Artigo de método

Sequenciação de MicroRNA retrospectiva: Biblioteca de DNA complementar preparação protocolo usando amostras de RNA de parafina fixada em formol

DOI:

10.3791/57471

⸱

5 de maio de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Research, Hackensack University Medical Center, 2Department of Medical Sciences, Seton Hall University, 3Department of Epidemiology and Population Health, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Nephrology and Hypertension, Hadassah - Hebrew University Medical Center

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fixada em formol parafina espécimes representam uma fonte valiosa de biomarcadores moleculares de doenças humanas. Aqui nós apresentamos um protocolo de preparação de biblioteca de base laboratorial do cDNA, inicialmente projetado com RNA congelado fresco e otimizado para a análise de microRNAs arquivados de tecidos armazenados até 35 anos.

Resumo

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-Arquivada, clinicamente classificados fixada em formol parafina os tecidos (FFPE) podem fornecer ácidos nucleicos para retrospectivos estudos moleculares de desenvolvimento de câncer. Por meio de lesões pré-malignas ou não-invasiva de pacientes que mais tarde desenvolvem doença invasiva, análises de expressão de gene podem ajudar a identificar cedo alterações moleculares que predispõem ao risco de câncer. Tem sido bem descrito que ácidos nucleicos recuperados de tecidos FFPE sofreram graves danos físicos e modificações químicas, que dificultam a sua análise e geralmente requer ensaios adaptados. MicroRNAs (miRNAs), no entanto, que representam uma pequena classe de moléculas de RNA, abrangendo apenas até ~ 18-24 nucleotídeos, foram mostrados para suportar o armazenamento a longo prazo e foram analisadas com sucesso em amostras FFPE. Aqui apresentamos um 3' código de barras complementares DNA (cDNA) biblioteca preparação protocolo otimizado especificamente para a análise de pequenos RNAs extraído de tecidos arquivados, que recentemente foi demonstrada para ser robusto e altamente reprodutível quando usando arquivados amostras clínicas armazenadas por até 35 anos. Esta preparação da biblioteca está bem adaptada à análise do material comprometido/degradado onde amostras do RNA (até 18) são ligadas com adaptadores de código de barras individual 3' e depois agrupadas para preparações enzimáticas e bioquímicas subsequentes multiplex antes da análise. Todas purificações são executadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), que permite seleções de tamanho específico e avanços de código de barras pequenas espécies de RNA. Esta preparação de biblioteca de cDNA é bem adaptada ao minutos entradas de RNA, como um piloto cadeia da polimerase (PCR) permite a determinação de um ciclo de amplificação específica produzir quantidades ideais de material para o sequenciamento de próxima geração (NGS). Esta abordagem foi otimizada para o uso do RNA de FFPE degradadas das amostras arquivadas por até 35 anos e fornece dados NGS altamente reprodutíveis.

Introdução

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os miRNAs são notavelmente bem conservados no fixada em formol parafina (FFPE) espécimes1,2,3. Trabalhos anteriores têm demonstrado que a expressão destas curtas reguladoras não-codificantes único encalhado RNA moléculas pode ser avaliada com êxito usando o RNA total das amostras FFPE e fornecer dados da expressão do gene relevante quando comparado com o original fresh tecidos4,5,6,7,8. Quando comparado aos RNAs Mensageiro de grande porte, que foram mostrados para ser afectados criticamente por FFPE processamento do tecido (formaldeído, calor, desidratação, etc.), RNases endógenas e a idade dos espécimes, o tamanho pequeno de miRNAs (~ 18 – 24 nucleotídeos) aparece para torná-los resistentes à degradação e resiliente para armazenamento a longo prazo, também demonstrado através de estudos de expressão de miRNA que superam os estudos de mRNA do elevado-throughput em espécimes arquivados9. estudos de expressão de miRNA utilizando amostras clínicas arquivadas, que na sua maioria foram realizadas em análises em pequena escala, tem demonstrado esse single ou multiplexado ensaios PCR quantitativos, diferentes tipos de tecnologias de microarray e mais recentemente NGS pode ser utilizada para avaliar a expressão de miRNAs preservadas após a otimização desses ensaios10,11,12,13,14.

Dado que o dysregulation do miRNA expressão tem sido associada com o desenvolvimento de uma variedade de neoplasias malignas humanas e que há potencialmente um enorme suprimento de clinicamente anotada espécimes arquivados, tornou-se aparente que estes pequenos RNA moléculas representam uma fonte promissora de câncer potenciais biomarcadores15,16,17,18. O uso de uma tecnologia de expressão do gene de alto rendimento como NGS tem a vantagem de fornecer uma avaliação global de todas as transcrições de miRNA quando comparado a tecnologias específicas como PCR e/ou microarrays19. Por esta razão, um protocolo otimizado, acessível e facilmente aplicável para preparação de biblioteca de cDNA de RNAs pequeno de espécimes arquivados mais velhos para NGS foi otimizado para permitir estudos retrospectivos em grande escala20.

