Artigo de método

Ablação de uma população Neuronal, usando um Laser de dois fotões e sua avaliação usando imagens de cálcio e gravação comportamental em larvas de Zebrafish

DOI:

10.3791/57485

⸱

2 de junho de 2018

 , 
1Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, Department of Genetics, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies)

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para ablate uma subpopulação geneticamente rotulada de neurônios por um laser de dois fotões de larvas de peixe-zebra.

Resumo

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Para identificar o papel de uma subpopulação de neurônios no comportamento, é essencial para testar as consequências do bloqueio de sua atividade em animais vivos. Remoção a laser de neurônios é um método eficaz para essa finalidade quando os neurônios são etiquetados seletivamente com sondas fluorescentes. No presente estudo, são descritos os protocolos para laser retirando uma subpopulação de neurônios usando um microscópio de dois fotões e testes de suas consequências funcionais e comportamentais. Neste estudo, o comportamento de captura de presas em larvas de zebrafish é usado como um modelo de estudo. O circuito pretecto-hipotalâmico é conhecido por fundamentam esta presa visualmente orientado, captura o comportamento. Zebrafish pretectum foram retirado de laser, e atividade neuronal no lobo inferior do hipotálamo (ilha; o alvo da projeção pretectal) foi examinada. Comportamento de captura de presas após ablação pretectal também foi testado.

Introdução

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Para entender como o comportamento surge da atividade neuronal no cérebro, é necessário identificar os circuitos neurais envolvidos na geração desse comportamento. Na fase larval, o zebrafish fornece um modelo animal ideal para estudar a função do cérebro associada com o comportamento porque seus cérebros pequenos, transparentes tornam possível investigar a atividade neuronal em uma resolução de celular em uma ampla área da cérebro enquanto observa o comportamento1. Imagem de atividade neuronal em neurônios específicos tornou-se possível graças a invenção dos indicadores geneticamente codificado cálcio (Ca) (GECIs), tais como GCaMP2. GCaMP zebrafish transgênico tem provado para ser útil para associar o circuito neural funcional com comportamento através da realização de imagem Ca em comportar-se de animais3.

Enquanto a imagem de Ca pode demonstrar correlações entre a atividade neuronal e comportamento, para mostrar a causalidade, supressão da atividade neuronal e testar sua consequence(s) sobre o comportamento são passos importantes. Existem várias maneiras de conseguir isso: uso de mutação genética que altera os circuitos neurais específicos4, expressão de neurotoxinas em neurônios específicos5,6, uso de ferramentas de optogenetic como halorhodopsin7, e do laser ablação de neurônios alvo8,9. Ablação a laser é particularmente adequada para eliminar a atividade em um número relativamente pequeno de neurônios específicos. Facilita a eliminação irreversível da atividade neuronal, matando os neurônios avaliar consequências comportamentais.

Um comportamento interessante que pode ser observado na fase larval no zebrafish é a captura de presas (Figura 1A). Esse comportamento visualmente guiadas, objetivo-dirigido fornece um sistema experimental favorável para o estudo da acuidade visual10, transformação visuomotoras11,12,13, percepção visual e reconhecimento de objetos14,15,16,17,18e tomada de decisão19. Como presa é reconhecida por predadores e como a deteção da rapina leva a presa captura o comportamento tem sido uma questão central na neuroetologia20. Neste artigo, enfocamos o papel do circuito pretecto-hipotalâmico formado por projeções de um núcleo no pretectum (núcleo pretectalis superficial pars magnocellularis, daqui por diante, conhecido simplesmente como o pretectum) para a ilha. Ablação a laser do pretectum foi mostrado para reduzir a atividade de captura de presas e abolir a atividade neuronal na ilha que está associada com o de percepção visual presa21. Aqui, os protocolos para a realização de laser ablação e teste seu efeito usando imagens de Ca2 + e gravação comportamental no zebrafish larvas são descritas.

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Protocolo

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1. ablação de uma subpopulação de neurônios usando um microscópio de dois fotões Laser

Nota: Se os usuários planejam realizar ablação seguinte imagem de Ca, use o UAShspzGCaMP6s linha21. Se os usuários planejam realizar gravação comportamental após ablação, use a linha de UAS:EGFP, como a ablação das células EGFP-positivo é mais fácil de realizar do que de células GCaMP6s-expressando.

