Name: Sequenciação de MicroRNA retrospectiva: Biblioteca de DNA complementar preparação protocolo usando amostras de RNA de parafina fixada em formol (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprenda a preparar bibliotecas de cDNA para sequenciamento de microRNAs a partir de tecidos fixados em formol e emblocados em parafina. Este protocolo permite analisar até 18 amostras arquivadas por até 35 anos para descoberta de biomarcadores.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos o Dr. Thomas Tuschl, chefe do laboratório de biologia molecular de RNA, bem como membros de seu laboratório por seu apoio e para compartilhar a tecnologia desenvolvida no seu laboratório e fornecendo acesso ao pipeline de RNAworld. Agradecemos também o Dr. Markus Hafner para o protocolo de compartilhamento e fornecendo descrições detalhadas sobre todos os passos bioquímicos e enzimáticos utilizados em seu procedimento inicial.

<ol><li>Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stability+of+microRNAs+in+tissue+samples+of+compromised+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows.+Arch%22%5BJournal%5D)">High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality.</a> Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).</li>
<li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excavation+of+a+buried+treasure--DNA%2C+mRNA%2C+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed%2C+paraffin+embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).</li>
<li>Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Stability+in+Postmortem+FFPE+Tissues%3A+Quantitative+Analysis+Using+Autoptic+Samples+from+Acute+Myocardial+Infarction+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients.</a> PLoS One. 10 (6), e0129338(2015).</li>
<li>Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsa-miR-375+is+differentially+expressed+during+breast+lobular+neoplasia+and+promotes+loss+of+mammary+acinar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity.</a> J. Pathol. 226, 108-119 (2012).</li>
<li>Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+micro-RNA+profiling+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues.</a> Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).</li>
<li>Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+array-based+analysis+of+microRNA+expression+comparing+matched+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples.</a> J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).</li>
<li>Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-platform+analysis+of+microRNA+expression+measurements+in+RNA+from+fresh+frozen+and+FFPE+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues.</a> PLoS One. 8, e52517(2013).</li>
<li>Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microRNA+deep+sequencing+of+matched+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues.</a> PLoS One. 8 (5), e64393(2013).</li>
<li>Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+outperforms+mRNA+expression+profiling+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).</li>
<li>Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+tissue+using+real+time+quantitative+PCR%3A+the+strengths+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls.</a> J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).</li>
<li>Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+from+routine+pathology+archives+are+suitable+for+microRNA+analyses+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR.</a> J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).</li>
<li>Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+miRNA+expression+analysis+using+fluidigm+microfluidics+dynamic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays.</a> BMC Genomics. 12, 144(2011).</li>
<li>Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).</li>
<li>Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+microarray-based+interrogation+of+microRNAs+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%3A+preliminary+assessment+of+cross-platform+concordance%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance.</a> Genomics. 102, 8-14 (2013).</li>
<li>Visone, R., Croce, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2671346/">MiRNAs and cancer.</a> Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).</li>
<li>Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Cho, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+potential+biomarkers+for+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+targets+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).</li>
<li>Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNAs+as+diagnostic+or+prognostic+markers+in+human+epithelial+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies.</a> BMC Cancer. 11, 500(2011).</li>
<li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).</li>
<li>Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Adaptation+of+a+Laboratory+Based+cDNA+Library+Preparation+Protocol+for+Retrospective+Sequencing+of+Archived+MicroRNAs+from+up+to+35-Year-Old+Clinical+FFPE+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens.</a> Int J Mol Sci. 18, e627(2017).</li>
<li>Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+DNA%2FRNA+co-extraction+for+analysis+of+microRNAs%2C+mRNAs%2C+and+genomic+DNA+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens.</a> PLoS One. 7 (4), e34683(2012).</li>
<li>Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoded+cDNA+library+preparation+for+small+RNA+profiling+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing.</a> Methods. 58 (2), 164-170 (2012).</li>
<li>Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumina+whole-genome+complementary+DNA-mediated+annealing%2C+selection%2C+extension+and+ligation+platform%3A+assessing+its+performance+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+samples+and+identifying+invasion+pattern-related+genes+in+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma.</a> Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).</li>
</ol>

Os autores desejam divulgar que uma publicação que contém alguns dos dados apresentados neste manuscrito foi publicada no jornal internacional de Ciências moleculares por Loudig et al . 21.

