Method Article

ExCYT: Uma Interface gráfica do usuário para racionalizar a análise de dados de alta dimensão Cytometry

DOI:

10.3791/57473

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January 16th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Bloomberg~Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Johns Hopkins University School of Medicine, 2The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Immunology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ExCYT é um baseado em MATLAB Graphical User Interface (GUI) que permite aos usuários analisar seus dados de citometria de fluxo via comumente empregadas técnicas de análise dos dados de alta dimensão incluindo redução de dimensionalidade através de t-PND, uma variedade de automático e manual fluxo de alta dimensão romance, heatmaps e métodos de clustering parcelas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Com o advento dos citômetros capazes de medir um número crescente de parâmetros, os cientistas continuam a desenvolver painéis maiores fenotipicamente explorar as características de suas amostras celulares. No entanto, estes avanços tecnológicos rendem elevado-dimensional conjuntos de dados que se tornaram cada vez mais difíceis de analisar objetivamente dentro tradicionais manual programas associados. A fim de melhor analisar e apresentar dados, cientistas parceiro com bioinformaticians com experiência em análise de dados de alta dimensão para analisar seus dados de citometria de fluxo. Enquanto esses métodos foram mostrados para ser altamente valiosa no estudo de citometria de fluxo, eles ainda têm a ser incorporados em um pacote simples e fácil de usar para os cientistas que não possuem conhecimentos computacionais ou programação. Para atender a essa necessidade, nós desenvolvemos ExCYT, uma baseada em MATLAB Graphical User Interface (GUI) que simplifica a análise dos dados de citometria de fluxo elevado-dimensional implementando técnicas analíticas comumente empregadas para a inclusão de dados de alta dimensão redução de dimensionalidade por t-PND, uma variedade de métodos de clusterização automáticos e manuais e heatmaps novo alta dimensão fluxo de parcelas. Além disso, ExCYT fornece opções associadas tradicionais de selecionadas populações de interesse para mais t-PND e análise, bem como a capacidade de aplicar gates diretamente na t-PND parcelas de clustering. O software fornece a vantagem adicional de trabalhar com qualquer compensada ou descompensados arquivos FCS. Caso a compensação pós aquisição é necessária, o usuário pode escolher fornecer o programa, um diretório único manchas e uma amostra de imaculado. O programa detecta eventos positivos em todos os canais e usa esses dados selecionados mais objetivamente, calcular a matriz de compensação. Em resumo, ExCYT fornece um pipeline de análise abrangente para pegar dados de citometria de fluxo na forma de arquivos FCS e permitir que qualquer indivíduo, independentemente de formação computacional, para usar as últimas abordagens algorítmicas na compreensão de seus dados.

Introduction

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Avanços em citometria de fluxo, bem como o advento da citometria de massa permitiu que os médicos e cientistas para rapidamente identificar e caracterizar fenotipicamente biologicamente e clinicamente interessantes amostras com novos níveis de resolução, criando grandes conjuntos de dados altamente dimensionais que são informações ricas1,2,3. Enquanto os métodos convencionais para a análise de dados de citometria de fluxo como gating manual têm sido mais simples para experiências onde existem alguns marcadores e esses marcadores têm populações visualmente perceptíveis, esta abordagem pode falhar gerar Resultados reprodutíveis ao analisar conjuntos de dados de dimensão superior ou aqueles com marcadores em um espectro de coloração. Por exemplo, em um estudo multi-institucional, onde intra celular coloração (ICS) ensaios foram sendo realizados para avaliar a reprodutibilidade de dosar respostas de célula T de antígeno-específicas, apesar de boa precisão interlaboratorial, análise, particularmente gating, introduziu uma fonte significativa de variabilidade4. Além disso, o processo de retenção manualmente de população de interesses, além de ser altamente subjetivo é altamente consumindo tempo e mão de obra intensiva. No entanto, o problema de analisar conjuntos de dados de alta dimensão de maneira robusta, eficiente e oportuna não é um novo para as Ciências da pesquisa. Estudos de expressão do gene muitas vezes geram conjuntos de dados extremamente elevado-dimensional (muitas vezes na ordem de centenas de genes) onde formulários manuais de análise seria simplesmente inviável. Para obviar a análise desses conjuntos de dados, tem havido muito trabalho no desenvolvimento de ferramentas de bioinformatic para analisar a expressão de gene dados5. Essas abordagens algorítmicas só recentemente adoptaram-na análise dos dados de citometria como o número de parâmetros aumentou e têm provado para ser muito útil na análise destes conjuntos de dados dimensional elevada6,7.