Anteriormente, nós estabelecemos um protocolo de extração de RNA/DNA simultâneo para recuperação separado de RNA e DNA de espécimes arquivados mais velhos, que encontramos outperform contemporânea jogos comerciais21. Usando este protocolo de extração, para obter o RNA total de tecidos FFPE arquivados por longo período de tempos, nós aperfeiçoamos a preparação de bibliotecas de cDNA para NGS de miRNAs preservados em amostras clínicas por até 35 anos. Além disso, em um estudo publicado recentemente, onde preparamos bibliotecas de cDNA de carcinoma ductal clinicamente classificada em situ espécimes (DCIS), identificamos os miRNAs diferencialmente expressos que foram validados por PCR quantitativo, que indicou que mudanças de expressão de miRNA específico podem ser detectáveis em lesões de carcinoma ductal in situ de pacientes que desenvolvem câncer de mama quando comparadas às lesões de carcinoma ductal in situ de pacientes que não desenvolvem câncer de mama.

Considerando o custo de kits comerciais para preparação de pequenas bibliotecas de cDNA de RNA, o potencial de sua interrupção, bem como a utilização de reagentes protegidos por direitos autorais/patente que não pode ser otimizado, decidimos adaptar um anteriormente publicados baseado em laboratório e sem kit de 3' código de barras do cDNA biblioteca preparação protocolo para NGS de RNAs pequeno Arquivado em espécimes FFPE, permitindo a análise simultânea de 18 amostras de22. Este protocolo fornece um procedimento passo a passo ideal e robusto com pontos de verificação visual e técnicas de avaliação, que foram fundamentais para a adaptação aos espécimes FFPE RNA, e tem um forte potencial para aplicação em outras fontes de comprometido ou difícil usar material de RNA. Aplicabilidade do protocolo original foi melhorada substituindo tamanho marcado radioactivamente marcadores fluorescentes (por exemplo, SYBR Gold) marcadores de tamanho de RNA detectáveis usados durante a seleção das bibliotecas ligadas na grande gel de poliacrilamida. Este protocolo otimizado depende a ligadura dos adaptadores de código de barras 3' para 18 amostras de RNA FFPE individuais, que são então agrupados para se submeter a 5' ligadura de adaptador, reverso-transcrição e uma análise PCR piloto para adaptados a amplificação do cDNA final biblioteca antes da amplificação do PCR em grande escala, purificação e NGS em um sequenciador de alto rendimento.

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Protocolo

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1. preparação de todos os reagentes e Primers

  1. Ordenar todos os primers e adaptadores conforme descrito na Figura 1.
  2. Prepare o calibrador estoque cocktail, que vai ser cravado em cada Ligadura individual.
    1. Ressuspender do oligonucleotide transportadora (Figura 1) para 0,5 µM com água livre de RNase. Resuspenda os oligonucleotides de calibrador (Figura 1) 10 a 100 µM usando a 0,5 µM portador do oligonucleotide solução.
    2. Combine 10 µ l de cada um dos 10 calibradores numa microcentrifuga siliconizado para obter um estoque de cocktail Calibrador 100 µM e preparar uma solução de nM 0.026 para armazenar a-20 ° C.
  3. Dilua os adenylated original, liofilizado, 20 3' adaptadores com água livre de RNase a uma concentração final de 50 µM (Figura 1).
    Nota: É aconselhável preparar 2,5 alíquotas µ l de cada adaptador em tubos individuais siliconizados e armazená-los a-80 ° C por até 2 anos.
  4. Ressuspender o demolhado 19 nt-3' adaptador e nt-24 3' oligonucleotides de marcador de tamanho de adaptador para 250 ng/mL (Figura 1).
  5. Ressuspender o HPLC purificada 5' adaptador de 100 µM com água livre de RNAse. Resuspenda os primers PCR 5' e 3' a 100 µM usando água livre de RNase (Figura 1).
    Nota: Alíquota todos os oligonucleotides em quantidades necessárias para 1 – 2 experiências e loja a-80 ° C.
  6. Preparar a poliacrilamida desnaturação (PAA) gel carregando tintura combinando formamide 98,8%, 1% (v/v) 0,5 M nd2H2 EDTA, pH 8.0 e azul de bromofenol 0,2% e definir alíquotas de 1ml a-80 ° C.
    1. Prepare a solução de EDTA 0,5 M nd2H2 adicionando 18,6 g de pó de EDTA at2H2 a 50 mL de água livre de nuclease. Adicione NaOH pelotas para atingir pH 8.0. Ajuste o volume a 100 mL para obter 0,5 M nd2H2 EDTA, solução pH 8.0.
    2. Pesa 15 mg de bromofenol em um tubo de 15ml separado. Adicione 600 µ l de água livre de nuclease. Adicione 14,25 mL de formamida deionizada. Adicione 150 µ la 0,5 M nd2H 2 do EDTA, solução de pH 8.0.
    3. Alíquota da solução final do PAA de 15 mL em alíquotas de 1 mL a-80 ° C.
  7. Preparar o 5 x tintura de carregamento através da combinação de azul de bromofenol 0,2%, 0,2% de xileno cianol FF, 50mm Na2H2 EDTA, pH 8,0 e 20% de gel de agarose tipo Ficoll-400.
    1. Resuspenda 1,86 g de at2H2-EDTA em 50 mL de água livre de nuclease num copo de 400 mL em um agitador magnético, à temperatura ambiente (RT). Adicione NaOH pelotas para atingir um pH 8.0. Adicione água livre de nuclease para chegar a 100 mL, para obter uma solução de EDTA at2H2 de 50mm.
    2. Pesar 2 g de pó de tipo Ficoll-400, 20 mg de pó de FF do xileno cianol e 20 mg de pó de azul de bromofenol e ressuspender em 5 mL de 50mm Na2H2 o EDTA.
    3. Vortex o tubo contendo três corantes e adicionar 5 mL de 50mm Na2H2 o EDTA. Misturar a tintura de 5 x agarose gel de carregamento, alíquotas de 1 mL de preparar e armazenar a-80 ° C.

