -H., Belles, X., Lee, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+hypertrehalosemic+hormone+receptor+in+relation+to+hemolymph+trehalose+and+to+oxidative+stress+in+the+cockroach+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica.</a> Exp. Endocrinol. 2, 114(2012).</li>
<li>Lin, Y. -H., Lee, C. -M., Huang, J. -H., Lee, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+regulation+of+permethrin+susceptibility+by+glutathione+S-transferase+%28BgGSTD1%29+in+the+German+cockroach+%28Blattella+germanica%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica).</a> J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).</li>
<li>Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+taiman+in+insect+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">A role for taiman in insect metamorphosis.</a> PLOS Genet. 10, 1004769(2014).</li>
<li>Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-2+family+regulates+insect+metamorphosis+by+controlling+the+juvenile+hormone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).</li>
<li>Lin, Y. -H., Huang, J. -H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+dsRNA+lipoplexes+to+German+cockroach+protects+dsRNA+from+degradation+and+induces+RNAi+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response.</a> Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).</li>
<li>Gharavi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+cationic+polyamines+for+chiral+microcapsules+and+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).</li>
<li>Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingested+double-stranded+RNAs+can+act+as+species-specific+insecticides%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+responses+of+migratory+locusts+to+systemic+RNA+interference+via+double-stranded+RNA+injection+and+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding.</a> Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).</li>
<li>Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+response+of+BmToll9-1+and+RNAi+machinery+genes+to+exogenous+dsRNA+in+the+midgut+of+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori.</a> J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).</li>
<li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+mosquito+and+mosquito-borne+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control.</a> Insects. 8, 4(2017).</li>
<li>Taning, C. N. T., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10340-016-0736-9">Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages.</a> J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).</li>
<li>Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+systems+for+in+vivo+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Lipidic systems for in vivo siRNA delivery.</a> AAPS J. 11, 639-652 (2009).</li>
<li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).</li>
<li>Xia, Y., Tian, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+properties+on+liposomal+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery.</a> Biomaterials. 79, 56-68 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo apresenta um método para RNAi eficaz através de entrega oral dos lipoplexes dsRNA, envolvendo proteção contra digestão ribonuclease no suco de intestino da barata alemão. Como mostrado em outros estudos em várias espécies de insetos, o efeito de RNAi pobre através de entrega oral do dsRNA principalmente é contabilizado pela degradação de dsRNA8,9,10. Este protocolo produz lipossomas que servem como proteção veícul...

RNAi tem sido demonstrado como um método eficaz para a expressão do gene "knockdown" através de um mecanismo de uma via de silenciamento pós-transcricional desencadeada por moléculas de dsRNA em muitos eucariotos1. Durante a última década de estudo, RNAi tornou-se uma ferramenta útil para estudar as funções dos genes de desenvolvimento para o comportamento por esgotar a expressão de genes específicos, através da injeção e/ou alimentação do dsRNA em vários táxons de insetos2,3. Devido a especificidade e a robustez do efeito de esgotamento, a aplicação de RNAi atualmente está sendo considerada como uma estratégia potencial para controle de pragas de gestão4,5. No entanto, a eficiência de RNAi varia amplamente entre as espécies de insetos, consoante os diferentes genes alvo e os métodos de entrega. Um corpo crescente de evidências sugere que a instabilidade do dsRNA, que é degradada por ribonucleases, é um fator crítico na eficácia limitada de RNAi5,6. Por exemplo, a baixa sensibilidade de RNAi em Manduca sexta foi explicada pelo fato de que o dsRNA misturado com hemolinfa foi rapidamente degradado dentro de 1 hora,7. Da mesma forma, a presença de nucleases alcalinas no intestino, que eficientemente degradar dsRNA ingerido, é fortemente correlacionada com baixa eficiência de RNAi em diferentes ordens de insetos8,9,10.
A entrega oral de dsRNA é particularmente interessante para a aplicação de RNAi em uma estratégia de controle de pragas, mas um método para retardar a degradação do dsRNA pelas nucleases no intestino ainda não foi desenvolvido, que teria potencial para assegurar a eficaz RNAi através da alimentação. No entanto, a apatia de RNAi para entrega oral do dsRNA foi relatada por alimentação grande quantidade de dsRNA, por exemplo, 50 µ g/ml Bombyx mori, ou continuamente alimentando por 8 dias (8 µ g dsRNA no total) das espécies de gafanhoto. A baratinha, Blattella germinica, é altamente sensível a RNAi através da injeção de dsRNA11,12,13,14, mas não é responsiva ao dsRNA através da alimentação. Recentemente, Lin et al. (2017) demonstraram que o dsRNA encapsulados com resultados de transportadoras em lipossomas em RNAi bem sucedida a nocaute a expressão do gene α-tubulina no intestino e gatilho mortalidade significativa da baratinha15. Como a degradação do dsRNA no intestino é o fator limitante para RNAi oral, os portadores de lipossoma servem como um veículo para proteger dsRNA de degradação, que é facilmente aplicável em outros insetos com atividades de nuclease forte no intestino. Digno de nota, o motivo para a escolha do reagente de transfeccao particular (ver Tabela de materiais) usamos como portador de lipossomas no atual protocolo é que ele foi testado para transfeccao de linha celular inseto com menor toxicidade, de acordo com o instruções do fabricante. De acordo com a comparação dos sistemas de transfeccao lipossoma diferentes no guerreiro et al (2013) 16, a eficiência do transfecting RNA de interferência pequeno (siRNA) é aproximadamente o mesmo entre este e a outros sistemas disponíveis comercialmente que têm sido utilizados para sistemas de entrega dsRNA em outros insetos17,18 . Além disso, nosso método de alimentação é cuidadoso o suficiente para garantir a quantidade adequada de dsRNA é ingerida por cada barata, e que os resultados são robustos e confirmado. Em resumo, o presente protocolo e os resultados demonstram que usar dsRNA lipoplexes melhora a estabilidade do dsRNA e abre as portas para o design da entrega oral estratégia de RNAi, que é uma abordagem promissora para controle de pragas no futuro.

