Realizou-se uma tela de alta taxa de transferência de moléculas pequenas sintéticas sobre espécies a planta modelo Arabidopsis thaliana. Este protocolo, desenvolvido para um robô de manipulação de líquidos, aumenta a velocidade das telas de genética de química para a frente, acelerando a descoberta de novas moléculas pequenas, que afetam a fisiologia vegetal.
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Artigo de método
Otimizando o uso de um robô de manipulação líquidos para conduzir a uma alta taxa de transferência para a frente química genética tela de Arabidopsis thaliana
Neste artigo
Resumo
Resumo
Química genética é cada vez mais sendo empregada para decodificar traços nas plantas que podem ser recalcitrantes à genética tradicional devido à redundância de gene ou letalidade. No entanto, a probabilidade de uma pequena molécula sintética, sendo bioativos é baixa; Portanto, milhares de moléculas devem ser testados a fim de encontrar aqueles de interesse. Robótica, sistemas são projetados para lidar com um grande número de amostras, aumentando a velocidade com que uma biblioteca de química pode ser rastreada além de minimizar/padronização erro de manuseio de líquidos. Para obter uma tela de alta produtividade para a frente química genética de uma biblioteca de 50.000 moléculas pequenas em Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocolos usando um líquido de multicanal de bancada manipulação robô foram desenvolvidos que exigem mínima envolvimento de técnico. Com estes protocolos, 3.271 pequenas moléculas foram descobertas que causou alterações fenotípicas visíveis. 1.563 compostos induziram raízes curtas, coloração 1.148 compostos alterados, 383 compostos causados raiz do cabelo e outras, não-Categorizado, alterações e germinação de 177 compostos inibidas.
Introdução
Nos últimos 20 anos pesquisadores no campo da biologia vegetal tem feito grandes progressos usando abordagens química genética, tanto para diante e reversos, melhorando nossa compreensão da biossíntese da parede celular, o citoesqueleto, a biossíntese do hormônio e sinalização, geotropismo, patogênese, biossíntese de purinas e endomembranoso tráfico1,2,3,4,5. Empregando técnicas de genética para a frente de química permite a identificação de fenótipos de interesse e permite que os pesquisadores a entender o....
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Protocolo
1. criação de uma biblioteca de diluição
- Rotule 625 placas de diluição biblioteca à mão, garantindo que eles correspondem à sua placa correspondente da biblioteca de química. Além disso, conectar-se no fluxo e mangueiras de fluxo para o multicanal dica lavagem automatizada Labware posicionador (ALP), passando-os através da unidade de Console para o reservatório de 5 galões (ver Tabela de materiais).
- Acessar o computador e ligue a bomba de lavagem através da conexão do controlador de dispositivo para o ALP lavagem dica multicanal para circular a água. Isto desliga-se automaticamente no final do protocolo.
- Carga, à mão, o e....
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Resultados
A capacidade de precisão e eficiência caracterizam fenótipos baseados a adição de pequenas moléculas em concentrações sob um microscópio dissecação de triagem é o objetivo final deste método de frente química genética em Arabidopsis. Os fenótipos observados quando todos os 50.000 compostos tinham sido selecionados era diversos e pode ser dividida em várias classes distintas (Figura 2). Figura 3A -F mostr.......
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Discussão
Este protocolo é projetado para ajudar os pesquisadores a conseguir uma tela frente química genética em Arabidopsis. Nós fornecemos resultados representativos de uma tela de 50.000 compostos (Figura 2 e Figura 3), uma das maiores telas frente química genética realizada em Arabidopsis até à data de13,9,23. O uso de um robô de manipulação líquido habilitado mais eficiente.......