2. configurar a 3' Barcoded adaptador ligadura com 18 amostras de RNA individuais

  1. Identificar 18 espécimes de RNA (pre-aliquotadas em 100 ng em 9,5 µ l de água livre de nuclease em tubos de 1,5 mL siliconizado microcentrifuga) e definir os tubos em gelo descongelar por 10 min.
  2. Prepare o 10x fresco de RNA Ligase Buffer (sem ATP).
    1. Em um tubo de 1,5 mL siliconizado microcentrifuga, combine 343 µ l de água livre de RNase, 500 µ l de Tris 1 M pH 7,5, 100 µ l de 1m MgCl2, 50 µ l de 20 mg/mL de albumina de soro bovino e 7 µ l de 14m 2-Mercaptoetanol. Mix por agredir o tubo, centrífuga para 2 s em 2.000 x g e RT e definir em gelo.
      Nota: Todas as etapas neste protocolo que indicam "centrifugador para 2 s" são executadas numa bancada microcentrifuga RT e uma velocidade máxima de 2.000 x g para buscar soluções para o fundo do tubo.
  3. Preparar estoque de DMSO aquosa 50% adicionando 1 mL de RNase-livre água 1 ml de DMSO em um tubo de microcentrifugadora 2ml siliconizado, enrole o tubo em papel alumínio e armazene a RT
  4. Degele o coquetel de Calibrador 0.026 nM no gelo durante 10 min. Prepare a ligadura Master Mix combinando na seguinte ordem em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL siliconizado: 40 µ l de 10 x RNA Ligase Buffer e 120 µ l de 50% de DMSO aquosa com uma pipeta de 200 mL , e adicionar 10 µ l de Calibrador de nM 0.026 cocktail usando uma pipeta de 10 µ l. Agite o tubo de 1,5 mL, misturar, centrifugue durante 2 s e conjunto-o em gelo.
  5. Adicione 8,5 µ l de ligadura Master Mix para cada uma das 18 amostras do RNA FFPE individualmente aliquotadas, agite suavemente os tubos, centrífuga para 2 s e a loja no gelo.
  6. Degele o 2,5 alíquotas µ l de cada um dos 18, 3' barcoded adaptadores e colocá-los no gelo descongelar por 20 min.
    1. Utilize uma pipeta de 3 µ l para transferir 1 µ l de cada adaptador para as amostras de RNA FFPE correspondentes contendo RNA e ligadura Master Mix (ou seja, 9,5 µ l + 8,5 µ l).
    2. Não pipetar para cima e para baixo, simplesmente dispensar no líquido e puxe a ponta para fora. Certifique-se de mudar dicas entre amostras do RNA FFPE. Feche cada tubo, agite para misturar, centrífuga para 2 s e definir no gelo.
  7. Desnaturar as reações, colocando os 18 tubos em um bloco de calor a 90 ° C por 1 min e coloque imediatamente no gelo.
  8. Prepare a solução de enzima ligadura por diluição 10 µ l de truncado K227Q T4 RNA Ligase 2 com 10 µ l de RNase-livre água em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL siliconizado.
  9. Usar uma pipeta de 3 µ l para transferir 1 µ l da enzima ligadura diluídos em cada uma das 18 amostras do RNA (não Pipetar para cima e para baixo e trocar dicas entre cada tubo). Definir a 18 ligadura no gelo e colocar em um quarto frio de 4 ° C para uma incubação durante a noite de 18 h.

