Artigo de método

Sequenciação de MicroRNA retrospectiva: Biblioteca de DNA complementar preparação protocolo usando amostras de RNA de parafina fixada em formol

DOI:

10.3791/57471

⸱

5 de maio de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Research, Hackensack University Medical Center, 2Department of Medical Sciences, Seton Hall University, 3Department of Epidemiology and Population Health, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Nephrology and Hypertension, Hadassah - Hebrew University Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Fixada em formol parafina espécimes representam uma fonte valiosa de biomarcadores moleculares de doenças humanas. Aqui nós apresentamos um protocolo de preparação de biblioteca de base laboratorial do cDNA, inicialmente projetado com RNA congelado fresco e otimizado para a análise de microRNAs arquivados de tecidos armazenados até 35 anos.

Resumo

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-Arquivada, clinicamente classificados fixada em formol parafina os tecidos (FFPE) podem fornecer ácidos nucleicos para retrospectivos estudos moleculares de desenvolvimento de câncer. Por meio de lesões pré-malignas ou não-invasiva de pacientes que mais tarde desenvolvem doença invasiva, análises de expressão de gene podem ajudar a identificar cedo alterações moleculares que predispõem ao risco de câncer. Tem sido bem descrito que ácidos nucleicos recuperados de tecidos FFPE sofreram graves danos físicos e modificações químicas, que dificultam a sua análise e geralmente requer ensaios adaptados. MicroRNAs (miRNAs), no entanto, que representam uma pequena classe de moléculas de RNA, abrangendo apenas até ~ 18-24 nucleotídeos, foram mostrados para suportar o armazenamento a longo prazo e foram analisadas com sucesso em amostras FFPE. Aqui apresentamos um 3' código de barras complementares DNA (cDNA) biblioteca preparação protocolo otimizado especificamente para a análise de pequenos RNAs extraído de tecidos arquivados, que recentemente foi demonstrada para ser robusto e altamente reprodutível quando usando arquivados amostras clínicas armazenadas por até 35 anos. Esta preparação da biblioteca está bem adaptada à análise do material comprometido/degradado onde amostras do RNA (até 18) são ligadas com adaptadores de código de barras individual 3' e depois agrupadas para preparações enzimáticas e bioquímicas subsequentes multiplex antes da análise. Todas purificações são executadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), que permite seleções de tamanho específico e avanços de código de barras pequenas espécies de RNA. Esta preparação de biblioteca de cDNA é bem adaptada ao minutos entradas de RNA, como um piloto cadeia da polimerase (PCR) permite a determinação de um ciclo de amplificação específica produzir quantidades ideais de material para o sequenciamento de próxima geração (NGS). Esta abordagem foi otimizada para o uso do RNA de FFPE degradadas das amostras arquivadas por até 35 anos e fornece dados NGS altamente reprodutíveis.

Introdução

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os miRNAs são notavelmente bem conservados no fixada em formol parafina (FFPE) espécimes1,2,3. Trabalhos anteriores têm demonstrado que a expressão destas curtas reguladoras não-codificantes único encalhado RNA moléculas pode ser avaliada com êxito usando o RNA total das amostras FFPE e fornecer dados da expressão do gene relevante quando comparado com o original fresh tecidos4,5,6,7,8. Quando comparado aos RNAs Me....

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Protocolo

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1. preparação de todos os reagentes e Primers

  1. Ordenar todos os primers e adaptadores conforme descrito na Figura 1.
  2. Prepare o calibrador estoque cocktail, que vai ser cravado em cada Ligadura individual.
    1. Ressuspender do oligonucleotide transportadora (Figura 1) para 0,5 µM com água livre de RNase. Resuspenda os oligonucleotides de calibrador (Figura 1) 10 a 100 µM usando a 0,5 µM portador do oligonucleotide solução.
    2. Combine 10 µ l de cada um dos 10 calibradores numa microcentrifuga siliconizado para obter um estoque de co....