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Agradecemos a cegonha Jozsef, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue e Andrea Sanchez para discussão crítica e construtiva. Dr. Sharyn Perry para as fotografias fenotípicas. Este material é baseado em trabalho, apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob cooperativa acordo n. º 1355438.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Teclado Provedor Local | N/A | Usado para design de protocolo e operação do Biomek | |
| FX Mouse | Local Provider | N/A | Usado para design de protocolo e operação da tela de computador Biomek FX |
| Provedor Local | N/A | Usado para design de protocolo e operação do Biomek FX | |
| Computer | Local Provider | N/A | Usado para design e operação de protocolo o Biomek FX |
| DIVERSet Biblioteca de triagem diversificada | ChemBridge | N/A | Biblioteca química |
| Software Biomek | Beckman Coulter | N/A | Executa e projeta o controlador de dispositivo Biomek FX |
| Beckman Coulter | 719366 | Opera a bomba d'água/estação de lavagem de ponteiras | |
| Empilhador Carrossel pendente | Beckman Coulter | 148240 | Operação manual do Biomek Empilhador Carrossel |
| Biomek Empilhador Carrossel | Beckman Coulter | 148520 | Unidade rotativa que abriga todos os FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Unidade de elevador que abriga componentes para tela |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Unidade de elevador que abriga componentes para tela |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Unidade de elevador que abriga componentes para tela |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Unidade de elevador que abriga componentes para tela |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robô que executa as operações desejadas |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Armação para colocar componentes corretamente |
| Dispositivo de enquadramento | Beckman Coulter | 719415 | Centers braço no Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Lava as pontas após o banho de etanol |
| Carregador de Pontas ALP | Beckman Coulter | 719356 | Carrega pneumaticamente as pontas no braço |
| Compressor de ar | Fornecedor local | N/A | Fornece ar para carregamento pneumático de pontas |
| MasterFlex Console Drive | Bomba Cole-Parmer | 77200-65 | usada para circular água através da mangueira de ar do lavador de pontas multicanal |
| Provedor local | N/A | Fornece ar do compressor de ar para a mangueira de água do carregador de pontas | |
| Provedor | local | N/A | Fornece água de 5 galões de reserva para o lavador de pontas |
| Static ALP's | Beckman Coulter | vem com Biomek FX | Suporta equipamento para a tela |
| 5 Galões de Reserva | Local Provedor N | /A | Recircula a água suja da limpeza das pontas |
| Garras | Beckman Coulter | Vem com Biomek FX | Grabs e move o equipamento para os lugares corretos |
| 96-Canais 200 µ L Head | Beckman Coulter | Vem com Biomek FX | Contém as 96 pontas usadas dentro da tela |
| AP96 P200 Pontas de Pipeta | Beckman Coulter | 717251 | Usado para fazer a biblioteca de peneiramento |
| 96 Placa de Fundo Plano de 96 Poços | Costar | 9018 | Auxilia na visulização da tela |
| Placa de Fundo em V de 96 Poços | Costar | 3897 | Auxilia no armazenamento da biblioteca de diluição |
| AlumaSeal 96 Filme de vedação | MedSci | F-96-100 | Selos para armazenamento tanto na biblioteca de química quanto na biblioteca de diluição |
| Sacos plásticos de sanduíche ziplock | Fornecedor local | N/A | Usado para garantir um ambiente úmido para a tela |
| AP96 P20 Pontas de pipeta | Beckman Coulter | 717254 | Usado na criação da biblioteca de diluição |
| Câmara de Crescimento | Percival | AR36L3 | Germina sementes para fenotípicas |
| Espátula | Provedor Local | N/A | Contém sementes para adicionar em poços onde a semeadura líquida falhou adequadamente |
| Palito de dente | Provedor Local | N/A | Empurra sementes da espátula para os poços |
| Murashige e Skoog Mistura de Sal Basal | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Adicionar à mistura de mídia MS |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Adicionado ao meio MS para diminuir o pH |
| Ágar Pó | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Aumenta a espessura do meio para suportar a suspensão de sementes |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Aumenta o pH para níveis adequados |
| Garrafa de armazenamento de mídia | 1L Corning | 1395-1L | Contém mídia suficiente para uma tela |
| Tubos de centrífuga de polipropileno | Corning | 431470 | Esteriliza as sementes antes da vernilização |
| Sonda de pH | Davis Instruments | YX-58825-26 | Usado para fazer mídia |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Manual do Usuário | Beckman Coulter | PN 987836 | Auxilia na configuração do equipamento de acompanhamento para o Biomek FX |
| Guia do usuário do carrossel de empilhamento Biomek 2000 | Beckman Coulter | 609862-AA | Auxilia na configuração do carrossel |
| de empilhadorBiomek FX e FXP Manual do usuário das estações de trabalho de automação laboratorial | Beckman Coulter | PN 987834 | Usado para enquadrar o pod multicanal |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Guia de inicialização do cliente | Beckman Coulter | PN B32335AB | Usado para auxiliar na configuração do Biomek FX |
| Manual do usuário do software Biomek | Beckman Coulter | PN | Usado para configurar e entender o Software |
Referências
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- Mc....
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Reimpressões e permissões
