Sequenciação de MicroRNA retrospectiva: Biblioteca de DNA complementar preparação protocolo usando amostras de RNA de parafina fixada em formol

O objetivo geral desta preparação da Biblioteca CDNA é permitir o sequenciamento bem-sucedido de pequenos RNAs que foram armazenados em tecidos formais e fixados embebidos em parafina. Este método é muito útil para analisar espécimes formais e fixos embebidos em parafina. Você extrai RNA de até 18 amostras, analisa o conteúdo de todas elas e obtém um perfil de todas as microRNase para todas as amostras.

Para iniciar o protocolo, adicione 8,5 microlitros de mistura mestre de ligadura previamente preparada a cada uma das 18 amostras FFPERNA individualmente alícitadas. Agite suavemente os tubos e centrifugue por dois segundos. Após a centrifugação, armazene os tubos no gelo.

Use uma pipeta de três microlitros para transferir um microlitro de cada adaptador, para as amostras FFPERNA correspondentes contendo RNA e mistura mestre de ligação. Não pipete para cima e para baixo e troque as pontas entre as amostras FFPERNA. Feche cada tubo, agite-os para misturar e centrifugue-os por dois segundos.

Coloque os tubos no gelo. Desnature as reações colocando os tubos em um bloco de calor a 90 graus Celsius por um minuto e, em seguida, coloque-os imediatamente no gelo. Em seguida, use uma pipeta de três microlitros para transferir um microlitro da enzima de ligação diluída para cada uma das 18 amostras de RNA.

Coloque as ligaduras no gelo e coloque-as em uma câmara fria de quatro graus Celsius para uma incubação noturna de 18 horas. Coloque os tubos em um bloco de calor por um minuto a 90 graus Celsius para desativar a reação de ligadura e, em seguida, coloque-os de volta no gelo por pelo menos dois minutos para esfriar. Transfira 1,2 microlitros da mistura mestre de precipitação para cada tubo.

Adicione 63 microlitros de etanol 100%. Feche cada tubo, agite os tubos para misturar e centrifugue-os por dois segundos. Coloque os tubos no gelo.

Combine o conteúdo de todos os 18 tubos em um único tubo siliconizado de 1,5 mililitro e inverta três vezes para misturar. Centrifugue os tubos por dois segundos e coloque-os no gelo por 60 minutos para precipitar. Após a precipitação, centrifugue o tubo de 1,5 mililitro com as ligaduras agrupadas.

Em seguida, remova o sobrenadante com uma ponta de pipeta de um mililitro, mas deixe um pouco de líquido no fundo. Incline o tubo e use uma pipeta de 20 microlitros para remover o sobrenadante restante. Sugue a vácuo o sobrenadante com uma pipeta Pasteur com uma ponta de 10 microlitros e, em seguida, ressuspenda o pellet de RNA em 20 microlitros de água sem RNase sacudindo o tubo.

Adicione 20 microlitros de solução de carga de gel PAA para ressuspender o RNA. Agite o tubo, centrifugue o tubo por dois segundos em temperatura ambiente e coloque o tubo no gelo. Substitua o 0,5 XTBE previamente preparado do aparelho de gel por 0,5 XTBE novo e carregue o último, marcadores de tamanho e RNase ligada no centro do gel, deixando dois poços vazios em ambos os lados.

Em seguida, execute o gel. Depois de passar o gel, desmolde a página de 15% removendo uma das placas de vidro. Pulverize levemente o gel sobre a placa de vidro com 10 microlitros de solução de corante fluorescente e 25 mililitros de 0,5 XTBE e deixe descansar por cinco minutos no escuro.

Coloque o vidro com o gel em um transiluminador de luz azul e alinhe os marcadores de tamanho de 19 nucleotídeos e 24 nucleotídeos com uma régua para direcionar a excisão dos pequenos RNAs ligados. Em seguida, retire o gel. Coloque o gel excisado em um tubo de 0,5 mililitro projetado para fragmentar as fatias de gel, posicionado com segurança em um tubo de microcentrífuga siliconizado de 1,5 mililitro.

Centrifugue o gel a 16 mil vezes G por três minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda o gel fragmentado com 300 microlitros de solução de cloreto de sódio a 400 milimolares. Feche o tubo e sele-o com filme de parafina.

Agite o conteúdo em um misturador térmico a 11 cem RPM em uma câmara fria de quatro graus Celsius para uma incubação durante a noite. No dia seguinte, recupere o tubo do misturador térmico e use uma pipeta de um mililitro para transferir a solução para um tubo de filtro de cinco micrômetros, inserido em um tubo de coleta sem RNase siliconizado de 1,5 mililitro. Centrifugue o tubo por três minutos a 23 centenas de vezes G à temperatura ambiente.

Descarte o tubo do filtro, adicione 950 microlitros de etanol a 100% ao tubo de coleta que contém a solução filtrada e inverta o tubo para misturar. Centrifugue o tubo por dois segundos e coloque-o no gelo por 60 minutos. Em seguida, precipite o pellet de RNA.