<table><tbody><tr><td>GenJe Plus DNA in vitro Reagente de transfecção</td><td>SignaGen</td><td>SL100499</td><td>para preparação de lipoplexos</td></tr><tr><td>Blend Taq plus</td><td>TOYOBO&nbsp;</td><td>BTQ-201</td><td>para PCR</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>ABI&nbsp;</td><td>4385612</td><td>para qPCR</td></tr><tr><td>FirstChoice RLM-RACE Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1700</td><td>para identificação UTR de 3'&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de Transcrição MEGAscript T7</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>para síntese de dsRNA</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2239</td><td>remove o molde de DNA do dsRNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>para extração de dsRNA ou RNA total</td></tr><tr><td>RQ1 Dnase-Free Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>remove o molde de DNA do RNA total&nbsp;</td></tr><tr><td>clorofórmio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>para extração de dsRNA ou RNA total</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td>para dsRNA ou etanol de extração de RNA total</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td><td>para extração de dsRNA ou RNA total</td></tr><tr><td>Dietilpirocarbonato, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>para solução de glicose de preparação de água livre de RNase</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3285</td><td>para preparação de lipoplexos</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio, NaCl</td> Fórmula de <td>tampão salino de insetos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td></tr><tr>Cloreto de potássio, <td>fórmula de tampão de solução salina de insetos</td><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio, CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>fórmula</td></tr> <tr><td>de tampão salino de insetosCloreto de magnésio hexahidratado, MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td> fórmula <td>de tampão salino para insetos</td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>Inibidor da enzima Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>tesoura de dissecação</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>pinças finas de dissecação</td></tr> de <tr><td>baratas</td><td>F.S.T.</td><td></td> pinça flexível para <td>dissecação de baratas</td></tr><tr><td></td><td>F.S.T.</td><td></td><td>Barata segurando&nbsp;</td></tr><tr><td>pipetman</td><td>RAININ</td><td>P10</td> tubo de <td>microcentrífuga para preparação de amostras</td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td>MCT175C, PCR02C</td><td>para preparação de amostras</td></tr><tr><td>ponta de pipeta&nbsp;</td>Vortexter de <td>preparação de amostras</td> <td>Axygen</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Digisystem</td><td>vm1000</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga Minispin</td><td>de preparação de amostras O Grupo Gruffin</td><td>GMC 206</td><td>para redução de rotação líquida&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>ALC</td><td>PK121R</td><td>preparação de amostras</td></tr><tr><td>Medidor de pH&nbsp;</td><td>JENCO</td><td>6071</td><td>para</td></tr><tr><td>espectrofotômetro de micro-volume</td> de ajuste de pH <td>Quawell</td><td>Q3000</td><td>ácido nucleico PCR quantitativo</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>ABI&nbsp;</td><td>2720</td><td>para PCR modelo ou&nbsp; síntese de dsRNA incubação&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR quantitativo em tempo real</td><td>ABI&nbsp;</td><td>Concentradores</td> Centrífugos <td>a Vácuo quantitativos de expressão gênica</td></tr><tr><td></td><td>StepOne plus eppendorf</td><td>5301</td><td>para extração de dsRNA ou RNA total</td></tr><tr><td>Multipette&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>xstream</td><td>para carregamento de amostras de PCR em tempo real&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>amresco</td><td>0710</td><td>para eletroforese de ácido nucleico</td></tr><tr><td>tub gene specfifc forward preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td></tr><tr><td>tub gene specfifc reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA</td></tr><tr><td>dsTub template forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG&nbsp;</td></tr><tr><td>modelo dsTub reverse primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsEGFP modelo para a frente preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG</td></tr><tr><td>dsEGFP modelo reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC</td></tr><tr><td>tub qPCR forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC</td></tr><tr><td>banheira qPCR reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC</td></tr><tr><td>ef1 qPCR forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A</td></tr><tr><td>ef1 qPCRreverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCT GCA GAG GAA GAC GAA G</td></tr></tbody></table>

uso prático da interferência do rna: oral entrega de rna double-stranded em lipossomas transportadoras para baratas

