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Artigo de método

Montagem e purificação do protótipo vírus espumoso Intasomes

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DOI:

10.3791/57453

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19 de março de 2018

 ,  , 
1Department of Cancer Biology and Genetics, The Ohio State University College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Integrase retroviral recombinante e oligómeros de DNA imitando extremidades de DNA virais podem formar um complexo enzimaticamente ativo conhecido como um intasome. Intasomes pode ser utilizado para estudos bioquímicos, estruturais e cinéticos. Este protocolo fornece detalhes sobre como montar e purificar o protótipo vírus espumoso intasomes.

Resumo

A definição de recurso e etapa necessária do ciclo de vida do retrovírus é a integração do genoma viral no genoma do hospedeiro. Todos os retrovírus codificam uma enzima integrase (IN) que cataliza a União covalente de viral para host de DNA, que é conhecido como transferência de vertente. Integração pode ser modelado em vitro com IN retroviral recombinante e oligómeros de DNA imitando as extremidades do genoma viral. Para recapitular mais de perto a reação de integração que ocorre na vivo, integração complexos são montados de recombinação IN e oligômeros sintéticos por diálise em um buffer de reduzida concentração de sal. A integração complexa, chamada um intasome, pode ser purificada por cromatografia de exclusão. No caso do vírus espumoso de protótipo (PFV), o intasome é um tetrâmero de IN e dois oligómeros de DNA e prontamente é separado do IN monomérico e livre oligómero de DNA. A eficiência de integração de intasomes PFV pode ser analisada sob uma variedade de condições experimentais para melhor compreender a dinâmica e mecânica de integração retroviral.

Introdução

Integração do genoma viral no genoma do hospedeiro é um passo obrigatório no ciclo de vida de todos os retrovírus1. A enzima viral integrase (IN) catalisa a União covalente de cada extremidade do genoma de DNA viral para o host de DNA. Durante uma infecção celular, faz parte de um complexo de pré-integração que medeia a integração. Recombinante em complexado com oligômeros de DNA encalhados dobro imitando as extremidades de DNA virais também pode realizar a integração em um DNA alvo em vitro2. Um comum integração ensaio em vitro utiliza um plasmídeo supercoiled como o DNA alvo. Integração de ambos os oligómeros de DNA virais (vDNA) para o plasmídeo resulta em um produto linear e é denominada integração concertada (Figura 2A). A integração do ensaio em vitro pode também produzir produtos com apenas um vDNA covalentemente unida com o plasmídeo de alvo, resultando em um círculo relaxado. Este produto de integração de meia-site parece ser um artefato de ensaio in vitro.

Recombinante em e vDNA podem realizar integração em vitro, mas eles não são reagentes ideais para o estudo da dinâmica ou estrutura de complexos de integração quando monomérico IN poderia obscurecer visualização relevante. Purificado de integração complexos, ou "intasomes", são necessários estudos estruturais ou análise de dinâmica única molécula. PFV IN e vDNAs pode ser montado por diálise de um buffer de relativamente alta concentração de sal para uma baixa concentração de sal,3,4. Durante a diálise, um precipitate formulários. Esse precipitado é removido da diálise e a concentração de sal é aumentada. A maior concentração de sal solubiliza o precipitado contendo PFV intasomes. Os intasomes são então purificados por cromatografia de exclusão (SEC). IN de vírus espumoso (PFV) recombinante protótipo foi mostrado para existe como um monômero em solução em concentrações até 225 µM5. Fracionamento de SEC efetivamente separa o intasomes PFV (225.5 kDa), que inclui um tetrâmero de PFV IN e dois vDNAs, PFV monomérico em (44,4 kDa) e enciclopédia vDNA (24,0 kDa). O intasomes PFV pode ser congelado e manter a atividade de integração pelo menos seis meses de armazenamento a-80 ˚ c.

Recombinante PFV intasomes também pode ser modificado para incluir em substituições de aminoácidos ou mutações de truncamento ou vDNAs rotulado com fluorophores ou biotina4,6. Os purificado PFV intasomes executar prontamente integração em um alvo de plasmídeo supercoiled DNA em vitro. Ensaios de integração bioquímicos em massa com intasomes podem testar os efeitos de mutações, inibidores, ou outros aditivos químicos. Biotinilado intasomes pode ser usado para sondar a afinidade com os ácidos nucleicos e proteínas. PFV intasomes são funcionais à temperatura ambiente, permitindo a análise de microscopia única molécula por uma pinça magnética para medir o tempo entre juntar-se das duas extremidades vDNA ou fluorescência de reflexão interna total para visualizar a pesquisa de intasome no alvo DNA6. Além disso, PFV intasomes foram os primeiros a ser estruturalmente caracterizam afetar significativamente o campo de integração retroviral3.