3. purificação do RNAs pequeno ligado

  1. Desactivar as reações de ligadura, colocando os 18 tubos por 1 min em um bloco de calor a 90 ° C e depois voltar para o gelo pelo menos 2 min refrigerar para baixo.
  2. Prepare a precipitação Master Mix, acrescentando 1 µ l de corante azul covalentemente ligado à glicogênio para 26 µ l de NaCl 5 M RNase-livre em um tubo de fresco microcentrifuga siliconizado.
    1. Transferi 1,2 µ l do Master de precipitação Mix em cada um dos 18 tubos. Adicione 63 µ l de etanol 100% para cada um dos 18 tubos. Feche cada tubo, agite para misturar, centrifugue durante 2 s e lugar os tubos em gelo. Combine o conteúdo de todos os 18 tubos em um tubo único 1,5 mL siliconizado.
    2. Fechar o tubo, inverter a três vezes a mistura, centrífuga para 2 s e lugar no gelo por 60 min precipitar.
  3. Prepare um gel de poliacrilamida de 15% (16 x 20 cm2) grande para página.
    1. Dois expressos siliconizado placas de vidro (tratadas com uma alternativa segura para revestimentos de silano) com espaçadores de 0,1 cm.
    2. Combine a 9 mL de diluente de sistema, 18 mL de concentrado de sistema, 3 mL de tampão de sistema, 240 µ l de APS (9%) e 12 µ l de TEMED em um tubo de 50 mL.
    3. Transferir a solução de gel de página entre as placas de vidro com uma pipeta de 30 mL, inserir um pente 14-poço (0,1 cm de espessura) e deixe o gel solidificar no RT por 30 min.
  4. Centrifugar o tubo de 1,5 mL com a ligadura em pool em 16.000 x g e 4 ° C por 60 min.
  5. Remova o pente. Limpe os poços abundantemente com água livre de RNase usando uma garrafa de água com uma ponta de 200 µ l em sua extremidade para alcançar dentro dos poços e forçar a acrilamida não-polimerizada (um bem cada vez) uma lava-louças. Definir o 15% página sobre um aparelho de gel, encher os reservatórios com 0.5 x solução de Tris-borato EDTA (TBE) e pre-funcione o gel por 30 min a 450 V.
  6. Recuperar o tubo com ligadura em pool de centrífuga e seque cuidadosamente a pelota do RNA.
    1. Remover o sobrenadante com uma ponta de pipeta de 1 mL, mas deixar algum líquido no fundo. Inclinar o tubo e usar uma pipeta de 20 mL para remover o sobrenadante restante sem tocar a pelota. Sucção do vácuo do tubo usando uma pipeta Pasteur com uma ponta de 10 µ l em sua extremidade, sem tocar a pelota.
    2. Resuspenda o pellet de RNA em 20 µ l de água livre de RNase por agredir o tubo. Adicionar 20 µ l de gel PAA carregar solução para Ressuspender o RNA, agite para misturar, centrífuga para 2 RT, sentou-se e definir o tubo a 90 ° c por 1 min e coloque imediatamente no gelo.
  7. Substituir o 0.5 x TBE do aparato gel com fresco 0,5 x TBE e carga da escada, marcadores de tamanho e miRNAs ligados no centro do gel, deixando vazio 2 poços em ambos os lados (Figura 2).
  8. Funcione o gel a 450 V (35 mA) para 60 min, pausa a correr durante 10 minutos esfriar e executar novamente a 520 V (25 mA) para outro 60 min. Uncast os 15% página por retirar uma das placas de vidro.
  9. Borrife levemente o gel sentado na placa de vidro com solução corante fluorescente (10 µ l), em 25 mL de 0.5 x TBE e deixe ele sentar apartamento para 5 min no escuro.
  10. Coloque o copo com o gel em um transiluminador de luz azul e alinhar ambos 19 nt e 24 marcadores de tamanho nt com uma régua para direcionar a excisão do RNAs pequeno ligado (Figura 2). Excisar o gel.
  11. Coloque o gel extirpado em um tubo de 0,5 mL, projetado para gel de fatias, firmemente posicionadas em um tubo de 1,5 mL siliconizado microcentrifuga do fragmento. Centrifugar a 16.000 x g durante 3 minutos em RT. Ressuspender o gel fragmentado com 300 µ l de solução de NaCl de 400mm, fechar o tubo e selá-lo com o filme de parafina.
  12. Conjunto do tubo na agitação em um thermomixer a 1.100 rpm em um quarto frio de 4 ° C para uma incubação overnight (16-17 h).

4. ligadura do adaptador 5'

