Artigo de método

Otimizando o uso de um robô de manipulação líquidos para conduzir a uma alta taxa de transferência para a frente química genética tela de Arabidopsis thaliana

DOI:

10.3791/57393

⸱

30 de abril de 2018

 ,  , 
1Department of Horticulture, University of Kentucky

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Realizou-se uma tela de alta taxa de transferência de moléculas pequenas sintéticas sobre espécies a planta modelo Arabidopsis thaliana. Este protocolo, desenvolvido para um robô de manipulação de líquidos, aumenta a velocidade das telas de genética de química para a frente, acelerando a descoberta de novas moléculas pequenas, que afetam a fisiologia vegetal.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Química genética é cada vez mais sendo empregada para decodificar traços nas plantas que podem ser recalcitrantes à genética tradicional devido à redundância de gene ou letalidade. No entanto, a probabilidade de uma pequena molécula sintética, sendo bioativos é baixa; Portanto, milhares de moléculas devem ser testados a fim de encontrar aqueles de interesse. Robótica, sistemas são projetados para lidar com um grande número de amostras, aumentando a velocidade com que uma biblioteca de química pode ser rastreada além de minimizar/padronização erro de manuseio de líquidos. Para obter uma tela de alta produtividade para a frente química genética de uma biblioteca de 50.000 moléculas pequenas em Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocolos usando um líquido de multicanal de bancada manipulação robô foram desenvolvidos que exigem mínima envolvimento de técnico. Com estes protocolos, 3.271 pequenas moléculas foram descobertas que causou alterações fenotípicas visíveis. 1.563 compostos induziram raízes curtas, coloração 1.148 compostos alterados, 383 compostos causados raiz do cabelo e outras, não-Categorizado, alterações e germinação de 177 compostos inibidas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos últimos 20 anos pesquisadores no campo da biologia vegetal tem feito grandes progressos usando abordagens química genética, tanto para diante e reversos, melhorando nossa compreensão da biossíntese da parede celular, o citoesqueleto, a biossíntese do hormônio e sinalização, geotropismo, patogênese, biossíntese de purinas e endomembranoso tráfico1,2,3,4,5. Empregando técnicas de genética para a frente de química permite a identificação de fenótipos de interesse e permite que os pesquisadores a entender os fundamentos genotípicos de processos particulares. Por outro lado, genética química inversa procura produtos químicos que interagem com uma proteína pré-determinado alvo6. Arabidopsis tem sido na vanguarda destas descobertas em biologia vegetal, porque o seu genoma é pequena, mapeado e anotado. Tem um tempo de geração curto, e existem várias linhas de mutante/repórter disponíveis para facilitar a identificação de máquinas subcellular aberrante7.

Existem dois grandes estrangulamentos que retardar o progresso da frente químicas genéticas telas, inicial processo de triagem e determinar o destino do composto de interesse8. Uma grande ajuda no aumento da velocidade de seleção pequena molécula é o uso de automação e equipamentos automatizados9. Robôs de manipulação de líquido são uma excelente ferramenta para a manipulação de grandes bibliotecas de moléculas pequenas e têm sido fundamentais para dirigir o progresso da ciências biológicas10. O protocolo aqui apresentado é projetado para aliviar o gargalo associado com o processo de seleção, permitindo a identificação de moléculas bioativas de pequenas em uma taxa rápida. Esta técnica diminui a carga de trabalho e tempo em nome do operador, enquanto também, diminuindo o custo econômico para o investigador de princípio.

Até então, bibliotecas mais químicas analisadas realizaram entre 10.000 e 20.000 compostos, alguns com até 150.000 e alguns com tão poucos como 709,11,12,13,14, 15 , 16. o protocolo apresentado neste documento foi implementado em uma biblioteca pequena molécula de 50.000 compostos (ver Tabela de materiais), um dos maiores genética química frente ecrãs conduzidos em Arabidopsis até à data. Este protocolo se encaixa com a atual tendência para aumentar a eficiência e velocidade sobre genética de química para a frente, especialmente no que tange a descoberta de herbicida, descoberta de inseticida, fungicida descubra, droga descoberta e a biologia do câncer17 ,18,19,20,21. Embora implementado aqui com Arabidopsis, este protocolo, poderia ser facilmente adaptadas às culturas de células, esporos e potencialmente até insetos em meio líquido, dentro de 96, 384- ou placas boas 1536. Devido ao seu pequeno tamanho, Arabidopsis é passível de triagem em 96 placas bem. No entanto, distribuir sementes uniformemente entre poços é um desafio. Semeadura de mão é preciso mas mão de obra intensiva, e embora existam dispositivos projetados para dispensar as sementes em placas de 96 poços, eles são caros para comprar. Aqui, nós mostramos como este passo pode ser contornado com apenas uma pequena perda de precisão.