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Resultados

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Conforme descrito no método aqui, um total de 18 amostras de RNA FFPE individuais (100 ng cada) são criadas em tubos separados submeter-se a 3' adenylated código de barras do oligonucleotide T4 ligadura durante a noite. No dia seguinte, as reações enzimáticas são calor-desativado, combinadas e precipitadas em um único tubo. A pelota do RNA é resuspended e as moléculas de RNA ligadas são separadas em um 15% desnaturação gel de poliacrilamida (PAGE), onde marcadores de tamanho do oligonucle.......

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Discussão

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Um protocolo de preparação de biblioteca de cDNA altamente reprodutível e robusto para NGS de RNAs pequeno Arquivado em amostras de RNA FFPE é apresentado no presente protocolo, que é uma versão modificada e otimizada do procedimento descrito por Hafner et al . 22

Todas as etapas do presente protocolo foram otimizadas para uso com mais antigo arquivado e comprometido o RNA total recuperado de espécimes FFPE. A etapa chave do presente protocolo, para o processam.......

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Divulgações

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Os autores desejam divulgar que uma publicação que contém alguns dos dados apresentados neste manuscrito foi publicada no jornal internacional de Ciências moleculares por Loudig et al . 21.

Agradecimentos

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Agradecemos o Dr. Thomas Tuschl, chefe do laboratório de biologia molecular de RNA, bem como membros de seu laboratório por seu apoio e para compartilhar a tecnologia desenvolvida no seu laboratório e fornecendo acesso ao pipeline de RNAworld. Agradecemos também o Dr. Markus Hafner para o protocolo de compartilhamento e fornecendo descrições detalhadas sobre todos os passos bioquímicos e enzimáticos utilizados em seu procedimento inicial.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1% Triton x-100InvitrogenHFH10
10mM ATPAmbionAM8110G
10X dNTPsAmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14M MercaptoetanolSigmaO3445I-100
20 nt escadaJena BioscienceM-232S
20mg/ml Albumina de soro bovinoSigmaB8894-5ML
50X Titanium TaqClontech Laboratories639208
Persulfato de amônioFisher Scientific7727-54-0
BRL com placas de vidro e pentesGIBCOV16
Dimetil sulfóxido (DMSO)SigmaD9170-5VL
Microcentrífuga Eppendorf 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppndorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Fisherbrand™ Tubos de Microcentrífuga de Baixa Retenção Siliconizados 1.5mlFisher Scientific02-681-320
Tubo de Disjuntor de Gel 0.5 mlIST Engineering Inc,3388-100
Aparelho de eletroforese em gel 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT com bandejas de gel e pentesBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Jersey-CoteLabScientific, Inc1188
KcL 2MAmbionAM9640G
MgCl2 1MAmbionAM9530G
Minifuge centrífuga pessoal de rotor duploEUA científico2641-0016
Modelo V16 aparelho de eletroforese em gel de poliacrilamida, óculos, pentes e espaçadoresCiore Life Science21070010
OligonucleotídeosIDTDefinidos durante o pedido
Owl EasyCast B2 mini sistema de eletroforese - com bandejas de gel e pentesThermofisher ScientificB2
Qiaquick Kit de extração de gelQiagen28704
Enzima de restrição PmeINEBR0560S
Água livre de RNaseAmbionAM9932
Safe Imager 2.0Life TechnologiesG6600
Safe Imager 2.0 transiluminador de luz azulThermofisherG6600
SeaKem LE agaroseLonza50002
Kit de transcrição reversa Superscript IIIInvitrogen18080-044
SybrGoldLife TechnologiesS11494
T4 RNA Ligase 1NEBM0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncado K227QNEB0351L
TEMEDFisher ScientificO3446I-100
Themocycler com tampa aquecidaApplied Biosystem4359659
Tris 1M pH 7.5Invitrogen15567027
Tris 1M pH8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel system concentrado, diluente e tampãoNational DiagnósticoEC-833
Sistema vertical de eletroforese em gel

Referências

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  1. Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D.

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