  1. Transferir a solução e gel fragmentado para um filtro de 5 µm tubo sentado em um tubo de 1,5 mL siliconizado, selar com película de parafina e centrifugar durante 5 min à 2.300 x g e RT
  2. Adicione 950 µ l de etanol 100% a solução filtrada, fechar o tubo, inverter para misturar, centrifugue durante 2 s, feche o tubo com a película de parafina e definido no gelo por 1h.
  3. Preparar um 12% do gel da página conforme descrito na etapa 3.3, mas combinar 12,6 mL de diluente, 14,4 mL de concentrado, 3 mL de tampão, 240 µ l APS e 12 µ l de TEMED em um tubo de 50 mL. Pre-executar a 12% gel PAGE por 30 min a 450 V (~ 35 mA) em 0,5 x TBE.
  4. Centrifugue a solução de RNA pequena purificada a 16.000 x g, durante 60 min a 4 ° C.
  5. Cuidadosamente, pipete fora o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL para remover a maior parte da solução e utilizar uma pipeta de 200 mL para remover o restante da solução, sem tocar a pelota.
  6. Com uma pipeta Pasteur com ponta em sua extremidade, conectada a um balão de vácuo 10 mL, cuidadosamente seca a pelota sem tocá-lo.
  7. Resuspenda o pellet em 9 µ l de água livre de RNase sem pipetagem para cima e para baixo, mas por sacudindo levemente o tubo, centrifugue durante 2 s e o conjunto do tubo no gelo.
  8. Preparar o 10x fresco de RNA Ligase Buffer (com ATP), combinando a 500 µ l de 1 M Tris pH 7,5, 100 µ l de 1 M MgCl2, 50 µ l de 20 mg/mL acetilado BSA, 200 µ l de 10mm ATP, 7 µ l de 2-Mercaptoetanol 14m e 143 µ l de água livre de RNase.
  9. Misture o 10x RNA Ligase Buffer (com ATP) por agredir o tubo e centrifugar durante 2 s para recolher a solução na parte inferior do tubo.
  10. Configurar a ligadura de adaptador 5' pela adição µ l 2 de 10 x RNA Ligase Buffer (com ATP), 1 µ l de 100 µM 5' adaptador e 6 µ l 50% DMSO aquoso para o µ l 9, 3' código de barras pequeno RNA solução.
  11. Agite o tubo levemente para misturar, centrifugue durante 2 s para recolher a solução, coloque o tubo num bloco de calor a 90 ° C por 1 min e volta no gelo pelo menos 2 min.
  12. Adicionar 2 µ l de T4 RNA Ligase 1 na solução (não pipete acima e para baixo), agite o tubo, centrífuga para 2 s e sente-se o tubo em flutuante rack em banho-maria 37 ° C por 60 min.
  13. Simultaneamente, configurar dois ligadura entre os 19 nt-3' e o adaptador de 5' e dois ligadura entre o nt-24 3' adaptador e o adaptador de 5'.
    1. Combinar 2 µ l do 19nt-3' adaptador (250 ng / µ l) ou nt-24 3' adaptador (250 ng / µ l) com: 2 µ l do 5' adaptador (100 µM), 2 µ l de RNA Ligase Buffer (com ATP), de 10X 6 µ l de 50% DMSO aquosa, 6 µ l de água livre de RNase e 2 µ l de T4 RNA Ligase 1 em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL siliconizado.
    2. Agite os tubos para misturar, centrifugue durante 2 s e o conjunto dos tubos a 37º C por 60 min.
  14. Adicionar 20 µ l de tampão de desnaturação PAA a ligadura todos (purificado RNAs pequeno, 2 ligadura com 19nt-3' adaptador e 2 ligadura com 24nt-3' adaptador).
    1. Mix por agredir os tubos, centrífuga para 2 s e incubar os tubos num bloco a 90 ° C, durante 1 min. transferência de calor de todos os tubos para o gelo e preparar uma escada (3 mL de escada com 20 µ l de PAA).
  15. Esvazie o reservatório superior do aparato gel com o pre-run 12% PAGE gel e adicionar a solução fresca de 0,5 x TBE abaixo do nível dos poços (poços são esvaziados com uma pipeta de ponta longa e fina).
    1. Carrega as amostras com uma ponta de pipeta fina, conforme descrito na Figura 3.
    2. X TBE uso 0.5 fresco para encher poços individuais para o topo do gel.
    3. Adicionar 0,5 fresco x TBE ao reservatório acima dos poços e iniciar a electroforese da 12% página para 60 min a 450 V (~ 35 mA).
    4. Pause a execução desligando o gerador para 10 min arrefecer o gel. Reinicie o gerador e execute o gel por 60 min em 520 V (~ 25 mA).
  16. Parar o gerador, esvaziar os reservatórios invertendo-se o aparelho acima uma pia e uncast a 12% página por retirar uma das placas de vidro.
  17. Sente-se o vidro com o gel liso, spray gel com 10 µ l do corante fluorescente em 25 mL 0,5 x TBE, incubar no escuro por 5 min. colocar o vidro com o gel em um transiluminador de luz azul e alinhar ambos os 19 nt e ambos os 24 nt tamanho marcadores com uma régua para direcionar a excisão do RNAs pequeno ligado (Figura 3).
    1. Excisar o gel e transferir o pedaço de gel de extirpado num tubo 0,5 mL gel de disjuntor. Feche a tampa do tubo de gel separador, conjunto em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL siliconizado e seguro com a película de parafina. Remova o tubo de gel de disjuntor, adicionar 300 µ l de 300 mM de NaCl e 1 µ l de 100 µM 3' do PCR da primeira demão para os pedaços de gel esmagado em um tubo de 1,5 mL.
    2. Feche o tubo com película de parafina na agitação em um thermomixer a 1.100 rpm a 4 ° C, durante a noite (17 – 18 h) em uma sala fria.