O objetivo geral deste método era fazer a triagem de uma grande biblioteca de química contra Arabidopsis mais gerenciável, sem comprometer a precisão, através do uso de um robô de manipulação de líquidos. O uso desse método melhora a eficiência do pesquisador, diminuindo o tempo levado para completar a gestão de séries de diluição inicial e subsequentes telas fenotípicas, permitindo a visualização rápida de amostras sob um microscópio de dissecação e rápida identificação de novas moléculas pequenas bioativas. A Figura 1 mostra os resultados-chave do presente protocolo em 4 passos.

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Figura 1: fluxo de trabalho geral da tela frente química genética. Uma visão geral do protocolo a ser descrito com algum detalhe para cada uma das 4 principais etapas. 1: receber a biblioteca química, 2: fazendo a biblioteca de diluição, 3: fazendo as placas de triagem e 4: incubar e visualizando as placas de triagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

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1. criação de uma biblioteca de diluição

  1. Rotule 625 placas de diluição biblioteca à mão, garantindo que eles correspondem à sua placa correspondente da biblioteca de química. Além disso, conectar-se no fluxo e mangueiras de fluxo para o multicanal dica lavagem automatizada Labware posicionador (ALP), passando-os através da unidade de Console para o reservatório de 5 galões (ver Tabela de materiais).
  2. Acessar o computador e ligue a bomba de lavagem através da conexão do controlador de dispositivo para o ALP lavagem dica multicanal para circular a água. Isto desliga-se automaticamente no final do protocolo.
  3. Carga, à mão, o empilhador 10 anexado para o carrossel de empilhador, na seguinte ordem Hotéis A - D (Figura 4, empilhador); uma caixa de pontas de pipetas de P20 AP96 na sala 1, quatro V 96 poços-placas de fundo em quartos de 2-5 com as duas placas superiores contendo concentrações estoque da biblioteca ordenada e as duas placas inferiores vazios (Figura 5, empilhador). Além disso, carregar uma caixa de pontas de pipetas de P20 AP96 no quarto 6 e quatro V 96 poços-placas de fundo nas salas 7-9 com as duas placas superiores contendo concentrações estoque da biblioteca ordenada e as duas placas inferiores vazios (Figura 5, empilhador).
  4. Definir, com a mão, o deck com um reservatório de água de 300 mL na P3, um banho de EtOH 70% 300 mL na P7, dica Loader ALP (TL1) e multicanal dica lavagem ALP (TW1) (Figura 4, Deck e Figura 5, Deck).
  5. Usando o software operacional, apresentar pontas de pipetas de P20 AP96 do 10 de empilhador e movê-los para o ALP carregador de ponta.
    Nota: 1.5 através de 1.12 todos são feitos com o líquido manipulação software operacional do robô; consulte Tabela de materiais.
  6. Apresentar 2 quarto de Hotel A e separar todos os quatro 96 poços V-fundo placas no convés, colocando a parte inferior dois P4 e P8 e os dois primeiros em P5 e P9 (Figura 4).
  7. Carrega AP96 P20, pontas de pipeta com o carregador de ponta ALP para a cabeça do 96-canal 200 µ l. Aspire 90 µ l do reservatório de água de 300 mL e dispense na V 96 poços-placa de diluição inferior em P4. Repita essa etapa para a placa na P8.
  8. Misture a placa biblioteca química na P5 por repetidamente por aspiração e dispensação 15 µ l três vezes. Além disso, o Aspire 10 µ l da placa de biblioteca química na P5 e dispense 10 µ l em chapa de diluição P4.
  9. Misture as soluções da placa em P4 por repetidamente por aspiração e dispensação 50 µ l, um total de três vezes. Uma vez misturado, limpe as pontas de pipetas de P20 AP96 por aspiração e dispensação 70 µ l de 70% EtOH da P7, então lavá-los no multicanal dica ALP de lavagem por aspiração e dispensação de um volume de 110% de água quatro vezes.
  10. Repita as etapas 1.8-1.9 para o segundo par de placas na P8 e P9. Após criar o segundo V 96 poços-placa de diluição inferior, pilha os pratos na seguinte ordem de baixo para cima: P4, P5, P8 e P9. Em seguida, coloque a pilha em um vazio estático ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 ou P13.
  11. Repita as etapas de 1.6-1.10 até 5 quarto em Hotel A esvaziar. Repita a etapa 1.5 atingindo o quarto 6, movendo-se pontas de pipetas de P20 AP96 novo para o ALP Loader dica e colocando as pontas de pipetas de P20 AP96 usado em um vazio estático ALP.
  12. Repita as etapas de 1.6-1.10 até 9 quarto de Hotel A esvaziar. No entanto, para poderem passar ao Hotel B, as placas e dicas sobre o pavimento devem ser recarregadas no Hotel A.
  13. Voltar a encher, com a mão, o reservatório de água de 300 mL. Esta etapa é crucial, e o programa de computador pode incorporar uma pausa detalhando esta mensagem, exigir que o usuário atingiu 'continue', antes de efectuar o próximo passo.
  14. Repita as etapas 1.5-1.13 para os restantes Hotéis, assegurando um reservatório de água cheio de 300 mL cada vez antes de prosseguir para o próximo hotel.