Em seguida, seque o pellet de RNA abrindo a tampa e removendo cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de um mililitro, deixando um pouco de líquido no fundo. Use uma pipeta de 20 microlitros para remover todo o sobrenadante restante sem tocar no pellet. Incline o tubo para que qualquer solução restante se mova para o lado oposto do pellet.

Use uma pipeta Pasteur para aspirar o sobrenadante e seque o pellet usando vácuo. Ressuspenda o pellet de RNA em 5,6 microlitros de água livre de RNase. Descongele os reagentes de transcrição reversa no gelo por 15 minutos.

Configure uma reação de transcrição reversa adicionando três microlitros de tampão 5X, 4,2 microlitros de trifosfato de dioxinucleotídeo 10X, ou DNTPs, e 1,5 microlitro de ditiotreitol ou DTT. Agite suavemente o tubo para misturar a reação e centrifugue por dois segundos para coletar a solução. Depois que a reação estiver em um bloco de calor a 90 graus Celsius por exatamente 30 segundos, transfira-a diretamente para um misturador térmico a 50 graus Celsius por dois minutos para equalizar a temperatura.

Adicione 0,75 microlitros da enzima de transcrição reversa diretamente na solução. Agite suavemente para misturar e coloque o tubo de volta no misturador térmico a 50 graus Celsius por 30 minutos imediatamente. Após 30 minutos, transfira o tubo para um bloco de calor a 95 graus Celsius por um minuto para interromper a transcrição reversa.

Adicione 95 microlitros de água livre de RNase diretamente à transcrição reversa. Agite o tubo para misturar e coloque-o diretamente no gelo por dois minutos. Monte a reação de PCR piloto e configure dois ciclos de PCR no termociclador.

Configure a reação de PCR piloto no termociclador e inicie o arquivo um. No final do arquivo um, use uma pipeta de 20 microlitros para transferir 12 microlitros da reação de PCR piloto para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo três microlitros de corante de carga de gel 5X. Misture pipetando para cima e para baixo.

E rotule-o como 10 ciclos. Feche o tubo de PCR piloto e inicie file dois no termociclador. No final do arquivo dois, use uma pipeta de 20 microlitros para transferir 12 microlitros de solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com três microlitros de corante de carga de gel 5X e rotule-o em 12 ciclos.

Repita as etapas acima para coletar 12 microlitros de produtos de PCR da reação de PCR piloto nos ciclos de PCR 14, 16, 18 e 20. Em seguida, adicione três microlitros de corante de carga de gel 5X a cada uma das alíquotas de PCR de 12 microlitros e à escada de 20 nucleotídeos contendo três microlitros de escada e nove microlitros de água livre de RNase. Depois de executar as amostras em um gel de agarose com 0,5 XTBE, avalie o gel em uma caixa UV para identificar o ciclo de PCR ideal.

Em seguida, configure as reações de PCR em larga escala para purificação da biblioteca de gel de agarose. Após a amplificação por PCR, transfira nove microlitros de cada tubo de PCR para seis tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro, contendo três microlitros de corante de carga de gel 5X. Prepare uma escada de 20 nucleotídeos.

Carregue a escada, o controle de PCR negativo e seis produtos de PCR no gel de agarose e deixe o gel funcionar por 30 minutos a 120 volts. Verifique a uniformidade das implicações de PCR entre as pistas em uma caixa UV e tire uma imagem. Combine três reações de PCR em dois tubos de microcentrífuga siliconizados de 1,5 mililitro, adicione 27 microlitros de cloreto de sódio de cinco molares e 950 microlitros de etanol a 100%.

Inverta os tubos para misturar e ajuste-os a 20 graus Celsius durante a noite para precipitar os produtos de PCR. Usando o protocolo, a correlação de expressão de micro RNA entre os dois RNAs tumorais frescos congelados e suas contrapartes específicas de espécimes FFPERNA foi verificada. Os gráficos entre o microRNA fresco congelado e o microRNA FFPE indicam que a preparação da Biblioteca CDNA fornece uma boa reprodutibilidade, pois há alta correlação entre o microRNA detectado em amostras processadas de forma diferente.

Para determinar se o protocolo de preparação otimizado da Biblioteca CNDA era aplicável e reprodutível com espécimes FFPE cada vez mais antigos, foram obtidos perfis de expressão de micro RNA de tecidos FFPE arquivados por 18, 20, 22, 27, 30 e 35 anos. O coeficiente de correlação manteve-se acima de 0,96, independentemente da idade do espécime ou da semana de preparação da biblioteca. Portanto, o protocolo otimizado de preparação da Biblioteca CDNA fornece uma ferramenta robusta para análise reprodutível de espécimes FFPE, independentemente do tempo de arquivamento.

Portanto, depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como preparar suas pequenas bibliotecas de RNA e obter um perfil completo de microexpressão de todos os seus preciosos espécimes formais e fixos embebidos em parafina.