5. reversa transcrição do 5' ligado e 3' Barcoded purificado RNAs pequeno

  1. Recuperar o tubo do filtro thermomixer e purificar a solução com um tubo de filtro de 5 µM.
    1. Utilização de uma pipeta de 1 mL para transferir a solução para um tubo de filtro 5 µM inserido um 1,5 mL siliconizado RNase-livre do tubo de coleta. Centrifugar o tubo por 3 min em 2.300 x g e RT
    2. Descartar o tubo do filtro e adicionar 950 µ l de etanol 100% para o tubo de colheita de microcentrifuga de 1,5 mL contendo solução filtrada. Inverta o tubo à mistura, centrífuga para 2 s e lugar no gelo por 60 min. precipitado o RNA de pelotas por centrifugação do tubo em 16.000 x g e 4 ° C, durante 1 h.
  2. Seque a pelota do RNA.
    1. Abra a tampa e remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL, deixando um pouco de líquido no fundo.
    2. Use uma pipeta de 20 µ l para remover todo o sobrenadante restante sem tocar a pelota. Incline o tubo para permitir que qualquer solução para sentar-se no lado oposto da pelota.
    3. Use uma pipeta Pasteur com uma ponta de pipeta não filtrada de 10 mL para aspirar o sobrenadante e secar o sedimento usando um vácuo.
  3. Resuspenda o pellet de RNA em 5,6 µ l de água livre de RNase.
    1. Descongele os reagentes de transcrição reversa no gelo por 15 min. conjunto para uma reação de transcrição reversa adicionando 3 µ l de 5 x 1,5 µ l de ditiotreitol (DTT), 4,2 µ l de 10 x deoxynucleotide trifosfato (dNTPs) (a cada 2 mM) e Buffer para os 5,6 µ l de RNase-livre ressuspenso.
    2. Agite suavemente o tubo para misturar a reação e centrifugar durante 2 s para recolher a solução. Configurar a reação em um bloco de calor a 90 ° C para exatamente 30 s e então transferência diretamente sobre um thermomixer a 50 ° C.
    3. Deixe o tubo sobre o thermomixer por 2 min para que equaliza a temperatura. Adicione 0,75 µ l da enzima transcrição reversa diretamente para a solução, filme delicadamente para misturar e conjunto o tubo de volta a thermomixer a 50 ° C por 30 min imediatamente.
  4. Depois de 30 min, transferi o tubo para um bloco de calor a 95 ° C por 1 min parar a transcrição reversa. Adicionar 95 µ l de água livre de RNase diretamente para a transcrição reversa, agite o tubo para misturar e configurá-lo diretamente no gelo por 2 min.
  5. Rótulo do tubo com a identificação do cDNA estoque biblioteca e biblioteca.

