Name: Uso prático da interferência do RNA: Oral entrega de RNA Double-stranded em lipossomas transportadoras para baratas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a depletar a expressão gênica no intestino de baratas usando interferência de RNA via ingestão oral de RNA de fita dupla encapsulado em lipossomas. Este método protege o RNA e garante sua entrega às células-alvo.

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Este estudo foi suportado por doações de Taiwan (Ministério da ciência e tecnologia, mais 100-2923-B-002-002-MY3 e 106-2313-B-002-011-MY3 para H.J.L.), República Checa (conceder a agência da Boémia do Sul, Universidade, Magali conceder 065/2017/P para Y.H.L) e Espanha ( Ministério da economia espanhola e competitividade, concede CGL2012-36251 e CGL2015-64727-P a X.B. e o governo catalão, conceder 2014 SGR 619 a X.B.); também recebeu apoio financeiro do Fundo Europeu para o desenvolvimento económico e Regional (fundos FEDER para X.B.).

1. síntese e preparação do dsRNA
<ol><li>Identifica os sites de destino do dsRNA da região untranslated 3' do gene-alvo. O dsTub é usado para o direcionamento do gene da α-tubulina (banheira) (número de adesão GenBank: KX228233), e dsEGFP como um controle negativo dsRNA destina-se a sequência de melhor proteína fluorescência verde (EGFP; Número de adesão GenBank: LC311024).</li>
	<li>Executar a amplificação por PCR padrão para sintetizar os modelos dsRNA com primers de gene-específico que contém a sequência de promotor T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). As condições de amplificação do PCR e informações de primeira demão usados são aqueles relatados por Lin et al. (2017) 12 (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Prosseguir com a preparação do dsRNA usando uma transcrição de T7 Kit (veja a Tabela de materiais), seguindo as instruções do fabricante. Nota: Para produzir quantidade elevada dsRNA, misture duas reações em um tubo (no total 40 µ l) e incubar a 37 ° C durante a noite.</li>
	<li>Adicionar 2 µ l de DNase (ver Tabela de materiais) em amostras de dsRNA por 15 min a 37 ° C para digerir modelos de DNA.</li>
	<li>Adicionar o reagente de extração 200 µ l (veja a Tabela de materiais) e clorofórmio 40 µ l, então o vórtice.</li>
	<li>Centrifugar durante 10 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, recolher o sobrenadante (150 µ l) em um novo tubo de microcentrifugadora.</li>
	<li>Precipitar dsRNA adicionando 150 µ l isopropanol e incubar por 15 min no gelo.</li>
	<li>Centrifugar por 15 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, remover o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 200 µ l de etanol 70% para lavar dsRNA Pelotas. Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Remover o etanol e repita as etapas de lavagem do etanol.</li>
	<li>Remover o etanol e o pellet seco dsRNA por concentradores centrífugos de vácuo por 3 min, em seguida, resuspenda dsRNA com água livre de RNase.</li>
	<li>Determinar a quantidade do dsRNA purificada usando um espectrofotômetro UV-Vis de micro-volume (ver Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante e ajustar para a concentração desejada (por exemplo, 0,25 µ g / µ l para a preparação de lipoplexes dsRNA).</li>
	<li>Armazene as amostras de dsRNA a-20 ° C por até 3 meses.</li>
</ol>2. preparação do dsRNA Lipoplexes
<ol><li>Dilua 4 µ l de reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais), adicionando 4 µ l de solução de glicose 5%. Dilua 4 µ l do dsRNA (1 µ g), adicionando 4 µ l de solução de glicose 5%.</li>
	<li>Adicione a solução de reagente diluído em lipossomas imediatamente na solução diluída dsRNA tudo de uma vez. Vórtice brevemente para misturá-los e, em seguida, incube por 15 min a 25 ° C. Nota: Não misture as soluções na ordem inversa.</li>
	<li>Os dsRNA lipoplexes estão prontas para uso. Use dentro de 1 hora de preparação e descartar depois de 1 hora. Nota: De acordo com as instruções do fabricante, os lipoplexes deve ser usado logo que possível.</li>
</ol>3. coleção de enzimas extracelulares de hemolinfa e suco Midgut
<ol><li>
Inseto tampão salino (estoque de x 10)
	<ol>
<li>Misture 900 mL de água bidestilada com 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl, 6,3 g de CaCl2e 8,3 g MgCl2·6H2O.</li>
		<li>Ajustar o pH para 6,8 e preencher até 1.000 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coleção de hemolinfa
	<ol>
<li>Anestesia as baratas no gelo até que eles não se movem por 3 min.</li>
		<li>Segurar a barata com dois dedos (polegar e dedo indicador) e aparece do lado ventral da barata.</li>
		<li>Use a dissecação tesoura para cortar a ponta de uma coxa de uma pata traseira. Nota: Corte o cruzamento conectado entre a coxa e o trocânter. A excisão da outra parte da coxa foi menos eficiente para coletar a hemolinfa.</li>
		<li>Aperte o abdômen suavemente com o dedo médio e recolher a hemolinfa sangramento da incisão com uma micropipeta de 10 µ l.</li>
		<li>Piscina a hemolinfa de várias baratas (5 pessoas) em um tubo de microcentrifugadora. Nota: Manter os tubos microcentrifuga no gelo para evitar melanização. O volume médio de hemolinfa obtido de uma barata masculina é 2-3 µ l.</li>
		<li>Spin para baixo a hemolinfa brevemente com uma centrífuga de bancada de 10 s.</li>