Um protocolo de preparação de biblioteca de cDNA altamente reprodutível e robusto para NGS de RNAs pequeno Arquivado em amostras de RNA FFPE é apresentado no presente protocolo, que é uma versão modificada e otimizada do procedimento descrito por Hafner et al . 22
Todas as etapas do presente protocolo foram otimizadas para uso com mais antigo arquivado e comprometido o RNA total recuperado de espécimes FFPE. A etapa chave do presente protocolo, para o processam...

os miRNAs são notavelmente bem conservados no fixada em formol parafina (FFPE) espécimes1,2,3. Trabalhos anteriores têm demonstrado que a expressão destas curtas reguladoras não-codificantes único encalhado RNA moléculas pode ser avaliada com êxito usando o RNA total das amostras FFPE e fornecer dados da expressão do gene relevante quando comparado com o original fresh tecidos4,5,6,7,8. Quando comparado aos RNAs Mensageiro de grande porte, que foram mostrados para ser afectados criticamente por FFPE processamento do tecido (formaldeído, calor, desidratação, etc.), RNases endógenas e a idade dos espécimes, o tamanho pequeno de miRNAs (~ 18 – 24 nucleotídeos) aparece para torná-los resistentes à degradação e resiliente para armazenamento a longo prazo, também demonstrado através de estudos de expressão de miRNA que superam os estudos de mRNA do elevado-throughput em espécimes arquivados9. estudos de expressão de miRNA utilizando amostras clínicas arquivadas, que na sua maioria foram realizadas em análises em pequena escala, tem demonstrado esse single ou multiplexado ensaios PCR quantitativos, diferentes tipos de tecnologias de microarray e mais recentemente NGS pode ser utilizada para avaliar a expressão de miRNAs preservadas após a otimização desses ensaios10,11,12,13,14.
Dado que o dysregulation do miRNA expressão tem sido associada com o desenvolvimento de uma variedade de neoplasias malignas humanas e que há potencialmente um enorme suprimento de clinicamente anotada espécimes arquivados, tornou-se aparente que estes pequenos RNA moléculas representam uma fonte promissora de câncer potenciais biomarcadores15,16,17,18. O uso de uma tecnologia de expressão do gene de alto rendimento como NGS tem a vantagem de fornecer uma avaliação global de todas as transcrições de miRNA quando comparado a tecnologias específicas como PCR e/ou microarrays19. Por esta razão, um protocolo otimizado, acessível e facilmente aplicável para preparação de biblioteca de cDNA de RNAs pequeno de espécimes arquivados mais velhos para NGS foi otimizado para permitir estudos retrospectivos em grande escala20.
Anteriormente, nós estabelecemos um protocolo de extração de RNA/DNA simultâneo para recuperação separado de RNA e DNA de espécimes arquivados mais velhos, que encontramos outperform contemporânea jogos comerciais21. Usando este protocolo de extração, para obter o RNA total de tecidos FFPE arquivados por longo período de tempos, nós aperfeiçoamos a preparação de bibliotecas de cDNA para NGS de miRNAs preservados em amostras clínicas por até 35 anos. Além disso, em um estudo publicado recentemente, onde preparamos bibliotecas de cDNA de carcinoma ductal clinicamente classificada em situ espécimes (DCIS), identificamos os miRNAs diferencialmente expressos que foram validados por PCR quantitativo, que indicou que mudanças de expressão de miRNA específico podem ser detectáveis em lesões de carcinoma ductal in situ de pacientes que desenvolvem câncer de mama quando comparadas às lesões de carcinoma ductal in situ de pacientes que não desenvolvem câncer de mama.
Considerando o custo de kits comerciais para preparação de pequenas bibliotecas de cDNA de RNA, o potencial de sua interrupção, bem como a utilização de reagentes protegidos por direitos autorais/patente que não pode ser otimizado, decidimos adaptar um anteriormente publicados baseado em laboratório e sem kit de 3' código de barras do cDNA biblioteca preparação protocolo para NGS de RNAs pequeno Arquivado em espécimes FFPE, permitindo a análise simultânea de 18 amostras de22. Este protocolo fornece um procedimento passo a passo ideal e robusto com pontos de verificação visual e técnicas de avaliação, que foram fundamentais para a adaptação aos espécimes FFPE RNA, e tem um forte potencial para aplicação em outras fontes de comprometido ou difícil usar material de RNA. Aplicabilidade do protocolo original foi melhorada substituindo tamanho marcado radioactivamente marcadores fluorescentes (por exemplo, SYBR Gold) marcadores de tamanho de RNA detectáveis usados durante a seleção das bibliotecas ligadas na grande gel de poliacrilamida. Este protocolo otimizado depende a ligadura dos adaptadores de código de barras 3' para 18 amostras de RNA FFPE individuais, que são então agrupados para se submeter a 5' ligadura de adaptador, reverso-transcrição e uma análise PCR piloto para adaptados a amplificação do cDNA final biblioteca antes da amplificação do PCR em grande escala, purificação e NGS em um sequenciador de alto rendimento.