6. piloto do PCR e amplificação por PCR em grande escala

  1. Prepare-se fresco 10 de x PCR buffer por adicionando µ l 304 de água livre de RNase, 125 µ l de 2 M de KCl, 50 µ l de 1 M Tris pH 8.0, 10 µ l de 1m MgCl2, 5 µ l de 1% Triton X-100 e 6 µ l de 1 M 2-Mercaptoetanol num tubo siliconizado microcentrifuga e mantém na RT
  2. Montar a reação de PCR piloto combinando 67 µ l de água livre de RNase, 10 µ l de tampão de PCR, 10 µ l de 10 x dNTPs, 0,5 µ l de 100 µM 5' PCR da primeira demão, 0,5 µ l de 100 µM 3' do PCR da primeira demão, 10 µ l de estoque biblioteca de cDNA de 10x e 2 µ l de 50 x Taq polimerase.
    1. Configurar dois PCR ciclos em um thermocycler como segue: arquivo 1: 94 ° C por 45 s, 50 ° C para 85 s e 72 ° C por 60 s para 10 ciclos, segure a 4 ° C; Arquivo 2: 94 ° C por 45 s, 50 ° C para 85 s e 72 ° C por 60 s para 2 ciclos, segure a 4 ° C. Configurar a reação de PCR de piloto no thermocycler e iniciar o arquivo 1.
    2. No final do arquivo 1, abrir o tubo PCR, e usando uma pipeta de 20 µ l, transferência, 12 µ l da reação de PCR de piloto em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo 3 µ l de 5 x gel carregando o corante, misture pipetando para cima e para baixo, fechar o tubo e rotulá-la "10 ciclos".
    3. Fechar o tubo do PCR de piloto e começar 2 arquivo um thermocycler. No final do arquivo 2, abra o tubo do PCR usar uma pipeta de 20 mL para transferir 12 µ l da solução no tubo de 1,5 mL microcentrifuga com 3 µ l de 5 x tintura do carregamento de gel e rotulá-la "12 ciclos".
    4. Repita as etapas descritas em etapas 6.2.2 e 6.2.3 para coletar 12 produtos PCR µ l da reação de PCR de piloto em ciclos PCR, 14, 16, 18 e 20. Adicionar 3 µ l de 5 x tintura gel de carregamento para cada uma das alíquotas PCR 12 µ l e para a escada de nt 20 contendo 3 µ l de escada e 9 µ l de água livre de RNase.
  3. Preparar um gel de agarose de 2,5% com 0,5 x TBE.
    1. Pesar 2,5 g de agarose em um copo limpo e adicionar 100 mL de 0.5 x TBE. Aquece a solução no microondas até ferver. Remover a solução do microondas, agite o frasco para misturar o agarose, adicionar 4 μL de brometo de etídio (10 mg/mL) e transferir a solução para uma bandeja de eletroforese2 7 x 10 cm, fechada em ambas as extremidades com fita adesiva.
    2. Defina um pente 8 poços e deixe o gel de agarose solidificar no RT. transferência o agarose solidificado do gel em um aparelho de eletroforese repleto de 0.5 x TBE.
  4. Carregar a escada e amostras PCR em gel de agarose e executá-lo por 30 min em 120 V.
  5. Avalie o gel em uma caixa de UV para identificar o ciclo ideal de PCR (Figura 4A).
    Nota: O tamanho das bandas PCR antecipados é mostrado na Figura 4B.
    1. Observar as duas bandas PCR em cada um dos diferentes poços (banda superior: biblioteca de DNA, a banda inferior: dímero da primeira demão).
    2. Identificar o ciclo adequado de PCR para a amplificação do cDNA, selecionando o ciclo onde a biblioteca de cDNA é visível, mas o dímero da primeira demão é mal observável.
      Nota: Geralmente, o ciclo adequado de PCR é selecionado entre 12 – 16 ciclos. Na Figura 4A, o ciclo PCR adequado para esta biblioteca é 14.
  6. Configurar as reações de PCR em grande escala (6 x 100 µ l) para a purificação de biblioteca de gel de agarose.
    1. Prepare um tubo fresco de 10x Buffer PCR, seguindo passo 6.1.
    2. Prepare a grande escala do PCR Master Mix em um tubo de 1,5 mL, combinando 435,5 µ l de água livre de RNase, 65 µ l de tampão de x PCR 10, 65 µ l de 10 x dNTPs, 3.25 µ l de 5' primer PCR, 3.25 µ l de 3' PCR primer e pipetagem para cima e para baixo para misturar.
    3. Transferi 88 µ l do PCR Master Mix em seis tubos PCR de 0,5 mL. Transferência de 10 µ l de cDNA Library de estoque (armazenado no gelo), adicionar 2 µ l de 50 x Taq polimerase em cada um dos 6 tubos PCR e pipetar para misturar.
    4. Prepare um tubo de reação de PCR negativo, combinando 77 µ l de RNase-livre água, 10 µ l de tampão de x PCR 10, 10 µ l de 10 x dNTPs, 0,5 µ l de 5' primer PCR, 0,5 µ l de 3' primer PCR e 2 µ l de 50 x Taq polimerase e pipeta para misturar.
    5. Coloque os tubos PCR no thermocycler utilizando o ciclo PCR descrito na etapa 6.2.1 e definir o número ideal de ciclos de amplificação. Preparar um gel de agarose 2,5% usando 0.5 x TBE, conforme descrito na etapa 6.3.
  7. Após amplificação por PCR, transferi 9 µ l de cada tubo PCR em seis tubos de microcentrifuga de 1,5 mL contendo 3 µ l de 5 x tintura do carregamento de gel.
    1. Prepare 20 escada nt combinando 3 mL de escada em 9 µ l de água livre de RNase e gel de 3 µ l adicionando corante de carregamento em um tubo de 1,5 mL.
    2. Carregar a escada, controlo PCR negativo e 6 produtos PCR para o gel de agarose e funcione o gel por 30 min em 120 V.
    3. Verificar a uniformidade das amplificações do PCR entre pistas em uma caixa de UV (dê uma imagem).
    4. Combine 3 reações de PCR em duas 1,5 mL siliconizado microcentrifuga tubo (3 x 91 µ l), adicionar µ l 27 de 5 M NaCl e 950 µ l de etanol 100%. Inverta os tubos para misturar e coloque a-20 ° C durante a noite para precipitar os produtos PCR.