		<li>Transferir o volume desejado de hemolinfa (ou seja, 10 µ l) e misturá-lo com 50 µ l de tampão salino inseto 1 de x.</li>
		<li>Centrifugação por 10min a 1.000 x g a 4 ° C a girar para baixo hemócitos. Transferi o sobrenadante para um tubo limpo microcentrifuga.</li>
		<li>Quantificar a concentração de proteína total usando um espectrofotômetro UV-Vis de micro-volume medindo A28015.</li>
		<li>Ajuste cada amostra para ter a mesma concentração de proteína (6 mg / µ l de proteínas totais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coleção de suco do intestino
	<ol>
<li>Anestesia as baratas no gelo. Arrumar as baratas lado ventral na placa de dissecação com insetos tampão salino de frio 1x usando pinos de insetos.</li>
		<li>Disse o abdômen com uma pinça fina. Remova o intestino inteiro (incluindo o intestino frontal, meados e patas traseiro) para um prato fresco com 1x tampão salino de insetos.</li>
		<li>Remover o intestino dianteiro e traseiro e transferir rapidamente o intestino para um tubo de microcentrifugadora que contém o tampão salino inseto de 100 µ l.</li>
		<li>Piscina do midguts de seis baratas no mesmo tubo e vórtice por 10 s.</li>
		<li>Centrifugação por 10min a 1.000 x g a 4 ° C a girar para baixo o hemócitos e tecidos do intestino. Transferi o sobrenadante para um tubo limpo microcentrifuga.</li>
		<li>Quantificar a concentração de proteína total usando um espectrofotômetro UV-Vis de micro-volume medindo A28015.</li>
		<li>Ajuste cada amostra para ter a mesma concentração de proteína (6 mg / µ l de proteínas totais).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. dsRNA ensaio de degradação
<ol><li>Recentemente a preparar 4 µ l do dsRNA nua ou lipoplexes dsRNA (1 µ g).</li>
	<li>Misture dsRNA enzimas de soluções com 10 µ l de tampão salino de insetos (controle), extraídas de hemolinfa, ou intestino suco.</li>
	<li>Adicione 2 µ l de EGTA (20mm) ou água livre de RNase para separar amostras como controles para inibição de actividades enzimáticas.</li>
	<li>Incubar durante 1 hora ou mais (6, 12 ou 24 horas) a 25 ° C.</li>
	<li>Adicione 200 µ l extração reagente e clorofórmio 40 µ l, então o vórtice.</li>
	<li>Centrifugar durante 10 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, recolher o sobrenadante (150 µ l) em um novo tubo de microcentrifugadora.</li>
	<li>Precipitar dsRNA adicionando 150 µ l isopropanol e incubar por 15 min no gelo.</li>
	<li>Centrifugar por 15 min a 13.000 x g a 4 ° C e, em seguida, remover o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 200 µ l de etanol 70% para lavar dsRNA Pelotas. Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Remover o etanol e repita as etapas de lavagem do etanol.</li>
	<li>Remova o etanol e o pellet seco dsRNA por concentradores de vácuo centrífugas para 3 min. Ressuspender dsRNA com água livre de RNase a µ l 10.</li>
	<li>Verificar a integridade do dsRNA Tratado através de eletroforese em gel em um gel de agarose 1,5%.</li>
</ol>5. oral administração do dsRNA
<ol><li>Manter as baratas em uma dieta ad libitum do alimento seco (comida). Priva o abastecimento de água desde as baratas um dia antes experimentos de ingestão do dsRNA.</li>
	<li>Segure uma barata, agarrando suas asas com as pinças flexíveis (Figura 1, passo 5). Nota: Não pegue as partes do corpo das baratas.</li>
	<li>Prepare o dsRNA lipoplexes, bem como dsRNA nua, para a alimentação, conforme descrito na seção 2. Nota: O dsRNA lipoplexes deve ser preparado na hora antes da alimentação.</li>
	<li>Alimentar 4 µ l de lipoplexes dsRNA ou nu dsRNA (250 ng) com uma micropipeta.</li>
	<li>Lentamente, pipetar a gota da solução dsRNA perto o aparelho bucal de baratas e deixe as baratas ingerir a gota completamente.</li>
	<li>Realizar os experimentos de ingestão de duas vezes por dia (1h Após luzes acesas e 1h antes de luzes apagadas) por 8 dias ou 16 dias continuamente. Nota: Todas as baratas adquiriram água apenas através de alimentação manual com reagentes dsRNA solução ou controle (por exemplo, água livre de nuclease, solução de glicose e reagente lipossoma) durante experimentos de ingestão.</li>
	<li>Fornecem garrafas de água para as baratas após 16 dias de ingestão das experiências de dsRNA.</li>
</ol>6. avaliar Knockdown
<ol><li>No tempo escolhido pontos (2, 9 e 17 dias depois do ensaio de ingestão do dsRNA), coletar os insetos dsEGFP - e dsTub-tratada e dissecar os tecidos escolhidos (por exemplo, intestino).</li>
	<li>Realize o PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). As condições de amplificação de qRT-PCR e informações da primeira demão, conforme relatado por Lin et al. (2017) 12.</li>
	<li>Avalie o controle e o dsRNA-tratados insetos diariamente para verificar a mortalidade e remover as baratas que já não se move.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo apresenta um método para RNAi eficaz através de entrega oral dos lipoplexes dsRNA, envolvendo proteção contra digestão ribonuclease no suco de intestino da barata alemão. Como mostrado em outros estudos em várias espécies de insetos, o efeito de RNAi pobre através de entrega oral do dsRNA principalmente é contabilizado pela degradação de dsRNA8,9,10. Este protocolo produz lipossomas que servem como proteção veícul...