  1. Começar por preparar o acasalamento de uma linha de Gal4 que rotula neurônios específicos a ser estudado e UAS:EGFP ou UAShspzGCaMP6s. Não se esqueça de usar o fundo de nácar para ambos os pais, para que o nácar homozigotos podem ser obtidos.
    Nota: Homozigotos de nácar não contenham nenhum melanóforos na superfície do corpo (Figura 1B). No presente estudo, uma gSAIzGFFM119B de linha de Gal4 (que rotula o pretectum) e outro Gal4 linha hspGFFDMC76A (que rotula a ilha) são usados21.
  2. No dia seguinte da instalação do acasalamento, recolher os ovos de peixe-zebra e criá-los para a fase larval, no ponto em que os neurônios de interesse irão expressar repórteres fluorescentes.
  3. Monte a larva de zebrafish em 2% baixo ponto de fusão-agarose (Figura 1B).
    1. Comece por preparar a solução de agarose 2%: dissolver 2 g de pó de baixo ponto de fusão de agarose em 100 mL de água do sistema (ou seja, a água usada para manter o zebrafish adulto em um sistema de água circulante)22 ou E3 água23, trazendo a água para o ponto em um microondas de ebulição e misturar vigorosamente.
    2. O estoque de baixo ponto de fusão de agarose 2% no microondas até ferver. Despeje o 3,5-4,0 mL do agarose para a tampa de um prato de Petri de 6 cm. Espere até que a agarose esfria para que está quente ao toque antes de prosseguir.
    3. Em seguida, coloque uma única larva (não anestesiada nesta etapa) no agarose. Manter a posição e orientação da larva de ajuste para que fique na posição vertical, usando uma agulha de dissecação (Figura 1C), até que a agarose solidifica para assegurar o correcto posicionamento da larva.
      Nota: A larva vai continuar a nadar ao redor enquanto se solidifica a agarose.
    4. Uma vez que a larva é posicionada, permita 5 min para o agarose solidificar completamente.
    5. Verta o agarose, 5 mL de solução metanosulfonato (0,4% a 1 x concentração de trabalho).
      Nota: Para evitar movimentos por larvas durante ablação a laser, as larvas devem ser mantidas anestesiadas durante todo o procedimento de ablação.
  4. Ablação a larva usando a função clareador em um sistema de microscopia de dois fotões laser.
    1. Coloque a larva de agarose-incorporado sob um microscópio de exploração do laser de dois fotões e iniciar o sistema de microscopia.
    2. Inicie o software de aquisição de imagem e clique no botão "On" na guia "Laser" para ligar o laser (Figura 1D). Esperar que o "Status" do laser para mudar de "Ocupado" para "Modo bloqueado".
    3. Na guia "Canais", definir o comprimento de onda do laser em 880 nm (potência máxima: aproximadamente 2.300 mW) para ablação de EGFP, ou a 800 nm (potência máxima: aproximadamente 2.600 mW) para ablação de GCaMP.
    4. Selecione o X 20 da lente objetiva movendo manualmente o revólver de lente. Clique na guia "Localizar", clique em "GFP" para alterar as vias ópticas e olhar diretamente a fluorescência pelo olho.
    5. Localize o cérebro de zebrafish larval no centro da vista; Clique na guia "Aquisição" de voltar para a microscopia de dois fotões.
    6. Como um registro da condição 'antes de ablação', pegue uma imagem de z-pilha com o 20 X da lente objetiva a digitalização-velocidade (para evitar dano de calor). Depois compare as imagens tomadas antes e depois de experiências de ablação(Figura 2). Para obter um z-pilha, clique em "Z-pilha" para selecionar a opção z-pilha e expandir o Tab. definir o limite inferior (clique em "Definir primeiramente" botão") após a focagem do lado ventral do cérebro larval e definir o limite superior (clique no botão"Set Last") após enfocando a a maioria-superfície dorsal do cérebro. Em seguida, clique no botão "Iniciar o experimento" para executar a aquisição de imagens de z-pilha.