<table><tbody><tr><td>1% Triton x-100</td><td>Invitrogen</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>10mM ATP</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10X dNTPs</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>14M Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>O3445I-100</td><td></td></tr><tr><td>20 nt escada</td><td>Jena Bioscience</td><td>M-232S</td><td></td></tr><tr><td>20mg/ml Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>B8894-5ML</td><td></td></tr><tr><td>50X Titanium Taq</td><td>Clontech Laboratories</td><td>639208</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td> Sistema vertical de eletroforese em gel <td>Fisher Scientific</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>BRL com placas de vidro e pentes</td><td>GIBCO</td><td>V16</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D9170-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga Eppendorf 5424R</td><td>USA scientific</td><td>4054-4537Q</td><td></td></tr><tr><td>Eppndorf Thermomixer</td><td>USA scientific</td><td>4053-8223Q</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; Tubos de Microcentrífuga de Baixa Retenção Siliconizados 1.5ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Disjuntor de Gel 0.5 ml</td><td>IST Engineering Inc,3388-100</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Aparelho de eletroforese em gel 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT com bandejas de gel e pentes</td><td>Biorad</td><td>1704446</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Jersey-Cote</td><td>LabScientific, Inc</td><td>1188</td><td></td></tr><tr><td>KcL 2M</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 1M</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge centrífuga pessoal de rotor duplo</td><td>EUA científico</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>Modelo V16 aparelho de eletroforese em gel de poliacrilamida, óculos, pentes e espaçadores</td><td>Ciore Life Science</td><td>21070010</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos</td><td>IDT</td><td>Definidos durante o pedido</td><td></td></tr><tr><td>Owl EasyCast B2 mini sistema de eletroforese - com bandejas de gel e pentes</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Kit de extração de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restrição PmeI</td><td>NEB</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de RNase</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 transiluminador de luz azul</td><td>Thermofisher</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE agarose</td><td>Lonza</td><td>50002</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcrição reversa Superscript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 2 Truncado K227Q</td><td>NEB</td><td>0351L</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Themocycler com tampa aquecida</td><td>Applied Biosystem</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Sequagel system concentrado, diluente e tampão</td><td>National Diagnóstico</td><td>EC-833</td><td></td></tr></tbody></table>

sequenciação de microrna retrospectiva: biblioteca de dna complementar preparação protocolo usando amostras de rna de parafina fixada em formol