RNAi tem sido demonstrado como um método eficaz para a expressão do gene "knockdown" através de um mecanismo de uma via de silenciamento pós-transcricional desencadeada por moléculas de dsRNA em muitos eucariotos1. Durante a última década de estudo, RNAi tornou-se uma ferramenta útil para estudar as funções dos genes de desenvolvimento para o comportamento por esgotar a expressão de genes específicos, através da injeção e/ou alimentação do dsRNA em vários táxons de insetos2,3. Devido a especificidade e a robustez do efeito de esgotamento, a aplicação de RNAi atualmente está sendo considerada como uma estratégia potencial para controle de pragas de gestão4,5. No entanto, a eficiência de RNAi varia amplamente entre as espécies de insetos, consoante os diferentes genes alvo e os métodos de entrega. Um corpo crescente de evidências sugere que a instabilidade do dsRNA, que é degradada por ribonucleases, é um fator crítico na eficácia limitada de RNAi5,6. Por exemplo, a baixa sensibilidade de RNAi em Manduca sexta foi explicada pelo fato de que o dsRNA misturado com hemolinfa foi rapidamente degradado dentro de 1 hora,7. Da mesma forma, a presença de nucleases alcalinas no intestino, que eficientemente degradar dsRNA ingerido, é fortemente correlacionada com baixa eficiência de RNAi em diferentes ordens de insetos8,9,10.
A entrega oral de dsRNA é particularmente interessante para a aplicação de RNAi em uma estratégia de controle de pragas, mas um método para retardar a degradação do dsRNA pelas nucleases no intestino ainda não foi desenvolvido, que teria potencial para assegurar a eficaz RNAi através da alimentação. No entanto, a apatia de RNAi para entrega oral do dsRNA foi relatada por alimentação grande quantidade de dsRNA, por exemplo, 50 µ g/ml Bombyx mori, ou continuamente alimentando por 8 dias (8 µ g dsRNA no total) das espécies de gafanhoto. A baratinha, Blattella germinica, é altamente sensível a RNAi através da injeção de dsRNA11,12,13,14, mas não é responsiva ao dsRNA através da alimentação. Recentemente, Lin et al. (2017) demonstraram que o dsRNA encapsulados com resultados de transportadoras em lipossomas em RNAi bem sucedida a nocaute a expressão do gene α-tubulina no intestino e gatilho mortalidade significativa da baratinha15. Como a degradação do dsRNA no intestino é o fator limitante para RNAi oral, os portadores de lipossoma servem como um veículo para proteger dsRNA de degradação, que é facilmente aplicável em outros insetos com atividades de nuclease forte no intestino. Digno de nota, o motivo para a escolha do reagente de transfeccao particular (ver Tabela de materiais) usamos como portador de lipossomas no atual protocolo é que ele foi testado para transfeccao de linha celular inseto com menor toxicidade, de acordo com o instruções do fabricante. De acordo com a comparação dos sistemas de transfeccao lipossoma diferentes no guerreiro et al (2013) 16, a eficiência do transfecting RNA de interferência pequeno (siRNA) é aproximadamente o mesmo entre este e a outros sistemas disponíveis comercialmente que têm sido utilizados para sistemas de entrega dsRNA em outros insetos17,18 . Além disso, nosso método de alimentação é cuidadoso o suficiente para garantir a quantidade adequada de dsRNA é ingerida por cada barata, e que os resultados são robustos e confirmado. Em resumo, o presente protocolo e os resultados demonstram que usar dsRNA lipoplexes melhora a estabilidade do dsRNA e abre as portas para o design da entrega oral estratégia de RNAi, que é uma abordagem promissora para controle de pragas no futuro.