7. purificação de biblioteca de cDNA e avaliação

  1. Centrifugar os dois tubos com as reações de PCR a 16.000 x g, durante 60 min a 4 ° C.
  2. Remover o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL, em seguida, incline o tubo com o sedimento no lado superior e o líquido na parte inferior e usar uma pipeta Pasteur, conectada a um balão de vácuo com uma banheira e aspire o líquido com uma ponta de 10 mL no final da pipeta Pasteur.
  3. Configure o digest PmeI.
    1. Um dos rolos PCR com 17,5 µ l de água livre de nuclease Resuspenda e transferir ressuspenso ao segundo pellet de PCR. Adicionar 2 µ l de tampão de 10x e 0,5 µ l da enzima PmeI e definir o resumo em um banho de água durante 2 h a 37 ° C.
    2. Preparar um gel de agarose 2,5% usando 0.5 x TBE (etapa 6.3). Adicione 6 µ l de 5 x tintura gel de carregamento para o resumo. Transferir 13 µ l de cada Resumo em dois poços adjacentes do gel do agarose, carregar a escada de tamanho 20 nt nos poços final e funcione o gel durante 90 minutos a 150 V (Figura 4).
    3. Excisar as bandas PCR superiores do gel na caixa UV, transfira os pedaços de gel num tubo microcentrifuga recentemente pesava 1,5 mL e pesar os pedaços de gel em escala.
  4. Purifica a biblioteca de cDNA amplificado extirpada do PCR usando um kit de extração de gel seguindo as instruções do fabricante. Quantificar a biblioteca de cDNA usando um ensaio de quantificação de DNA e o instrumento, seguindo as instruções do fabricante.
  5. Avalie o tamanho e a pureza da biblioteca de cDNA com um chip de DNA de alta sensibilidade em um Bioanalyzer (Figura 5). Sequência da biblioteca de cDNA usando um sistema de alta produtividade. Transferi o arquivo de dados FASTQ para o pipeline de RNAworld para o aparamento de adaptador e alinhamento para o genoma humano para identificar as sequências de miRNA.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conforme descrito no método aqui, um total de 18 amostras de RNA FFPE individuais (100 ng cada) são criadas em tubos separados submeter-se a 3' adenylated código de barras do oligonucleotide T4 ligadura durante a noite. No dia seguinte, as reações enzimáticas são calor-desativado, combinadas e precipitadas em um único tubo. A pelota do RNA é resuspended e as moléculas de RNA ligadas são separadas em um 15% desnaturação gel de poliacrilamida (PAGE), onde marcadores de tamanho do oligonucle...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um protocolo de preparação de biblioteca de cDNA altamente reprodutível e robusto para NGS de RNAs pequeno Arquivado em amostras de RNA FFPE é apresentado no presente protocolo, que é uma versão modificada e otimizada do procedimento descrito por Hafner et al . 22

Todas as etapas do presente protocolo foram otimizadas para uso com mais antigo arquivado e comprometido o RNA total recuperado de espécimes FFPE. A etapa chave do presente protocolo, para o processam...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores desejam divulgar que uma publicação que contém alguns dos dados apresentados neste manuscrito foi publicada no jornal internacional de Ciências moleculares por Loudig et al . 21.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos o Dr. Thomas Tuschl, chefe do laboratório de biologia molecular de RNA, bem como membros de seu laboratório por seu apoio e para compartilhar a tecnologia desenvolvida no seu laboratório e fornecendo acesso ao pipeline de RNAworld. Agradecemos também o Dr. Markus Hafner para o protocolo de compartilhamento e fornecendo descrições detalhadas sobre todos os passos bioquímicos e enzimáticos utilizados em seu procedimento inicial.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1% Triton x-100InvitrogenHFH10
10mM ATPAmbionAM8110G
10X dNTPsAmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14M MercaptoetanolSigmaO3445I-100
20 nt escadaJena BioscienceM-232S
20mg/ml Albumina de soro bovinoSigmaB8894-5ML
50X Titanium TaqClontech Laboratories639208
Persulfato de amônioFisher Scientific7727-54-0
BRL com placas de vidro e pentesGIBCOV16
Dimetil sulfóxido (DMSO)SigmaD9170-5VL
Microcentrífuga Eppendorf 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppndorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Fisherbrand™ Tubos de Microcentrífuga de Baixa Retenção Siliconizados 1.5mlFisher Scientific02-681-320
Tubo de Disjuntor de Gel 0.5 mlIST Engineering Inc,3388-100
Aparelho de eletroforese em gel 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT com bandejas de gel e pentesBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Jersey-CoteLabScientific, Inc1188
KcL 2MAmbionAM9640G
MgCl2 1MAmbionAM9530G
Minifuge centrífuga pessoal de rotor duploEUA científico2641-0016
Modelo V16 aparelho de eletroforese em gel de poliacrilamida, óculos, pentes e espaçadoresCiore Life Science21070010
OligonucleotídeosIDTDefinidos durante o pedido
Owl EasyCast B2 mini sistema de eletroforese - com bandejas de gel e pentesThermofisher ScientificB2
Qiaquick Kit de extração de gelQiagen28704
Enzima de restrição PmeINEBR0560S
Água livre de RNaseAmbionAM9932
Safe Imager 2.0Life TechnologiesG6600
Safe Imager 2.0 transiluminador de luz azulThermofisherG6600
SeaKem LE agaroseLonza50002
Kit de transcrição reversa Superscript IIIInvitrogen18080-044
SybrGoldLife TechnologiesS11494
T4 RNA Ligase 1NEBM0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncado K227QNEB0351L
TEMEDFisher ScientificO3446I-100
Themocycler com tampa aquecidaApplied Biosystem4359659
Tris 1M pH 7.5Invitrogen15567027
Tris 1M pH8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel system concentrado, diluente e tampãoNational DiagnósticoEC-833
Sistema vertical de eletroforese em gel

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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