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA de interferência (RNAi) tem sido aplicado extensamente para descobrir as funções biológicas de numerosos genes e foi previsto como uma praga controle ferramenta de exploração por perturbação da expressão do gene essencial. Embora diferentes métodos, tais como a injeção, alimentação e imersão, têm sido relatados para entrega bem sucedida de RNA double-stranded (dsRNA), a eficiência de RNAi através de entrega oral do dsRNA é altamente variável entre os diferentes grupos de insetos. A baratinha, Blattella germanica, é altamente sensível à injecção de dsRNA, como mostrado por muitos estudos publicados anteriormente. O presente estudo descreve um método para demonstrar que o dsRNA encapsulado com transportadoras em lipossomas é suficiente para retardar a degradação do dsRNA por suco de intestino. Notavelmente, a alimentação contínua do dsRNA encapsulado por lipossomas significativamente reduz a expressão de tubulina no intestino e levou à morte de baratas. Em conclusão, a formulação e utilização dos lipoplexes dsRNA, que protegem o dsRNA contra nucleases, poderiam ser um uso prático de RNAi para controle de pragas de insetos no futuro.

Um esquema simplificado do protocolo de entrega oral do dsRNA é apresentado na Figura 1, onde as principais etapas para a preparação dos lipoplexes dsRNA são mostradas.
A fim de investigar a protecção dada pelas transportadoras em lipossomas em cima dsRNA degradação no suco de intestino de b. germanica, um ensaio ex vivo , onde foi realizado o dsTub lipoplexes foram incubados com s...

Este manuscrito demonstra o esgotamento de expressão gênica no intestino da barata alemão através da ingestão oral de RNA double-stranded encapsulada em lipossomas.

Uso prático da interferência do RNA: Oral entrega de RNA Double-stranded em lipossomas transportadoras para baratas