<table><tbody><tr><td>GenJe Plus DNA in vitro Reagente de transfecção</td><td>SignaGen</td><td>SL100499</td><td>para preparação de lipoplexos</td></tr><tr><td>Blend Taq plus</td><td>TOYOBO&nbsp;</td><td>BTQ-201</td><td>para PCR</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>ABI&nbsp;</td><td>4385612</td><td>para qPCR</td></tr><tr><td>FirstChoice RLM-RACE Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1700</td><td>para identificação UTR de 3'&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de Transcrição MEGAscript T7</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>para síntese de dsRNA</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2239</td><td>remove o molde de DNA do dsRNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>para extração de dsRNA ou RNA total</td></tr><tr><td>RQ1 Dnase-Free Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>remove o molde de DNA do RNA total&nbsp;</td></tr><tr><td>clorofórmio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>para extração de dsRNA ou RNA total</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td>para dsRNA ou etanol de extração de RNA total</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td><td>para extração de dsRNA ou RNA total</td></tr><tr><td>Dietilpirocarbonato, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>para solução de glicose de preparação de água livre de RNase</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3285</td><td>para preparação de lipoplexos</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio, NaCl</td> Fórmula de <td>tampão salino de insetos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td></tr><tr>Cloreto de potássio, <td>fórmula de tampão de solução salina de insetos</td><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio, CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>fórmula</td></tr> <tr><td>de tampão salino de insetosCloreto de magnésio hexahidratado, MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td> fórmula <td>de tampão salino para insetos</td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>Inibidor da enzima Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>tesoura de dissecação</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>pinças finas de dissecação</td></tr> de <tr><td>baratas</td><td>F.S.T.</td><td></td> pinça flexível para <td>dissecação de baratas</td></tr><tr><td></td><td>F.S.T.</td><td></td><td>Barata segurando&nbsp;</td></tr><tr><td>pipetman</td><td>RAININ</td><td>P10</td> tubo de <td>microcentrífuga para preparação de amostras</td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td>MCT175C, PCR02C</td><td>para preparação de amostras</td></tr><tr><td>ponta de pipeta&nbsp;</td>Vortexter de <td>preparação de amostras</td> <td>Axygen</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Digisystem</td><td>vm1000</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga Minispin</td><td>de preparação de amostras O Grupo Gruffin</td><td>GMC 206</td><td>para redução de rotação líquida&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>ALC</td><td>PK121R</td><td>preparação de amostras</td></tr><tr><td>Medidor de pH&nbsp;</td><td>JENCO</td><td>6071</td><td>para</td></tr><tr><td>espectrofotômetro de micro-volume</td> de ajuste de pH <td>Quawell</td><td>Q3000</td><td>ácido nucleico PCR quantitativo</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>ABI&nbsp;</td><td>2720</td><td>para PCR modelo ou&nbsp; síntese de dsRNA incubação&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR quantitativo em tempo real</td><td>ABI&nbsp;</td><td>Concentradores</td> Centrífugos <td>a Vácuo quantitativos de expressão gênica</td></tr><tr><td></td><td>StepOne plus eppendorf</td><td>5301</td><td>para extração de dsRNA ou RNA total</td></tr><tr><td>Multipette&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>xstream</td><td>para carregamento de amostras de PCR em tempo real&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>amresco</td><td>0710</td><td>para eletroforese de ácido nucleico</td></tr><tr><td>tub gene specfifc forward preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td></tr><tr><td>tub gene specfifc reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA</td></tr><tr><td>dsTub template forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG&nbsp;</td></tr><tr><td>modelo dsTub reverse primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsEGFP modelo para a frente preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG</td></tr><tr><td>dsEGFP modelo reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC</td></tr><tr><td>tub qPCR forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC</td></tr><tr><td>banheira qPCR reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC</td></tr><tr><td>ef1 qPCR forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A</td></tr><tr><td>ef1 qPCRreverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCT GCA GAG GAA GAC GAA G</td></tr></tbody></table>

