Um guia passo a passo para sondar a perda da acidez dos lisossomos no intestino de c. elegans usando o corante vital sensíveis ao pH 6 - carboxi - 2', 7'-diclorofluoresceína diacetato (cDCFDA)
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Artigo de método
Avaliação dos lisossomos Alkalinization no intestino de viver elegans de Caenorhabditis
Neste artigo
Resumo
Resumo
O nemátodo Caenorhabditis elegans (c. elegans) é um sistema de modelo que é amplamente utilizado para estudar a longevidade e os caminhos do desenvolvimento. Tais estudos são facilitados pela transparência do animal, a capacidade de transmitir e reverter ensaios genéticos, a relativa facilidade de gerar proteínas fluorescente etiquetadas e o uso de corantes fluorescentes que podem também ser injetadas no início embrião ou incorporados em seu alimento (e. coli estirpe OP50) para rotular organelas celulares (por exemplo, 9-dietilamino-5h-benzo (a) phenoxazine-5-1 e (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Aqui, apresentamos o uso de um corante fluorescente de sensíveis ao pH que manchas lisossomos intestinais, fornecendo uma leitura visual de alterações fisiológicas, dinâmicas na acidez dos lisossomos em worms ao vivo. Este protocolo não mede pH dos lisossomos, mas prefiro visa estabelecer um método confiável de avaliação fisiológicas relevantes variações na acidez dos lisossomos. cDCFDA é um célula-permeant composto que é convertido para o fluorescente fluoróforo 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) após hidrólise por esterases intracelulares. Protonação dentro de lisossomos armadilhas cDCF nestas organelas, onde se acumula. Devido a sua baixa pKa de 4.8, esse corante tem sido usado como um sensor de pH no fermento. Aqui nós descrevemos o uso de cDCFDA como suplemento alimentar para avaliar a acidez dos lisossomos intestinais em c. elegans. Esta técnica permite a detecção de lisossomos alcalinizante em animais vivos,, e tem uma ampla gama de aplicações experimentais, incluindo estudos sobre envelhecimento, autofagia e biogênese dos lisossomos.
Introdução
A aparência de agregados de proteínas é amplamente aceito para ser uma marca registrada de envelhecimento em pilhas eukaryotic1,2,3e a formação do que é pensado para estar entre os condutores de princípio da senescência celular4 , 5 , 6 , 7. há evidência crescente que, como células de idade catabolismo proteico é prejudicado, levando a um aumento na agregação da proteína. O colapso da proteólise em células de envelhecimento envolve uma imparidade de....
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Protocolo
1. mancha e lisossomos intestinais de imagem
- Placas de mídia de crescimento nematoide de semente (NGM) OP50
- Preparar pratos NGM conforme o protocolo recomendado19 e permitir que as placas fechadas secar por 2 dias à temperatura ambiente.
- Inocular as bactérias OP50 no caldo estéril de caldo Luria (LB) e crescer em um tremendo banho de incubadora ou água a 37 ° C por 36 h ou até que o OD está entre 0,2 e 0,4. Evitar o uso de uma cultura bacteriana com OD > 1 ou OD < 0.2.
- Uma vez que NGM placas são secas, coloque uma gota (~ 30 µ l) de inóculo OP50 no centro da placa e espalhe então a qued....
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Resultados
cDCFDA manchas de lisossomos em uma maneira dependente do pH, e seu pKa baixo e captação pronta em lisossomos torna um sensor de pH ideal21. cDCFDA intensidade de coloração é inversamente proporcional dos lisossomos pH (ou seja, coloração aumentos de intensidade como pH diminui)18,22. os sinais cDCFDA são consistentemente fracos lisossomos de animais tratados com 20mm de cloroquina, um inibidor da .......
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Discussão
Uma variedade de eventos celulares e moleculares contribuem para o envelhecimento, influenciado pela história de vida características e fatores genéticos. Nosso recente estudo22 sugere que o ciclo reprodutivo desempenha um papel importante no controle da aptidão da soma através da regulamentação da dinâmica dos lisossomos pH. Nós mostramos que a proteólise lisossomal mediada é promovido enquanto animais reproduzem-se ativamente por upregulation de transcrição v-ATPase, que por sua vez, garante lis.......
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Divulgações
Os autores declaram não haverá conflito de interesses.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer o centro de genética Caenorhabditis para tensões, as ciências naturais e Conselho de pesquisa de engenharia (NSERC) e a Fundação do Canadá para a inovação (TPI) para financiamento. Gostaríamos de agradecer o Dr. Lizhen Chen (departamento de sistemas de célula e anatomia, UT saúde San Antonio) por permitir o uso irrestrito de seus laboratórios para todos os experimentos de c. elegans , bem como Dr. Exing Wang (diretor associado, Optical Imaging Facility UT saúde San Antonio) para obter assistência com microscopia confocal. Também gostaríamos de agradecer o Dr. Myron Ignatius para fornecer apoio e incentivo para facilitar a gra....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| OP50 (E. coli) | Centro de | Encomende online em https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| diacetato de 5(6)-carboxi-2',7'-diclorofluoresceína | ThermoFisher | C369 | Comumente conhecido como cDCFDA |
| 9-dietilamino-5H-benzo(a)fenoxazina-5-ona e (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipirrol-5-il-kappaN(1))metilideno]-2H-pirrol-5-il-kappaN}-N-[2-(dimetilamino)etil]propanamidato)(difluoro)boro | ThermoFisher | L7528 | Comumente conhecido como Lysotracker Microscópio |
| confocal vermelho (por exemplo, Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Baixe gratuitamente a partir de https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Caldo em pó | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher | Scientific S71604 | |
| Colesterol em pó | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Azida de Sódio | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Lâminas de Microscópio | VWR | 48311-703 | |
| Lamínulas | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubadora | |||
| Espelho ou outra superfície |
Referências
- Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
- Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
- Rubinsztein, D. C.
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Reimpressões e permissões