Apesar da geração e aplicação de uma variedade de algoritmos e pacotes de software que permitem que os cientistas aplicar essas abordagens de bioinformatic alta dimensão aos seus dados de citometria de fluxo, estas técnicas analíticas ainda permanecem em grande parte não utilizadas. Embora possa haver uma variedade de fatores que têm limitado a adopção generalizada dessas abordagens para citometria dados8, o obstáculo principal suspeita no uso dessas abordagens pelos cientistas, é uma falta de conhecimento computacional. Na verdade, muitos destes pacotes de software (isto é, flowCore, flowMeans e OpenCyto) são escritos para ser implementado em linguagens de programação como R que ainda exigem conhecimento de programação substantivo. Pacotes de software, tais como FlowJo tem encontrado favor entre os cientistas, devido à simplicidade de uso e natureza 'plug-n-play', bem como a compatibilidade com o sistema operacional do PC. A fim de fornecer a variedade de técnicas analíticas aceitas e valiosas para a programação de cientista desconhecido, nós desenvolvemos ExCYT, uma interface de usuário gráfica (GUI) que pode ser facilmente instalada em um PC/Mac que puxa muitas das mais recentes técnicas incluindo a redução de dimensionalidade para visualização intuitiva, uma variedade de métodos de clusterização citado na literatura, juntamente com novos recursos para explorar a saída destes algoritmos com parcelas de fluxo/caixa alta dimensão heatmaps e romance de clustering.

ExCYT é uma interface de usuário gráfica criada em MATLAB e, portanto, pode também ser executado dentro MATLAB diretamente ou um instalador é fornecido que pode ser usado para instalar o software em qualquer PC/Mac. O software está disponível em https://github.com/sidhomj/ExCYT. Apresentamos um protocolo detalhado para saber como importar dados, pre-processá-lo, realizar redução de dimensionalidade de t-PND, dados do cluster, classificar & filtrar conjuntos com base em preferências do usuário e exibir informações sobre os clusters de interesse via heatmaps e romance fluxo/caixa alta dimensão parcelas (Figura 1). Eixos em parcelas t-PND são arbitrários e em unidades arbitrárias e como tal, como nem sempre mostrado nas figuras a simplicidade do usuário da interface. A coloração de pontos de dados no "t-PND Heatmaps" é do azul ao amarelo, com base no sinal do marcador indicado. Em soluções de cluster, a cor do ponto de dados se baseia arbitrário número de cluster. Todas as partes do fluxo de trabalho podem ser realizadas no painel único GUI (Figura 2 & tabela 1). Finalmente, vamos demonstrar o uso de ExCYT em dados publicados anteriormente, explorando a paisagem imune de carcinoma de células renais na literatura, também analisada com métodos similares. O conjunto de dados de exemplo que nós usamos para criar os números neste manuscrito juntamente com o protocolo abaixo pode ser encontrado em https://premium.cytobank.org/cytobank/projects/875, aquando do registo de uma conta.

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Protocol

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1. coletar e preparar dados Cytometry

  1. Coloca todas as manchas única em uma pasta por si mesmos e o rótulo com o nome de canal (por fluoróforo, não marcador).

2. pré-processamento & importação de dados

  1. Para pausar ou salvar em todo esse pipeline de análise, use o botão de Salvar espaço de trabalho no canto inferior esquerdo do programa para salvar o espaço de trabalho como um '. MAT' arquivo que mais tarde pode ser carregado através do botão de Carga de trabalho . Não execute mais de uma instância do programa de cada vez. Portanto, ao carregar um novo espaço de trabalho, certifique-se de verificar que não há nenhuma outra instância de ExCYT correndo.
  2. Para começar o pipeline de análise, primeiro selecione o tipo de citometria (citometria de fluxo ou citometria de massa – CYTOF), sob o número de Parâmetros de seleção de arquivo selecione de eventos a amostra do arquivo (para este exemplo uso 2.000). Uma vez que os dados foi importados com êxito, uma caixa de diálogo pop-up informando ao usuário que os dados foi importados com êxito.
  3. Pressione o botão de Autocompensação para realizar um passo opcional autocompensação, como feito por Bagwell & Adams9. Selecione o diretório contendo manchas única. Selecione a amostra imaculada dentro do diálogo de interface do usuário.
    1. Coloque um portão para a frente/lado-dispersão em qualquer das amostras neste diretório que será usado para selecionar eventos para calcular a matriz de compensação. Recomenda-se usar o exemplo imaculado para essa finalidade. Neste ponto, foi implementado um algoritmo para definir limiares consistentes noth percentil 99 da amostra imaculada para definir eventos positivos em cada uma das manchas simples para calcular a matriz de compensação. Quando isso for concluído, uma caixa de diálogo informará o usuário que foi realizada a compensação.
  4. Em seguida, pressione a População de portão e selecione as populações de células de interesse, como é a Convenção em fluxo cytometry análises. Quando a população de células é seleccionada, insira o número de porcentagem de análise a jusante de eventos (neste 10.000 eventos).
  5. Em seguida, seleccione os canais números a ser usado para análise na caixa de listagem no canto direito da caixa de pre-processamento (usar os canais específicos mostrados no exemplo).