    7. Selecione o X 63 da lente objetiva movendo manualmente o revólver de lente.
    8. Clique na guia "Localizar" para alternar para a microscopia epi-fluorescente, localize as células para ser retirado no centro de vista a olho nu e, em seguida, clique na guia "Aquisição" voltar para microscopia de varredura a laser.
  5. Na guia "Modo de aquisição", defina o "tamanho do quadro" a 256 x 256. Clique em "Live" e observar os neurônios de interesse.
  6. A partir do lado dorsal mais, encontre um plano focal na qual as células para ser retirado estão em foco.
  7. Marca uma pequena área circular tamanho de cerca de um terço da célula de diâmetro em cada neurônio como uma região de interesse (ROI) usando a função de "Regiões".
  8. Defina a velocidade de varredura para 13.93 s/256 x 256 pixels (134.42 µm x 134.42 µm), que corresponde a um tempo de interrupção do laser de aproximadamente 200 µs/pixel, ou 200 µs/0.5 µm. Também, definir 4 repetições (' ciclo de iteração: 4'). Alternativamente, otimize o número de iterações e velocidade de digitalização para que suficiente ablação é alcançada.
  9. Execute a função de 'Branqueamento' para ablação, em combinação com a 'série temporal (2 ciclos)' para a amostra (antes e depois da ablação) e «Regiões» (para definir o ROIs) ou funções equivalentes no software utilizado (Figura 1D) de imagem.
  10. Comparando-se a primeira imagem (antes da ablação) e a segunda imagem (após ablação) da série de tempo ciclo, certifique-se que após o clareamento, a fluorescência nas diminuições de células alvo às observadas no nível do plano de fundo (Figura 2B).
  11. Se a fluorescência está ainda presente após ablação, aumente o número de iterações.
  12. Em seguida, mova o plano focal ligeiramente mais profundo (isto é, para o lado ventral) e escolha o próximo plano focal onde aparecem células un-ablated.
  13. Execute a função de branqueamento como descrito acima (passo 1,9). Repita estes passos até que todas as células na estrutura neural de interesse tem sido retiradas.
  14. Depois de passar por todos os planos focais cobrindo as estruturas neurais para ser retirado, verificar as células para fluorescência abolida. Se algumas células encontram-se ainda ser fluorescentes devido à insuficiente ablação, laser-irradiá-los novamente como descrito acima.
  15. Se a larva precisa ser recuperado de agarose após a irradiação do laser, não tente forçá-lo fora o agarose, porque isso pode danificar a larva. Em vez disso, cuidadosamente fazer pequenos cortes no agarose em torno da larva perpendicularmente à superfície do seu corpo. Em seguida, aguarde a larva a nadar fora de agarose por conta própria, quando o efeito da anestesia.
  16. Prossiga para a próxima larva para ablação ou realizar experimentos de controle usando outra população de neurônios que são não envolvido no comportamento sob investigação.
    Nota: Aqui, como um controle, os neurônios do bulbo olfatório em UAS:EGFP; larvas de gSAIzGFFM119B foram do laser-retirado usando o mesmo protocolo descrito acima (Figura 2A, direito).
  17. Permita várias horas ou 1 dia para recuperação, antes de prosseguir para Ca imagem latente (secção 2) ou gravação comportamental (secção 3). Durante este tempo de recuperação, verificar a saúde larval (ou seja, natação espontânea normal, sem aparente dano de calor em torno da área retirada, etc.) e remover as larvas mostrar sinais de problemas de saúde.