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

-Arquivada, clinicamente classificados fixada em formol parafina os tecidos (FFPE) podem fornecer ácidos nucleicos para retrospectivos estudos moleculares de desenvolvimento de câncer. Por meio de lesões pré-malignas ou não-invasiva de pacientes que mais tarde desenvolvem doença invasiva, análises de expressão de gene podem ajudar a identificar cedo alterações moleculares que predispõem ao risco de câncer. Tem sido bem descrito que ácidos nucleicos recuperados de tecidos FFPE sofreram graves danos físicos e modificações químicas, que dificultam a sua análise e geralmente requer ensaios adaptados. MicroRNAs (miRNAs), no entanto, que representam uma pequena classe de moléculas de RNA, abrangendo apenas até ~ 18-24 nucleotídeos, foram mostrados para suportar o armazenamento a longo prazo e foram analisadas com sucesso em amostras FFPE. Aqui apresentamos um 3' código de barras complementares DNA (cDNA) biblioteca preparação protocolo otimizado especificamente para a análise de pequenos RNAs extraído de tecidos arquivados, que recentemente foi demonstrada para ser robusto e altamente reprodutível quando usando arquivados amostras clínicas armazenadas por até 35 anos. Esta preparação da biblioteca está bem adaptada à análise do material comprometido/degradado onde amostras do RNA (até 18) são ligadas com adaptadores de código de barras individual 3' e depois agrupadas para preparações enzimáticas e bioquímicas subsequentes multiplex antes da análise. Todas purificações são executadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), que permite seleções de tamanho específico e avanços de código de barras pequenas espécies de RNA. Esta preparação de biblioteca de cDNA é bem adaptada ao minutos entradas de RNA, como um piloto cadeia da polimerase (PCR) permite a determinação de um ciclo de amplificação específica produzir quantidades ideais de material para o sequenciamento de próxima geração (NGS). Esta abordagem foi otimizada para o uso do RNA de FFPE degradadas das amostras arquivadas por até 35 anos e fornece dados NGS altamente reprodutíveis.

Conforme descrito no método aqui, um total de 18 amostras de RNA FFPE individuais (100 ng cada) são criadas em tubos separados submeter-se a 3' adenylated código de barras do oligonucleotide T4 ligadura durante a noite. No dia seguinte, as reações enzimáticas são calor-desativado, combinadas e precipitadas em um único tubo. A pelota do RNA é resuspended e as moléculas de RNA ligadas são separadas em um 15% desnaturação gel de poliacrilamida (PAGE), onde marcadores de tamanho do oligonucle...

Fixada em formol parafina espécimes representam uma fonte valiosa de biomarcadores moleculares de doenças humanas. Aqui nós apresentamos um protocolo de preparação de biblioteca de base laboratorial do cDNA, inicialmente projetado com RNA congelado fresco e otimizado para a análise de microRNAs arquivados de tecidos armazenados até 35 anos.

Sequenciação de MicroRNA retrospectiva: Biblioteca de DNA complementar preparação protocolo usando amostras de RNA de parafina fixada em formol

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

O objetivo geral desta preparação da Biblioteca CDNA é permitir o sequenciamento bem-sucedido de pequenos RNAs que foram armazenados em tecidos formais e fixados embebidos em parafina. Este método é muito útil para analisar espécimes formais e fixos embebidos em parafina. Você extrai RNA de até 18 amostras, analisa o conteúdo de todas elas e obtém um perfil de todas as microRNase para todas as amostras.Para iniciar o protocolo, adicione 8,5 microlitros de mistura mestre de ligadura previamente preparada a cada uma das 18 amostras FFPERNA individualmente alícitadas. Agite suavemente os tubos e centrifugue por dois segundos. Após a centrifugação, armazene os tubos no gelo.Use uma pipeta de três microlitros para transferir um microlitro de cada adaptador, para as amostras FFPERNA correspondentes contendo RNA e mistura mestre de ligação. Não pipete para cima e para baixo e troque as pontas entre as amostras FFPERNA. Feche cada tubo, agite-os para misturar e centrifugue-os por dois segundos.Coloque os tubos no gelo. Desnature as reações colocando os tubos em um bloco de calor a 90 graus Celsius por um minuto e, em seguida, coloque-os imediatamente no gelo. Em seguida, use uma pipeta de

retrospective-microrna-sequencing-complementary-dna-library

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Descrevemos um método baseado em sequenciamento de RNA direcionado que inclui a preparação de bibliotecas de cDNA indexadas, hibridização e captura com sondas personalizadas e análise de dados para interrogar transcritos selecionados quanto à expressão gênica, mutações e fusões gênicas. O RNAseq direcionado permite uma avaliação rápida e econômica de transcritos selecionados em um sequenciador de desktop.