3. análise t-PND

  1. Pressione o botão T-PND para que o programa começar iniciar para calcular o conjunto de dados de dimensão reduzida para visualização na janela abaixo do botão t-PND. Para salvar a imagem de t-PND, pressione Salvar imagem de TSNE. Em uma máquina com 8 CPU @ 3.4 GHz cada e 8 GM RAM esta etapa deve levar cerca de 2 minutos para 10.000 eventos, 10 minutos para 50.000 eventos e a 20 minutos para 100.000 eventos.
  2. Para criar um heatmap ' t-PND ', como pode ser visto em vários CYTOF publicações10,11, selecione uma opção no menu pop-up Marcador específico t-PND (use os marcadores específicos CD64 ou CD3, conforme mostrado no exemplo). Uma figura irá aparecer mostrando uma representação heatmap do enredo do t-PND que pode ser salvos para geração de figura.
  3. Selecione as áreas de interesse nas tramas t-PND pelo usuário para ainda mais a jusante análises usando o botão do Portão t-PND .

4. análise de cluster

  1. Para começar a análise de cluster, selecione uma opção no Método de Clustering listbox (no exemplo nos DBSCAN com um fator de distância de 5 no diálogo caixa à direita da caixa de listagem). Pressione o botão de Cluster .
  2. Use uma das seguintes opções para algoritmos de clusters automatizados encontrados no painel 'Parâmetros automatizada de Clustering':
    1. KMEANS difícil (no t-PND): aplique k-meios de cluster para os dados de 2-dimensional reduzido t-PND e requer o número de clusters deve ser fornecido para o algoritmo de12.
    2. KMEANS duro (em dados de HD): uso de k-meios de clustering para dados de alta dimensão originais que foi dado ao algoritmo t-PND. Mais uma vez, o número de clusters deve ser fornecido para o algoritmo.
    3. DBSCAN: Aplicar o método de cluster do cluster, chamado baseado em densidade Spatial Clustering de aplicações com ruído13 que clusters de dados 2-dimensional reduzido t-PND e requer um fator de distância não-dimensional que determina o tamanho geral do aglomerados. Este tipo de algoritmo de clustering é bem adequado para cluster a redução de t-PND como é capaz de cluster não-esferoidal de cluster que estão frequentemente presentes na representação reduzida t-PND. Além disso, devido ao fato de que ele opera sobre os dados 2-dimensional, é um dos algoritmos mais rápido clusters.
    4. De Clustering hierárquico: Aplica o método convencional de cluster hierárquico para os dados de alta dimensão, onde a matriz de toda distância euclidiana é calculada entre todos os eventos antes de fornecer o algoritmo de um fator de distância que define o tamanho do cluster.
    5. Gráfico de rede- Com base: Aplica um método de cluster que foi mais recentemente introduzido analisando dados de citometria de fluxo quando há subpopulações raras que o usuário deseja detectar11,14. Este método baseia-se na primeira, criando um gráfico que determina as conexões entre todos os eventos nos dados. Esta etapa consiste em fornecer um parâmetro inicial para criar o gráfico, que é o número de vizinhos k-a mais próxima. Este parâmetro geralmente rege o tamanho dos clusters. Neste ponto, a outra caixa de diálogo aparece perguntando ao usuário empregar um dos 5 algoritmos de clustering que é aplicado para o gráfico. Estes incluem 3 opções para maximizar a modularidade de gráfico, o método de Dan e um espectrais clusterização algoritmo14,15,16,17,18. Se alguém quiser uma solução de cluster geralmente mais rápido, recomendamos espectrais clusterização ou a maximização de modularidade rápido ganancioso. Enquanto os métodos de maximização de modularidade juntamente com o método de Dan em determinam o número ideal de clusters, Spectral Clustering requer o número de clusters para ser dado ao programa.
    6. Auto organizada mapa: Emprega uma rede neural artificial para os dados de alta dimensão do cluster.
    7. GMM-maximização de expectativa: criar um modelo de mistura gaussiano usando técnica de maximização de expectativa (me) para cluster de dados de alta dimensão. 19 este tipo de método de cluster também exige que o usuário inserir o número de clusters.
    8. Variacional inferência Bayesiana para GMM: criar um modelo de mistura gaussiano, mas ao contrário de EM, ele automaticamente pode determinar o número da mistura componentes k.20 enquanto o programa requer um número de clusters para ser dada (maior do que o esperado o número de clusters), o algoritmo irá determinar o número ideal por conta própria.
  3. Para estudar uma área específica da trama t-PND, pressione o botão Selecionar manualmente Cluster desenhar um conjunto de clusters definidos pelo usuário. Digno de nota, clusters não podem compartilhar Membros (ou seja, cada evento só pode pertencer a 1 cluster).