2. cálcio Imaging para gravar atividade Neuronal presa-evocada em larvas Zebrafish Pretectum-retirado

  1. Para preparar uma câmara de gravação, colocar uma junta de câmara de hibridação secure-selo sobre uma lâmina de vidro, com o lado adesivo no vidro e remova o selo de top.
    Nota: Isso cria uma câmara pequena gravação que é 9 mm de diâmetro e 0,8 mm de profundidade (Figura 3A).
  2. Em seguida, coloque uma malha de nylon (tamanho da abertura: 32 µm) em um tubo de 50 mL que tem o fundo aberto. Use a tampa para anexar a malha no tubo (Figura 3B).
  3. Prepare os paramécios (que é a presa para ser usado como o estímulo visual para larva).
    Nota: Preparar a cultura de Paramecium (etapas 2.3.1 e 2.3.2) previamente.
    1. Obter cultura de protozoários semente de fontes comerciais ou de centros acadêmicos de bio-recursos24 antecipadamente.
    2. Cultura o paramécio por vários dias em água contendo palha de arroz esterilizada e uma pastilha de levedura de cerveja seca22 (Figura 3C).
    3. Despeje a paramécio cultura por 2 crivos sucessivamente (um com uma abertura de 150 µm, seguida por outra com uma abertura de 75 µm) para remover restos de cultura.
    4. Colete paramécios na passagem da etapa anterior em uma malha de nylon (abertura 13-µm).
    5. Ressuspender o paramécios sobre a malha de nylon para um copo de vidro usando uma garrafa de água do sistema (Figura 3-D).
  4. Enxágue a malha (Figura 3B) no sistema de água de 2 x (Figura 3E).
    Nota: A finalidade desta etapa é remover qualquer possível odorantes e tastants contidos em meio de cultura de paramecium , como o objetivo do presente estudo é observar visualmente orientada a atividade neuronal.
  5. Coloque uma larva de zebrafish na solução tricaina para anestesiar.
  6. Monte uma única larva em 2% baixo ponto de fusão do agarose.
    1. Em primeiro lugar, 2% baixo ponto de fusão do agarose no microondas e adicionar volume 1/10 de 10 x concentrada tricaina para o agarose.
    2. Coloque uma gota da agarose contendo tricaina câmara de gravação(Figura 3).
    3. Depois de confirmar a agarose não está muito quente, coloque a larva anestesiada (da etapa 2.5) em agarose, remover imediatamente qualquer excesso agarose para que a superfície da agarose parece ligeiramente convexa.
    4. Rapidamente, Oriente a larva em uma posição vertical com uma agulha de dissecação (Figura 1C).
      Nota: Estes procedimentos devem ser concluídos dentro de alguns segundos antes da agarose solidifica.
    5. Quando a larva está corretamente posicionada, permita 5 min para o agarose solidificar completamente. Em seguida, despeje uma gota de solução de x tricaine 1 no agarose.
  7. Remover o agarose em torno da cabeça da larva zebrafish e abrir espaço para o paramécio nadar usando uma faca cirúrgica. Para fazer isso, primeiro, fazer alguns cortes pequenos no agarose (Figura 3F). Em seguida, remova cuidadosamente o excesso agarose deitando suavemente sistema de água na câmara.
    Nota: Neste passo, a tricaina será lavada para fora.
  8. Em seguida, colocar um paramécio na câmara de gravação para servir como um estímulo visual.
    Nota: Quando o paramécio nada perto da cabeça da larva zebrafish, ele evocará uma resposta neuronal (Figura 3G).
  9. Lugar da câmara de gravação sob um microscópio de fluorescência-epi equipado com uma câmera CMOS científica (Figura 3-H) e selecione um 2.5 X da lente objetiva (Figura 3eu).
  10. Colete as gravações de lapso de tempo dos sinais de fluorescência de GCaMP.
    1. Inicie o aplicativo de aquisição de imagem para a câmera equipada.
    2. Clique em "Painel de sequência" e selecione "Gravar disco" no painel. Na seção Configurações de digitalização, defina a "contagem de Frame" para 900 ou qualquer outro número de quadro total desejado.
      Nota: Se estiver disponível, use o software de gravação de lapso de tempo com um módulo (aqui, "disco rígido gravar") que permite a gravação eficiente dos dados para um disco rígido.
    3. No painel de "Captura", defina o tempo de exposição em 30-ms (ou seja, 33,3 fps) e Binning 2 x 2.
    4. No microscópio controlando painel de toque, escolha um filtro definido para as boas práticas agrícolas, como o GCaMP tem semelhante espectros de excitação/emissão de GFP.
    5. Clique em "Live" no painel de captura para localizar a larva na visualização da câmera e foco (Figura 4A) e em seguida clique em "Parar de viver" e clique no botão "Iniciar". Salve o filme em .cxd ou qualquer outro formato que contém informações sobre a condição de aquisição.
  11. Após as gravações, analise os sinais fluorescentes GCaMP6s (sinais de Ca), obtendo valores de pixel média para o ROI definida em uma estrutura cerebral no filme lapso de tempo usando o software livre Fiji25.
    Nota: Fiji é uma versão do ImageJ com muitos útil plug-in está pré-instalado e pode ler arquivos de imagem de formato .cxd com os Bio-formatos plug-in.
  12. Se a larva move-se ligeiramente durante a gravação, realize registro de imagem executando o plug-in TurboReg26 em Fiji. No menu, selecione 'Plugins', 'Registo' e 'TurboReg'.
  13. Considere como analisar os dados de acordo com o objetivo do estudo. A seguir é um exemplo.
    1. Calcule o F/F0 (intensidade de fluorescência em cada momento, dividida pela intensidade da fluorescência em repouso, ou antes de qualquer transeunte Ca ocorreu) como segue:
    2. ROIs ateou o pretectum ou a ilha, usando o Gerenciador de ROI: no menu, selecione "Analisar," "Ferramentas", "Gerente de ROI" e "Add" à lista do ROIs(Figura 4).
    3. Calcular os valores de pixel média para o ROIs (IE., intensidades de fluorescência de GCaMP6s), selecionando o painel ROI Manager: "Mais" "Multi medida" e "Okey". Salve os resultados como um arquivo de planilha.
    4. Como os sinais são barulhentos, média os sinais para 11-pontos de tempo (média móvel) usando um aplicativo que pode lidar com dados de planilha.
    5. Dividir F (intensidades de fluorescência ao longo do tempo) por F0 (intensidade de fluorescência a nível basal) para calcular a intensidade de fluorescência normalizados. Como um exemplo de visualização de dados, alterações na intensidade de fluorescência GCaMP6s normalizada no pretectum e a ilha são codificados por cores e mapeados em trajetórias o paramécio (Figura 4B - D).