uso prático da interferência do rna: oral entrega de rna double-stranded em lipossomas transportadoras para baratas

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA de interferência (RNAi) tem sido aplicado extensamente para descobrir as funções biológicas de numerosos genes e foi previsto como uma praga controle ferramenta de exploração por perturbação da expressão do gene essencial. Embora diferentes métodos, tais como a injeção, alimentação e imersão, têm sido relatados para entrega bem sucedida de RNA double-stranded (dsRNA), a eficiência de RNAi através de entrega oral do dsRNA é altamente variável entre os diferentes grupos de insetos. A baratinha, Blattella germanica, é altamente sensível à injecção de dsRNA, como mostrado por muitos estudos publicados anteriormente. O presente estudo descreve um método para demonstrar que o dsRNA encapsulado com transportadoras em lipossomas é suficiente para retardar a degradação do dsRNA por suco de intestino. Notavelmente, a alimentação contínua do dsRNA encapsulado por lipossomas significativamente reduz a expressão de tubulina no intestino e levou à morte de baratas. Em conclusão, a formulação e utilização dos lipoplexes dsRNA, que protegem o dsRNA contra nucleases, poderiam ser um uso prático de RNAi para controle de pragas de insetos no futuro.

Um esquema simplificado do protocolo de entrega oral do dsRNA é apresentado na Figura 1, onde as principais etapas para a preparação dos lipoplexes dsRNA são mostradas.
A fim de investigar a protecção dada pelas transportadoras em lipossomas em cima dsRNA degradação no suco de intestino de b. germanica, um ensaio ex vivo , onde foi realizado o dsTub lipoplexes foram incubados com s...

Este manuscrito demonstra o esgotamento de expressão gênica no intestino da barata alemão através da ingestão oral de RNA double-stranded encapsulada em lipossomas.

Uso prático da interferência do RNA: Oral entrega de RNA Double-stranded em lipossomas transportadoras para baratas

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

O objetivo geral deste protocolo é esgotar a expressão gênica no intestino de baratas usando interferência de RNA por meio da ingestão oral de RNA de fita dupla encapsulado em transportadores de lipossomas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no desenvolvimento de novos métodos de controle de pragas, como derrubar genes essenciais em campo aberto pode matar pragas? A principal vantagem dessa técnica é que o lipossomo protege o RNA de fita dupla específico do gene para garantir sua entrega à célula-alvo.Demonstrando o procedimento estarão Jia-Hsin Huang, um pós-doutorado, e Yun Liu, um técnico do meu laboratório. Para começar, anestesie as baratas no gelo até que elas não se movam por três minutos. Em seguida, pegue um inseto usando o polegar e o indicador para acessar seu lado ventral.Em seguida, use uma tesoura de dissecação para cortar a ponta de uma coxa de uma perna traseira entre a coxa e o trocânter. O corte em outras partes da coxa é menos eficiente para as coleções de hemolinfa. Agora, posicione uma micropipeta de 10 microlitros na incisão e aperte o abdômen suavemente enquanto extrai a hemolinfa sangrando.Repita esse processo até que a hemolinfa de cinco b

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Biologia

Interferência de RNA tem se mostrado muito eficaz para analisar a função do gene...