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Protocolo

1. recozimento de vDNA

  1. Combinar 1 X 10 Buffer (estoque de 10 X 10: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, EDTA 10 mM), 10 µM 1 Oligo (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 µM de estoque) e 10 µM 2 Oligo (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 µM de estoque) em um volume final de 1,5 mL . Alíquota de 25 µ l para tubos de reação em cadeia (PCR) de 0,2 mL do polymerase sessenta.
    Nota: Dependendo da aplicação, oligómeros podem ser modificados com fluorophores ou tags 5'-na extremidade do Oligo 2 ou como um interno amino-T na base 13 de 5' extremidade do Oligo 1. Oligómeros modificados devem ser purificados por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) antes do recozimento. Nós achamos que 5'-final Cy3 ou Cy5 fluoróforo rotulagem de Oligo 2 reduz a eficiência de montagem de intasome 10-fold. Fluoróforo interno rotulagem não reduz eficiência de montagem.
  2. Recoze usando um thermocycler com os seguintes tempos e temperaturas: 1 ciclo ˚ c 94.0 3 min, 99 ciclos no (˚ c 94.0 1min, 93,6 ˚ c 1min) diminuindo ambas temperaturas 0,8 ˚ c por ciclo (o último ciclo é 14,8 ˚ c 1 min, 14.4 ˚ c 1 min) e armazenar no 4.0 ˚ c.
  3. Combine as recozimento reações de todos os tubos de sessenta. Carrega 500 µ l para dois 0,5 mL 3 kDa peso molecular corte (MWCO) filtro ultracentrifugal concentração unidades. Concentre o recozido vDNA por centrifugação em microcentrifuga a 14.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT).
    Nota: O volume de retentate deve ser ~ 50 µ l em cada unidade de concentração.
  4. Descarte a fluir. Adicione 250 µ l do restante vDNA recozido para cada unidade de filtro. Repetir a centrifugação e descartar o fluxo através de. Tampão de troca em tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) por lavar três vezes com 450 µ l TE.
  5. Inverter a unidade de filtro e girar a 1.000 x g por 2 min em RT O volume final retentate para cada unidade de filtro deve ser ~ 50 µ l. Combine o retentates e transferir para um tubo de tampa de rosca de 1,5 mL.
  6. Medir a absorvância de 260 nm ultravioleta (UV) do vDNA. Use este valor para calcular a concentração molar final do DNA. O coeficiente de extinção (ε260) deste vDNA é 622.803 cm-1 M-1 e seu peso molecular é 23.972 promotor. loja-20 ˚ c.