5. cluster filtração

  1. O grupo de clusters identificados ou manualmente ou através de um dos métodos automáticos descritos acima pode ser filtrar através da seguinte maneira.
    1. Para classificar os clusters (no painel Filtro de Cluster ) por qualquer um dos marcadores medidos no experimento, selecione uma opção no menu pop-up tipo . Para definir se a ordem é crescente ou decrescente, pressione no botão à direita do menu pop-up tipo Crescente/decrescente . Isto será atualizar a lista de Clusters na listbox 'Clusters (filtração)' e re-encomendá-los em ordem decrescente de expressão mediana aglomerado de marcador. O percentual indicado na listbox 'Clusters (filtração)' denota a porcentagem da população que representa este aglomerado.
    2. Para definir um valor de limiar mínimo para um determinado cluster através de um canal, selecione uma opção no menu pop-up limiar (neste exemplo nós o marcador CD65 e defina um limite na 0,75). Ou digite um valor na caixa numérica abaixo do gráfico ou usar a barra deslizante para definir um limite. Uma vez que o limite é definido, pressione Adicionar acima limite ou Adicionar abaixo de limiar para especificar a direção do limiar. Uma vez que esse limite foi definido, ela será listada na caixa de limiares, junto ao painel da 'Filtro de Cluster', onde o marcador, o valor de limiar e a direção serão listados para que o usuário está ciente de quais limites atualmente estão sendo aplicados. Finalmente, a trama de t-PND atualizará desfocando fora clusters que não satisfazem os requisitos da filtragem e listbox 'Clusters (filtração)' será atualizada para mostrar os clusters que cumprir as exigências de filtração.
    3. Para definir um limite mínimo para a frequência de um cluster, digite um limite numérico no Limiar de frequência de Cluster (%) caixa no painel Filtro de Cluster (no presente exemplo uso 1%).

6. cluster Analysis & visualização

  1. Para selecionar conjuntos para análise e visualização, selecione aglomerados no listbox de Clusters (filtração) e pressione o botão de à selecione para movê-los para o listbox Cluster analisar .
  2. Para criar heatmaps de clusters, selecionar grupos de interesse na Análise de Cluster listbox e pressione o botão HeatMap de Clusters . Quando este botão é pressionado, uma figura pop-up contendo um mapa de calor juntamente com dendrograms nos eixos cluster e parâmetro. A dendrograma no eixo vertical agrupará aglomerados por aqueles que estão intimamente relacionados ao mesmo tempo a dendrograma na horizontal eixo agrupará marcadores que estão co associados. Para salvar o heatmap, pressione arquivo | Configuração de exportação | Exportação.
  3. Para criar uma 'Parcela alta de caixa Dimensional' ou 'Alta Dimensional Flow plotagem', selecione os clusters turísticos na listbox Cluster analisar e pressione o botão de Plotagem de caixa Dimensional elevada ou o botão Alta Dimensional Flow plotar . Estes gráficos podem ser usados para avaliar visualmente a distribuição de canais de vários clusters tendo em conta todas as dimensões.
  4. Para mostrar aglomerados em parcelas de fluxo 2D tradicional, selecione a transformação (linear, log10, arcsinh) e canal no painel de Plotagem de fluxo convencional e imprensa parcela de fluxo convencional.

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Results

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A fim de testar a usabilidade de ExCYT, analisamos um conjunto de dados com curadoria, publicado por Chevrier et al . intitulada 'An imune Atlas de claro Cell Carcinoma Renal' onde o grupo realizou análises de CyTOF com um extenso painel imune em tumor amostras colhidas de 73 pacientes de11. Dois painéis separados, um painel de mieloide e linfoide, foram usados para caracterizar fenotipicamente o microambiente do tumor. O objetivo do nosso estudo foi recap...

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Discussion

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Aqui nós apresentamos ExCYT, interface gráfica do usuário do romance executando algoritmos baseados em MATLAB para simplificar a análise de dados de alta dimensão citometria, permitindo que os indivíduos com nenhuma experiência em programação para implementar o mais recente de dados de alta dimensão algoritmos de análise. A disponibilidade deste software para a comunidade científica mais ampla permitirá que os cientistas explorar seus dados de citometria de fluxo em um fluxo de trabalho intuitivo e simples. Através da re...

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

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Os autores têm sem agradecimentos.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Computador de mesaSuperMicroCustom Buildusado para executar análises
MATLABMathworksN/ASoftware usado para desenvolver o ExCYT

References

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