RNAi Interferência por injeção dsRNA em Drosophila Os embriões

Aqui, descrevemos um processo para a inibição da função do gene em vectores mosquitos doença através do uso de quitosano / interferindo nanopartículas de RNA que são ingeridos pelas larvas.

A quitosana / RNA de interferência Nanoparticle Mediated silenciamento gênico na Doença Vector Mosquito Larvas

Aqui, apresentamos os protocolos de criação de um besouro intermediário de germes, Dermestes maculatus (D. maculatus) no laboratório. Também compartilhamos protocolos de RNAi embrionário e parental e métodos para análise de fenótipos embrionárias para estudar a função de genes nesta espécie.

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle, Dermestes maculatus

Este artigo demonstra novas técnicas desenvolvidas para entrega oral de RNA double-stranded (dsRNA) através dos tecidos vasculares das plantas para o RNA de interferência (RNAi) na seiva do floema alimentação de insetos.

Métodos de entrega Double-stranded RNA Oral para induzir a interferência do RNA no floema e insetos Hemipteran planta-sap-alimentação

Este protocolo descreve uma metodologia de microinjeção que temos padronizado e utilizado por vários anos para entregar quantidades específicas de ácidos nucleicos diretamente a hemolinfa de mosquitos e moscas domésticas. Este protocolo resulta em mortalidade de injeção mínima e permite medições de dose correlacionado de fecundidade.

Reprodutível dsRNA Microinjection e Bioassay de oviposição em mosquitos e moscas domésticas

A interferência de RNA é uma técnica amplamente aplicável e poderosa para manipular a expressão genética em estágios específicos de desenvolvimento. Aqui, descrevemos os passos necessários para a implementação dessa técnica no besouro de mergulho aquático Thermonectus marmoratus, desde a aquisição de sequências genéticas até o knockdown de genes que afetam a estrutura ou o comportamento.

Interferência de RNA em besouros aquáticos como uma poderosa ferramenta para manipular a expressão genética em pontos de tempo específicos de desenvolvimento

A administração oral do dsRNA produzido por bactérias, um método de entrega para interferência de RNA (RNAi) que é rotineiramente utilizado em caenorhabditis elegans, foi aplicada com sucesso aqui em mosquitos adultos. Nosso método permite estudos robustos de genética reversa e estudos de vetores de bloqueio de transmissão sem o uso de injeção.

Administração eficaz de interferência oral de RNA (RNAi) para mosquitos anofeeles gâmbias adultos

O presente protocolo descreve as diretrizes passo a passo para as técnicas de operação rnai em P. americana.

Aplicações de interferência de RNA na barata americana

Apresentado aqui é um protocolo para entrega de nanopartículas de quitosana/dsRNA em larvas de Bombyx mori de bicho-da-seda para induzir o silenciamento de genes por ingestão.

Interferência de RNA Larval no Bicho-da-Seda Bombyx mori por meio da Entrega de Nanopartículas de Quitosana/dsRNA

Este método descreve a síntese in vitro com alto rendimento de RNA mensageiro (mRNA) tanto com capuz quanto sem capuz, a partir de um plasmídeo linearizado contendo o gene da luciferase de Gaussia (GLuc). O RNA é purificado e uma fração do RNA sem capuz é cappingada enzimaticamente utilizando a enzima de capping do vírus Vaccinia. Na etapa final, o mRNA é transfetado em células HeLa e os sobrenadantes do cultivo celular são analisados quanto à atividade da luciferase.

Transcrição in vitro e nivelamento de Gaussia mRNA luciferase Seguido por HeLa transfecção celular

Aprenda a depletar a expressão gênica no intestino de baratas usando interferência de RNA via ingestão oral de RNA de fita dupla encapsulado em lipossomas. Este método protege o RNA e garante sua entrega às células-alvo.

Uso prático da interferência do RNA: Oral entrega de RNA Double-stranded em lipossomas transportadoras para baratas

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