2. Intasome Assembleia

  1. Se possível, realizar a montagem de intasome em um quarto pequeno com um termostato variável. Ajuste o termostato para aproximadamente 18-22 ˚ c.
    Nota: Na nossa experiência, montagem de intasome no 4 ˚ c é ineficiente.
  2. Prepare 1 L de tampão de diálise (Bis-tris propano de 20 mM, pH 7,5, 200 mM NaCl, 2mm ditiotreitol (DTT), 25 µM ZnCl2) num copo de 2 L com uma barra de agitação em uma placa de agitação. Equilibrar o buffer na sala 18-22 ˚ c, durante pelo menos 6 h.
  3. Para montar o intasomes, combine propano 50 mM tris-Bis, pH 7,5, 500 mM de NaCl, PFV IN de 120 µM e 50 µM vDNA em um volume total de 150 µ l.
    Nota: IN PFV deve ser livre de contaminantes nuclease atividade7,8. Se a concentração de IN PFV é demasiado diluída para acomodar 120 µM em, em volume de 150 µ l, em seguida, é possível aumentar o volume final de 200 µ l. Os fatores críticos desta etapa são para manter a proporção molar da IN para vDNA (2.4:1) e ter bastante complexo para visualizar durante a cromatografia.
  4. Limpe um longo pedaço de ~ 10 cm de tubo de diálise 10mm 6-8 kDa MWCO e clipes com água bidestilada (ddH2O), ou a água de pureza mais alta disponível. Prenda uma extremidade do tubo.
    Nota: A tubulação da diálise deve ser manipulada com cuidado para evitar qualquer possível contaminação do espaço de laboratório.
  5. Fazer 15 mL de tampão de lavagem de tubos de diálise (propano 50 mM tris-Bis, pH 7,5, 500 mM de NaCl). Lave o interior do tubo de diálise três vezes com 1-2 mL de tampão de lavagem. Retire o máximo de buffer de enxaguamento quanto possível, com uma pipeta e gel fino de ponta de carga.
  6. Se necessário, utilize uma lâmina de barbear limpa ou bisturi para cortar o tubo de diálise para que uma ponta fina gel de carregamento pode chegar ao fim do tubo.
  7. Transferi o assembly intasome da etapa 2.3 para a tubulação da diálise com uma pipeta e um gel fino ponta de carregamento. Corte a extremidade aberta do tubo de diálise, minimizando a quantidade de ar introduzido dentro do tubo. Coloque o tubo no buffer de diálise.
  8. Urinar durante a noite (16-20 h) com agitação suave para que o tubo gira, mas não é em um vórtice. Verifique se a tubulação da diálise está submerso e móvel. Depois de aproximadamente uma hora, observe um precipitado visível dentro da tubulação.
    Nota: Com Cy3 ou Cy5 fluorescente etiquetado vDNA, o precipitado é mais óbvio. Isto é verdadeiro para end rotulado e vDNA fluorescente etiquetado internamente.

3. Intasome solubilização

  1. Prepare dois furo largo pontas de pipetas, removendo 2-4 mm da extremidade de uma ponta de 200 µ l, com uma nova lâmina de barbear ou bisturi sobre uma superfície limpa.
    Nota: As dicas serão usadas na etapa 3.3 e 3.5.
  2. Remova o tubo de diálise o buffer de diálise. Para evitar a diluição da amostra intasome com buffer de diálise que pode permanecer na extremidade do tubo de perto o clip, use uma micropipeta com uma ponta de pipeta pequena para remover qualquer reserva de diálise em excesso. Retire o clipe de uma das extremidades do tubo de diálise.
  3. Uso uma ampla ponta da pipeta do furo do passo 3.1 para transferir a amostra, incluindo o precipitado dentro da tubulação da diálise para um tubo de 1,5 mL no gelo. Anotar o volume total do material recuperado; o volume total é tipicamente ~ 140 µ l.
  4. A amostra com o precipitado é a 200 mM NaCl; Aumente o sal para uma concentração final de 320 mM NaCl adicionando o volume apropriado de uma solução de NaCl 5 M. Por exemplo, para uma amostra de 150 µ l, adicionar 3.9 µ l 5 M NaCl e 1.1 µ l ddH2O para um volume final de 155 µ l. transferência balde de gelo com amostra em uma sala fria 4 ˚ c.
  5. Uso uma ampla furo ponta da pipeta de passo 3.1 para Ressuspender e solubilizar o precipitado por pipetagem. Repeti a cada 20 min pelo menos 1 h. observar que a maioria do precipitado deve entrar em solução.
    Nota: Pipetagem para Ressuspender o precipitado pode ser interrompido quando é evidente que o precipitado é não está mais visivelmente reduzido entre pontos de tempo. Quando vDNA não é rotulado ou internamente é rotulado, o precipitado é reduzido em 90% com base na inspeção visual. No caso de fim de Cy5 rotulado vDNA, o precipitado é reduzido em apenas ~ 20%; a maioria do precipitado com fim de fluoróforo rotulado vDNA não vai solubilizar. A quantidade de precipitado que efetivamente é solubilizado é variável e deve ser determinada empiricamente.