Targeted RNA Sequenciação Ensaio para Caracterizar expressão gênica e genômica Alterações

Este protocolo de extracção modificado melhora RNA e DNA rendimentos provenientes de regiões mais precisamente alvo de interesse nos blocos de tecido histopatológicos.

Preparação de Núcleos de tecido parafina-encaixados formalina-fixados para RNA e DNA Extraction

Este protocolo fornece uma visão geral dos procedimentos para o isolamento do RNA para o perfil de transcriptomic do nó de linfa de tecidos de animais de grandes porte, incluindo etapas na identificação e excisão dos gânglios linfáticos do gado e animais selvagens, abordagens de amostragem para fornecer consistência em vários animais e considerações mais resultados representativos para a preservação de pós coleta e processamento para a análise do RNA.

Coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do RNA: preparando-se para estudos de linfonodo Transcriptomic de espécies de animais grandes

Este protocolo fornece aos pesquisadores uma nova ferramenta para monitorar a fidelidade da transcrição em vários organismos modelo.

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

RNAs circulares (circRNAs) são RNAs não codificadores que podem ter papéis na regulação transcricional e mediar interações entre proteínas. Após a avaliação de diferentes parâmetros para a construção de bibliotecas de sequenciamento circRNA, um protocolo foi compilado utilizando a preparação total da biblioteca de RNA com o pré-tratamento RNase R e é apresentado aqui.

Identificação de RNAs circulares usando sequenciamento de RNA

Nós apresentamos um protocolo pequeno detalhado da reparação da biblioteca do RNA com menos viés do que métodos padrão e uma sensibilidade aumentada para 2 '-O-methyl RNAs. Este protocolo pode ser seguido usando reagentes caseiros para economizar custos ou usar kits para conveniência.

Melhorando O RNA-Seq pequeno: menos polarização e melhor deteção de 2 '-O-methyl RNAs

A resistência terapêutica muitas vezes se desenvolve em pacientes com câncer de próstata avançado e, em alguns casos, o câncer progride para um subtipo letal chamado câncer de próstata neuroendócrino. Avaliar as pequenas alterações moleculares mediadas por RNA não codificadoras que facilitam essa transição permitiria uma melhor estratificação e identificação de mecanismos causais que levam ao desenvolvimento de câncer de próstata neuroendócrino.

Sequenciamento de RNA não codificador de tecidos reparados em formalina e exossomos derivados do soro de pacientes com câncer de próstata resistentes à castração

Descrevemos uma técnica para traçar perfis de microRNAs em embriões de camundongos primitivos. Este protocolo supera o desafio da baixa entrada celular e do pequeno enriquecimento do RNA. Este ensaio pode ser usado para analisar alterações na expressão miRNA ao longo do tempo em diferentes linhagens celulares do embrião do camundongo primitivo.

Preparação de Pequenas Bibliotecas de RNA para Sequenciamento de Embriões de Camundongos Primitivos

Este protocolo descreve um método para isolar RNA de regiões histológicas definidas de tecido hepático de camundongo, fixado com paraformaldeído, composto de Temperatura Ótima de Corte, utilizando microdissecação por captura a laser, permitindo análise direcionada de expressão gênica a jusante.

Microdissecação por captura a laser de tecido hepático de camundongo fixado com paraformaldeído para análise de RNA

Aqui apresentamos um protocolo para investigar a metilação do DNA do genoma ampla em grande escala estudos de triagem de pacientes clínicos utilizando o Metil-Binding tecnologia de sequenciamento de DNA Captura (MBDCap-seq ou MBD-seq) eo gasoduto análise bioinformática subsequentes.

Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Aprenda a preparar bibliotecas de cDNA para sequenciamento de microRNAs a partir de tecidos fixados em formol e emblocados em parafina. Este protocolo permite analisar até 18 amostras arquivadas por até 35 anos para descoberta de biomarcadores.

Sequenciação de MicroRNA retrospectiva: Biblioteca de DNA complementar preparação protocolo usando amostras de RNA de parafina fixada em formol (Vídeo) | JoVE Journal

Sequenciação de MicroRNA retrospectiva: Biblioteca de DNA complementar preparação protocolo usando amostras de RNA de parafina fixada em formol

Explorar mais vídeos