2. adicionando a mistura de sementes de mídia para placas de triagem

  1. Fazer ½ Murashige e Skoog (MS) Media com 0,1% ágar pela adição de 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g de ágar para 1 L DI H2O. ajustar o pH a 5.7 embora a adição de hidróxido de potássio 5m enquanto monitora com uma sonda de pH.
  2. Esterilizar as sementes agitando-los em 1% de alvejante e SDS entre 15 e 30 min e depois enxaguar 4 vezes com igual volume de água por centrifugação. Uma vez que as sementes são estéreis, colocá-los em 4 ° C de 24 horas a 7 dias para vernilization. Centro de recursos biológicos de Arabidopsis descreve métodos adicionais de esterilização, vernilization e crescimento22.
  3. Adicione sementes a media com a mão em uma densidade de 0,1 g/100 mL. Esta densidade resulta em uma média de 3-10 sementes por alvéolo de uma placa de 96 poços.
  4. Lugar, à mão, quatro televisões de 96 poços-placas de fundo nas salas 1 e 2 do Hotel A (Figura 6, A do Hotel). Coloque uma caixa de pontas de pipetas P250 AP96 sobre a dica Loader ALP, um reservatório de 300 mL preenchida com a mistura de sementes de mídia criada em passos 2.1-2.3 no P3, e um reservatório de 300 mL preenchidos com 70% EtOH no P7 (Figura 4, Deck e Figura 6 Baralho).
    Nota: 2.5 através de 2.8 são feitas com o software operacional.
  5. Apresentar salas 1 e 2 num Hotel e separar as pilhas de quatro pratos. Coloque uma placa em cada um dos Alpes vazio estático (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 e P12). Carrega AP96 pontas de pipetas P250 na cabeça 96-canal 200 µ l.
  6. Aspire 90 µ l do reservatório de mídia-semente de 300ml na P3 e dispensar o primeiro flat de 96 poços-placa inferior. Repita este processo até que todos os oito placas contêm a mistura de sementes de mídia.
  7. Limpe as pontas de pipeta P250 AP96 por aspiração e dispensação 70 µ l do reservatório de 300 mL, preenchido com 70% EtOH no P7. Lave as dicas no multicanal dica lavar ALP por aspiração e dispensação de um volume de 110% de água quatro vezes, descarregar as gorjetas no TL1 e recolher os pratos à mão.