4. Intasome purificação

  1. Prepare 250 mL de cromatografia de exclusão (SEC) executando o tampão (propano 20 mM tris-Bis, pH 7,5, 320 mM NaCl, 10% de glicerol). Filtro estéril o buffer com um 0,2 µm-unidade de filtragem e armazene a 4 ˚ c.
    Nota: Todas as etapas de purificação são realizadas em uma sala fria 4 ˚ c.
  2. Equilibrar uma coluna de agarose reticulado SEC (diâmetro = 10 mm; comprimento = 300 mm; cama volume = 24 mL; volume de amostra = 25-500 µ l; pressão máxima = 1,5 MPa; limite de exclusão = 4 x 107 Da; separa os pesos moleculares entre 5.000 e 5 kDa, consulte o de esteira erials) com SEC executando em uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min.
    Nota: Esta purificação pode ser adaptada para colunas de exclusão de tamanho diferente se eles são capazes de efetivamente separar 300 kDa 44 kDa, tais como Superose 12 10/300 GL ou Superose 6 aumentar. Superose 12 10/300 GL tem resolução menor, levando a mais sobreposição de picos. Por outro lado, Superose 6 aumentar tem maior resolução e oferece a melhor separação.
  3. Centrifugar a amostra de intasome em uma microcentrífuga a 14.000 x g durante 10 minutos a 4 ˚ c para qualquer precipitado restante de Pelotas. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Carrega o sobrenadante para um loop de injeção de 200 µ l (tubulação que pode conter ~ 200 μL). Aplique a amostra para a coluna do SEC.
    Nota: Volumes menores de carga permitem maior resolução por seg.
  4. Eluir com 25 mL SEC executando o buffer e coleta 95 frações de 270 µ l. Observe que o cromatograma SEC exibe três A280/A260 picos (Figura 1).
    Nota: O primeiro deve ser um agregado (~9.0 - eluição de 11,5 mL), seguido do pico de intasome PFV tetrâmero (~12.0 - eluição 14,75 mL) e monômero PFV IN com pico vDNA livre (~15.0 - 18,0 mL).

5. integração Strand ensaio de transferência, seleção de fração e armazenamento

  1. Combinar 2 µ l de cada fração de pico intasome e 50 ng 3KB supercoiled plasmídeo (concentração das ações é de 50 ng / µ l) em tampão de reação (10 mM tris Bis propano, pH 7,5, 110 mM de NaCl, 5 mM de MgSO4, 4 µM ZnCl2, 10 mM DTT) em um volume final de reação de 15 µ l. Incube a 37 ˚ c por 5 min.
  2. Inclua um controle negativo com nenhum intasome PFV adicionado. Parar a reação com 0,75 proteinase µ l K (20 mg/mL de solução) e 0,75 µ l SDS (solução a 10% das ações). Incube a 55 ˚ c para amostras de loja h. 1 conforme necessário em-20 ˚ c para posterior análise.
    Nota: Este ensaio é uma avaliação qualitativa da atividade de integração. A concentração molar de intasome de cada fração não é determinada antes neste ensaio. Incluído no ensaio de transferência da vertente de integração de fracções podem ser armazenadas no gelo (incluindo armazenamento durante a noite) até a integração atividade é confirmada e frações selecionadas são aliquotadas. Aqui usamos o pMP2, um derivado de pUC199. Usamos também com êxito a 5,4 kb do plasmídeo pcDNA 3.1. Qualquer plasmídeo que pode ser resolvido em relaxado círculo, linear, e formas supercoiled podem ser usadas como um destino para integração.
  3. Prepare um peso de 1% de 120 mL por gel de agarose de volume (p/v) em 1-tampão TAE X (40 mM Tris-Acetato, 1 mM EDTA) com 0,1 μg/mL ethidium brometo (EtBr, 10 mg/mL de solução)10. Derreter a solução de agarose e despeje em uma bandeja de fundição de gel 15 cm x 10 cm. Inserir um pente 15-bem com 5 mm largo, 0,75 mm espesso poços.
    Nota: Mais estreitos poços rendem melhor resolução de banda, em comparação com poços de espesso 1,5 mm.
  4. Permitir que o gel solidificar à temperatura ambiente. Imergir o gel em 1 X TAE com 0,1 μg/mL EtBr.
  5. Adicione 3 µ l 50% glicerol para cada reação de integração da etapa 5.2. Carrega o volume inteiro de reação para o gel. Carregar de 1 µ l de marcador de tamanho de DNA 10 kb (concentração das ações de 150 ng / µ l) para pistas de cada lado das amostras; em outras palavras, o marcador de tamanho de DNA deve flanquear as pistas de amostra.
  6. Em uma faixa exterior, carrega tintura de laranja G 6 µ l (0,25% G laranja, 30% de glicerol). Funcione o gel em constante tensão, 10 V/cm (100 V) à temperatura ambiente por 1 h, ou até a frente de corante laranja G chega ao fim do gel.
  7. O gel de agarose imediatamente da imagem com um scanner fluorescente definido para detectar EtBr (532 nm de excitação, filtro de emissão 610 nm). Se fluoróforo rotulado vDNAs foram usado, também da imagem com as configurações adequadas fluoróforo.
    Nota: por exemplo detectar Cy5 rotulado DNA, imagem usando 633 nm de excitação e filtros de emissão 670 nm. Produtos de integração concertada (CI, DNA linear) devem ser executado fiel tamanho em kb ~ 3, não tenha reagido supercoiled plasmídeo (SC) deve ser executado mais rápido (~ 2 kb) e produtos de integração meia-site (HSI, círculo relaxado DNA) devem executar mais lento (~3.5 kb). Não tenha reagido vDNA deve ser executado fiel tamanho em ~ 40 bp.
  8. Quantificar as bandas em cada raia com software de imagem7. Calcular a fração de DNA em cada pista que é CI, HSI ou SC; vDNA não está incluído no cálculo.
    Nota: Eficiência de integração, ou a fração de SC, convertido em um produto linear, foi calculada dividindo o volume de pixel de produtos de integração concertada (CI) pelo volume total de pixel de três bandas (HSI + CI + SC). Se intasomes são fluoróforo rotulado, os HSI e CI produtos também podem ser quantificados por fluorescência.
  9. Selecione frações que têm a atividade de integração mais concertada.
    Nota: Na nossa experiência, a atividade de integração concertada de pico coincide com o pico de proteína identificado como tetramérica PFV intasomes. Medir a um280 de cada uma dessas fracções e calcular a concentração final de intasome. O ε280 para um tetrâmero de tipo selvagem PFV IN com dois vDNAs descrito aqui é 908.339 cm-1M-1 e o peso molecular é 225.5 kDa. As concentrações devem seguir o mesmo padrão, como o pico do cromatograma SEC e no ensaio de transferência de fio.
  10. Distribuir a cada fração em 5 alíquotas µ l e snap freeze em nitrogênio líquido. Loja alíquotas no-80 ˚ c. Selecionado para o armazenamento de frações são tipicamente entre 200-600 nM.

