Integrase retroviral recombinante e oligómeros de DNA imitando extremidades de DNA virais podem formar um complexo enzimaticamente ativo conhecido como um intasome. Intasomes pode ser utilizado para estudos bioquímicos, estruturais e cinéticos. Este protocolo fornece detalhes sobre como montar e purificar o protótipo vírus espumoso intasomes.
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Artigo de método
Montagem e purificação do protótipo vírus espumoso Intasomes
Neste artigo
Resumo
Resumo
A definição de recurso e etapa necessária do ciclo de vida do retrovírus é a integração do genoma viral no genoma do hospedeiro. Todos os retrovírus codificam uma enzima integrase (IN) que cataliza a União covalente de viral para host de DNA, que é conhecido como transferência de vertente. Integração pode ser modelado em vitro com IN retroviral recombinante e oligómeros de DNA imitando as extremidades do genoma viral. Para recapitular mais de perto a reação de integração que ocorre na vivo, integração complexos são montados de recombinação IN e oligômeros sintéticos por diálise em um buffer de reduzida concentração de sal. A integração complexa, chamada um intasome, pode ser purificada por cromatografia de exclusão. No caso do vírus espumoso de protótipo (PFV), o intasome é um tetrâmero de IN e dois oligómeros de DNA e prontamente é separado do IN monomérico e livre oligómero de DNA. A eficiência de integração de intasomes PFV pode ser analisada sob uma variedade de condições experimentais para melhor compreender a dinâmica e mecânica de integração retroviral.
Introdução
Integração do genoma viral no genoma do hospedeiro é um passo obrigatório no ciclo de vida de todos os retrovírus1. A enzima viral integrase (IN) catalisa a União covalente de cada extremidade do genoma de DNA viral para o host de DNA. Durante uma infecção celular, faz parte de um complexo de pré-integração que medeia a integração. Recombinante em complexado com oligômeros de DNA encalhados dobro imitando as extremidades de DNA virais também pode realizar a integração em um DNA alvo em vitro2. Um comum integração ensaio em vitro utiliza um plasmídeo supercoiled como o DNA alvo. Integração de ambos os ol....
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Protocolo
1. recozimento de vDNA
- Combinar 1 X 10 Buffer (estoque de 10 X 10: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, EDTA 10 mM), 10 µM 1 Oligo (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 µM de estoque) e 10 µM 2 Oligo (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 µM de estoque) em um volume final de 1,5 mL . Alíquota de 25 µ l para tubos de reação em cadeia (PCR) de 0,2 mL do polymerase sessenta.
Nota: Dependendo da aplicação, oligómeros podem ser modificados com fluorophores ou tags 5'-na extremidade do Oligo 2 ou como um interno amino-T na base 13 de 5' extremidade do Oligo 1. Oligómeros modificados devem ser purificados por cromatografia líquida de alt....
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Resultados
PFV intasomes são montados de recombinação IN e vDNA. Após a montagem, intasomes são purificados pela SEC (Figura 1). Atividade de integração de cada fração é analisada com um supercoiled DNA alvo e agarose electroforese do gel (Figura 2). Este gel é fotografado com um scanner fluorescente definido para detectar EtBr (e fluoróforo, se rotulado de fluoróforo vDNA é usado). Volumes de pixel de banda usando o software de análise de .......
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Discussão
Retroviral INs formam uma complexo com DNA genômico viral para realizar a integração e continuar o ciclo de vida viral de multiméricas. O número de em monômeros por intasome pode ser tetrâmeros, octamers ou possivelmente maior ordem oriundas de11,12,13,14. PFV intasomes são um tetrâmero de recombinante com oligômeros de DNA dupla-hélice que imitam o DNA genômico viral termina3.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH AI099854 e AI126742 a chave.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Oligômeros de DNA | IDT | N / A | Oligos de DNA personalizados |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen / Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0,5 mL filtros centrífugos | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propano,>=99.0% (titulação) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glicerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Pontas de carregamento de gel, 1 - 200 μ L | Corning | CLS4853-400EA | |
| Lâmina de barbear; De um gume; 100/Pk.; Pacote de 100 Unidades de | Fisher Scientific | 12-640 | |
| com Membrana PES > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Clipes de tubulação de diálise | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Spectrum | Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Brometo de Etídio | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Laranja G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 pistas | Denville Scientific | CB4225-4 |
Referências
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, ....
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Reimpressões e permissões