3. a adição de pequenas moléculas para placas de triagem

  1. Carga, à mão, uma caixa de pontas de pipetas AP96 P250 na sala 1 do Hotel A, dois V 96 poços-placas de biblioteca de diluição inferior em quartos de 2, 4, 6 e 8 e 2 96 bem fundo plano de triagem placas em quartos de 3, 5, 7 e 9 (Figura 4 Empilhador e Figura 7, um Hotel). Além disso, conecte as mangueiras de e para o ALP multicanal dica lavagem para o reservatório de 5 galões.
    Nota: 3.2 através de 3.10 são feitas com o software operacional.
  2. Configurar o convés para conter um reservatório de lavagem 300 mL 70% EtOH no P7; o reservatório de mídia-semente pode ser deixado no chão, aos P3 (Figura 4, Deck e Figura 7, Deck). Além disso, ligue a unidade de Console através da conexão do controlador de dispositivo para circular a água através do multicanal dica lavagem ALP. Isto desliga-se automaticamente no final do protocolo.
  3. Apresentar a AP96 P250 pipeta dica caixa do Hotel A e movê-lo para o ALP carregador de ponta.
  4. Apresentar o V 96 poços-fundo biblioteca diluição placas de 2 quarto de Hotel A para o convés e coloque um na P4 ALP estático e um na P8. Apresentar o plano de 96 poços-placas de triagem de fundo de quarto 3 do Hotel a plataforma e coloque uma em ALP estático P5 e outra na P9.
  5. Carrega AP96 P250, pontas de pipeta com o carregador de ponta ALP para a cabeça do 96-canal 200 µ l.
  6. Misture o V 96 poços-placa de diluição inferior em P4 por aspiração e dispensação 50 µ l de três vezes. Em seguida, Aspire 10 µ l desta placa e dispensar para o apartamento de 96 poços-placa de rastreio inferior na P5.
  7. Misture as soluções na placa na P5 por aspiração e dispensação 50 µ l de três vezes. Limpe as pontas de pipeta P250 AP96 com etanol por aspiração e dispensação 70 µ l de 70% EtOH do reservatório no P7 e depois lavar as dicas no ALP multicanal dica lavagem por aspiração e dispensação de um volume de 110% de água quatro vezes.
  8. Repita as etapas de 3.5 e 3.6, para o segundo V 96 poços-placa de biblioteca de diluição inferior (P8) e 96 poços Flat-placa inferior de triagem (P9).
  9. Pilha os dois 96 poços V-fundo biblioteca diluição placas juntas e as placas de triagem de fundo liso 96 poços dois juntas. Mova as placas para estático Alpes P1 P2, P6, P10, P11, P12 e P13.
  10. Repita os passos três vezes 3.4-3.9, Adicionar produtos químicos diluídos para triagem chapas um total de oito vezes. Finalmente, verifique o número de sementes em cada poço das placas de triagem através de conformação visual e completar os poços com menos de três sementes por semente esterilizada e vernalized adicionais.

4. incubação e visualização das placas de triagem

  1. Incube as placas de triagem de fundo plano de 96 poços para quatro dias em uma câmara ambiental a 22 ° C em um ciclo claro/escuro de 16/8 em um recipiente à prova de dessecação. Visualize as placas de triagem 96 poços fundo plano sob um microscópio de dissecação. Grave todos os fenótipos aberrantes para maiores investigações.

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Resultados

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A capacidade de precisão e eficiência caracterizam fenótipos baseados a adição de pequenas moléculas em concentrações sob um microscópio dissecação de triagem é o objetivo final deste método de frente química genética em Arabidopsis. Os fenótipos observados quando todos os 50.000 compostos tinham sido selecionados era diversos e pode ser dividida em várias classes distintas (Figura 2). Figura 3A -F mostr...

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Discussão

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Este protocolo é projetado para ajudar os pesquisadores a conseguir uma tela frente química genética em Arabidopsis. Nós fornecemos resultados representativos de uma tela de 50.000 compostos (Figura 2 e Figura 3), uma das maiores telas frente química genética realizada em Arabidopsis até à data de13,9,23. O uso de um robô de manipulação líquido habilitado mais eficiente...

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Divulgações

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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