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Resultados

PFV intasomes são montados de recombinação IN e vDNA. Após a montagem, intasomes são purificados pela SEC (Figura 1). Atividade de integração de cada fração é analisada com um supercoiled DNA alvo e agarose electroforese do gel (Figura 2). Este gel é fotografado com um scanner fluorescente definido para detectar EtBr (e fluoróforo, se rotulado de fluoróforo vDNA é usado). Volumes de pixel de banda usando o software de análise de ...

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Discussão

Retroviral INs formam uma complexo com DNA genômico viral para realizar a integração e continuar o ciclo de vida viral de multiméricas. O número de em monômeros por intasome pode ser tetrâmeros, octamers ou possivelmente maior ordem oriundas de11,12,13,14. PFV intasomes são um tetrâmero de recombinante com oligômeros de DNA dupla-hélice que imitam o DNA genômico viral termina3...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo NIH AI099854 e AI126742 a chave.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Oligômeros de DNAIDTN / AOligos de DNA personalizados
Tris Ultra PureGojira Fine ChemicalsUTS1003
NaClP212121RP-S23020
UltraPure EDTAInvitrogen / Gibco15575
Amicon Ultra 0,5 mL filtros centrífugosSigma-AldrichZ677094-24EA3 kDa MWCO
DTTP212121SV-DTT
BIS-TRIS propano,>=99.0% (titulação)Sigma-AldrichB6755-500G
ZnCl2Sigma-Aldrich208086
MgSO4Amresco0662
GlicerolThermo Fisher ScientificG37-20
Pontas de carregamento de gel, 1 - 200 μ LCorningCLS4853-400EA
Lâmina de barbear; De um gume; 100/Pk.; Pacote de 100 Unidades deFisher Scientific12-640
com Membrana PES > 250mLThermo Fisher Scientific568-0020
Clipes de tubulação de diáliseSpectrum Labs132734
6-8 kDa 10 mm SpectrumMedical132645
Superose 6 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences17517201
Hi-Res Standard AgaroseAGTC BioproductsAG500D1
Brometo de EtídioThermo Fisher ScientificBP1302
Laranja GFisher Scientific0-267
Hyladder 10kb, 500 pistasDenville ScientificCB4225-4
Filtro Descartáveis Estéreis

Referências

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