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

O objetivo geral deste protocolo é esgotar a expressão gênica no intestino de baratas usando interferência de RNA por meio da ingestão oral de RNA de fita dupla encapsulado em transportadores de lipossomas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no desenvolvimento de novos métodos de controle de pragas, como derrubar genes essenciais em campo aberto pode matar pragas? A principal vantagem dessa técnica é que o lipossomo protege o RNA de fita dupla específico do gene para garantir sua entrega à célula-alvo.Demonstrando o procedimento estarão Jia-Hsin Huang, um pós-doutorado, e Yun Liu, um técnico do meu laboratório. Para começar, anestesie as baratas no gelo até que elas não se movam por três minutos. Em seguida, pegue um inseto usando o polegar e o indicador para acessar seu lado ventral.Em seguida, use uma tesoura de dissecação para cortar a ponta de uma coxa de uma perna traseira entre a coxa e o trocânter. O corte em outras partes da coxa é menos eficiente para as coleções de hemolinfa. Agora, posicione uma micropipeta de 10 microlitros na incisão e aperte o abdômen suavemente enquanto extrai a hemolinfa sangrando.Repita esse processo até que a hemolinfa de cinco baratas tenha sido coletada em um único tubo de microcentrífuga. Em seguida, gire brevemente a hemolinfa acumulada por 10 segundos. Em seguida, combine 10 microlitros de hemolinfa com 50 microlitros de tampão salino 1x inseto.Agora, centrifugue a hemolinfa diluída por 10 minutos para retirar os hemócitos da solução. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo. Por fim, quantifique a concentração total de proteínas usando um espectrofotômetro UV-Vis de microvolume e ajuste a concentração de cada amostra para seis miligramas de proteína por microlitro.Para coletar o suco do intestino médio, primeiro anestesie as baratas no gelo. Em seguida, transfira um para uma placa de dissecação carregada com tampão salino de inseto 1x frio e use alfinetes de inseto para prendê-lo com o lado ventral para cima. Agora, disseque o abdômen usando uma pinça fina.Em seguida, remova todo o intestino e transfira-o para um prato fresco com 1x tampão salino para insetos. Em seguida, isole o intestino médio, que é a região entre a cultura e os túbulos de Malpighi. Para fazer isso, remova a parte frontal do animal e remova o intestino grosso.Em seguida, transfira rapidamente o intestino médio para um tubo de microcentrífuga com 100 microlitros de tampão salino de insetos. Colete o intestino médio de seis baratas no mesmo tubo. Em seguida, agite o tubo por 10 segundos.Em seguida, centrifugue a mistura por 10 minutos para separar os hemócitos e os tecidos intestinais. Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo e ajuste a concentração para seis miligramas de proteína por microlitro. Os lipoplexos de RNA de fita dupla devem ser usados dentro de uma hora após a preparação.Durante a preparação, certifique-se de combinar todo o reagente diluído com o RNA de fita dupla diluído ao mesmo tempo. Em seguida, bata rapidamente e incube a mistura. Quando estiver pronto, misture quatro microlitros da solução de RNA de fita dupla com 10 microlitros de tampão salino de inseto como controle, ou misture com 10 microlitros de enzimas extraídas retiradas da hemolinfa ou do suco do intestino médio.Em seguida, faça um controle inibido por enzima adicionando dois microlitros de EGTA. Caso contrário, adicione dois microlitros de água sem RNase. Em seguida, incube as amostras por uma hora ou mais a 25 graus Celsius.Após a incubação, adicione 200 microlitros de reagente de extração e 40 microlitros de clorofórmio e, em seguida, vórtice. Em seguida, centrifugue as amostras por 10 minutos. Em seguida, transfira 150 microlitros de cada sobrenadante para um novo tubo e precipite o RNA de fita dupla de cada amostra adicionando 150 microlitros de isopropanol e incubando as amostras no gelo por 15 minutos.Após a incubação, centrifugue novamente as amostras e descarte o sobrenadante. Em seguida, lave os pellets de RNA duas vezes, adicionando 200 microlitros de etanol a 70% a cada pellet e centrifugando o tubo. Após a segunda lavagem, secar os grânulos de RNA de fita dupla usando um concentrador centrífugo a vácuo por três minutos.Em seguida, ressuspenda os pellets em 10 microlitros de água livre de RNase. Finalmente, verifique a integridade do RNA de fita dupla tratado usando um gel de 1,5% de agarose. Alimente as baratas duas vezes por dia, uma hora após o acendimento das luzes e uma hora antes do apagar das luzes.Faça isso por oito ou 16 dias sem pausas. Durante esse período, as baratas devem ficar sem água. Para a alimentação, ter lipoplexos de RNA de fita dupla recém-preparados e RNA de fita dupla nu disponíveis.Para o bolus, use com quatro microlitros de lipoplexos de RNA de fita dupla ou 250 nanogramas de RNA de fita dupla nua. Para alimentar uma barata, primeiro agarre-a pelas asas usando uma pinça flexível. Não pegue as partes do corpo de uma barata.Em seguida, pipete lentamente a gota de solução perto das peças bucais e observe como a barata ingere a gota. Após a última alimentação, forneça garrafas de água para as baratas. Durante todo o período de alimentação, avalie os insetos diariamente para verificar a mortalidade e remova as baratas que não estão mais se movendo do experimento.A administração oral contínua de lipoplexos de tubo de fita dupla foi capaz de diminuir a expressão de tubulina no intestino médio de 40% no dia nove para 60% no dia 17. Em comparação, o RNA de fita dupla nu não teve efeito. Isso provavelmente se deve à descoberta de que a exposição do RNA de fita dupla nu ao suco do intestino médio resultou em degradação dentro de uma hora, enquanto o RNA de fita dupla conjugado com lipossomas permaneceu estável.Não apenas os níveis de RNA diminuíram, mas a alimentação contínua dos lipoplexos de RNA de fita dupla da tubulina também resultou em letalidade significativa. É improvável que isso seja devido ao vetor, pois os lipoplexos que transportam RNA de fita dupla para EGFP não resultaram em letalidade. Ao tentar este sistema de entrega oral de interferência de RNA, é importante realizar uma alimentação contínua de RNA de fita dupla por vários dias.Uma vez dominado, a etapa de alimentação pode ser feita em dois minutos por inseto se for realizada corretamente. Se necessário, diferentes formulações de nanopartículas de lipossomas podem ser aplicadas para melhorar o procedimento de alimentação e a eficiência do RNAi. Em última análise, essa técnica tornou viável para pesquisadores da área de manejo de pragas explorar novas estratégias de controle usando RNAi.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Transcrição in vitro e nivelamento de Gaussia mRNA luciferase Seguido por HeLa transfecção celular

Aprenda a depletar a expressão gênica no intestino de baratas usando interferência de RNA via ingestão oral de RNA de fita dupla encapsulado em lipossomas. Este método protege o RNA e garante sua entrega às células-alvo.

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