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Agradecemos a cegonha Jozsef, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue e Andrea Sanchez para discussão crítica e construtiva. Dr. Sharyn Perry para as fotografias fenotípicas. Este material é baseado em trabalho, apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob cooperativa acordo n. º 1355438.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Teclado Provedor LocalN/AUsado para design de protocolo e operação do Biomek
FX MouseLocal ProviderN/AUsado para design de protocolo e operação da tela de computador Biomek FX
Provedor LocalN/AUsado para design de protocolo e operação do Biomek FX
ComputerLocal ProviderN/AUsado para design e operação de protocolo o Biomek FX
DIVERSet Biblioteca de triagem diversificadaChemBridgeN/ABiblioteca química
Software BiomekBeckman CoulterN/AExecuta e projeta o controlador de dispositivo Biomek FX
Beckman Coulter719366Opera a bomba d'água/estação de lavagem de ponteiras
Empilhador Carrossel pendenteBeckman Coulter148240Operação manual do Biomek Empilhador Carrossel
Biomek Empilhador CarrosselBeckman Coulter148520Unidade rotativa que abriga todos os FX Stacker 10's
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Unidade de elevador que abriga componentes para tela
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Unidade de elevador que abriga componentes para tela
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Unidade de elevador que abriga componentes para tela
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Unidade de elevador que abriga componentes para tela
Biomek FXBeckman Coulterhttps://www.beckman.com/liquid-handlersRobô que executa as operações desejadas
AccuframeArtisan Technology Group76853-4Armação para colocar componentes corretamente
Dispositivo de enquadramentoBeckman Coulter719415Centers braço no Accuframe
Multichannel Tip Wash ALPBeckman Coulter719662Lava as pontas após o banho de etanol
Carregador de Pontas ALPBeckman Coulter719356Carrega pneumaticamente as pontas no braço
Compressor de arFornecedor localN/AFornece ar para carregamento pneumático de pontas
MasterFlex Console DriveBomba Cole-Parmer77200-65usada para circular água através da mangueira de ar do lavador de pontas multicanal
Provedor localN/AFornece ar do compressor de ar para a mangueira de água do carregador de pontas
ProvedorlocalN/AFornece água de 5 galões de reserva para o lavador de pontas
Static ALP'sBeckman Coultervem com Biomek FXSuporta equipamento para a tela
5 Galões de ReservaLocal Provedor N/ARecircula a água suja da limpeza das pontas
GarrasBeckman CoulterVem com Biomek FXGrabs e move o equipamento para os lugares corretos
96-Canais 200 µ L HeadBeckman CoulterVem com Biomek FXContém as 96 pontas usadas dentro da tela
AP96 P200 Pontas de PipetaBeckman Coulter717251Usado para fazer a biblioteca de peneiramento
96 Placa de Fundo Plano de 96 PoçosCostar9018Auxilia na visulização da tela
Placa de Fundo em V de 96 PoçosCostar3897Auxilia no armazenamento da biblioteca de diluição
AlumaSeal 96 Filme de vedaçãoMedSciF-96-100Selos para armazenamento tanto na biblioteca de química quanto na biblioteca de diluição
Sacos plásticos de sanduíche ziplockFornecedor localN/AUsado para garantir um ambiente úmido para a tela
AP96 P20 Pontas de pipetaBeckman Coulter717254Usado na criação da biblioteca de diluição
Câmara de CrescimentoPercivalAR36L3Germina sementes para fenotípicas
EspátulaProvedor LocalN/AContém sementes para adicionar em poços onde a semeadura líquida falhou adequadamente
Palito de denteProvedor LocalN/AEmpurra sementes da espátula para os poços
Murashige e Skoog Mistura de Sal BasalPhytoTechnology LaboratoriesM524Adicionar à mistura de mídia MS
MES Free Acid MonohydrateFisher ScientificICN19483580Adicionado ao meio MS para diminuir o pH
Ágar PóAlfa Aesar9002-18-0Aumenta a espessura do meio para suportar a suspensão de sementes
5M KOHSigma-Aldrich484016Aumenta o pH para níveis adequados
Garrafa de armazenamento de mídia1L Corning1395-1LContém mídia suficiente para uma tela
Tubos de centrífuga de polipropilenoCorning431470Esteriliza as sementes antes da vernilização
Sonda de pHDavis InstrumentsYX-58825-26Usado para fazer mídia
ALPs (Automated Labware Positioners) Manual do UsuárioBeckman CoulterPN 987836Auxilia na configuração do equipamento de acompanhamento para o Biomek FX
Guia do usuário do carrossel de empilhamento Biomek 2000Beckman Coulter609862-AAAuxilia na configuração do carrossel
de empilhadorBiomek FX e FXP Manual do usuário das estações de trabalho de automação laboratorialBeckman CoulterPN 987834Usado para enquadrar o pod multicanal
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Guia de inicialização do clienteBeckman CoulterPN B32335ABUsado para auxiliar na configuração do Biomek FX
Manual do usuário do software BiomekBeckman CoulterPNUsado para configurar e entender o Software
de visulização 987835

Referências

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