3. avaliação de consequências comportamentais após ablação a Laser

  1. Criar um sistema de gravação comportamental que consiste de um estereoscópio equipado com uma câmera de vídeo. Use uma câmera com um imagem adequada aquisição software, comercial ou sob medido (Figura 5A).
  2. Otimize a condição de iluminação para que o paramécio pode ser detectado por processamento de imagem. Por exemplo, use um anel branco diodo emissor de luz com um espaçador (Figura 5B).
    Nota: A distância e o ângulo, o LED afeta a aparência da amostra (isto é, brilhante no fundo escuro ou escuro no fundo brilhante) e são, portanto, fundamental para o processamento de imagem de sucesso. Determine a melhor altura do espaçador (Figura 5-C).
  3. Coloque uma larva de peixe-zebra (recuperada do experimento de ablação a laser descrito na secção 1) em uma câmara de gravação comportamental (que foi anexada a um slide de vidro) com o selo top original removido (Figura 5-D).
  4. Coletar 50 paramécios da cultura (etapa 2.3.5) utilizando uma micropipeta e colocá-los na câmara de gravação.
  5. Coloque uma lamela em cima da câmara de gravação. Colocar uma pequena gota de água sobre o deslizamento da tampa antes de colocar sobre a superfície da água da câmara para evitar a introdução de ar na câmara de gravação.
    Nota: Nesta etapa, um pouco de água com paramécios transbordará da câmara de gravação. O número de protozoários na câmara de gravação será aproximadamente 30-40.
  6. Coloque a câmara de gravação (que contém uma larva e protozoários) no sistema de iluminação (Figura 5-D).
  7. Inicie a gravação de lapso de tempo em 10 fps para 11 min (6.600 frames).
  8. (Opcional) Para cada larva que foi testado por comportamento, observar a fluorescência das áreas do laser-retirado por microscopia fluorescente para confirmar a eficácia da-ablação a laser (ou seja, ausência ou significativamente reduzidas fluorescentes, números de células em a área do laser irradiados).
    Nota: Mesmo após a irradiação, algumas células fluorescentes ainda podem ser observadas devido à posterior início Gal4 da expressão do gene em células diferenciadas após ablação27.
  9. Depois de gravar o comportamento da larva, para compensar a falta de uniformidade em segundo plano, realizar uma divisão de pixel por pixel de cada quadro por uma imagem média em Fiji: clique em 'Processo', 'Calculadora de imagem', ' operação: dividir ', 32-bit resultado (float)', e ' Okey '. Para tornar uma imagem média, clique em 'Imagem', 'Pilhas', 'Z-projeto', 'Intensidade média' e 'Okey' (Figura 5E, F).
  10. Contagem do número de protozoários deixou na câmara clicando 'Analisar', 'Analisar partículas', definir um intervalo de área que cobre todos os paramécios, verificando a caixa de seleção 'Mostrar: máscaras' e clicando em 'Okey'. A opção 'Show: máscaras' irá fornecer uma imagem extraída paramécios (Figura 5G), com uma lista do número de partículas (paramécios) em cada quadro.
  11. Plotar o número de protozoários esquerda na câmara de gravação ao longo do tempo. Porque as estimativas do número de protozoários são barulhentas, recomendamos executar uma média móvel em cada ponto em um intervalo de 600 frames (1 min) na planilha.

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Resultados

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Os neurônios específicos foram geneticamente rotulados com EGFP ou GCaMP6s, cuja expressão foram expulsos em linhas Gal4. Um gSAIzGFFM119B de linha de Gal4 foi usado para rotular um núcleo na área pretectal (núcleo pretectal superficial de magnocelular) e uma subpopulação de neurônios do bulbo olfatório. Outra linha de Gal4, hspGFFDMC76A, era usada para rotular a ilha. Nós do laser-retirado os neurônios pretectal bilateralmente (Figura 2 pain...

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Discussão

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Embora os dois fotões do laser tem uma excelente resolução espacial para ablate especificamente neurônios individuais, cautela deve ser tomada para evitar danos indesejáveis no tecido do cérebro devido ao calor. O passo mais importante no experimento de ablação é determinar a quantidade ideal de irradiação do laser. Irradiação de insuficiente não consegue matar os neurônios. Muita irradiação será calor-danos no tecido circundante, o que irá resultar em efeitos indesejáveis. A gama óptima de irradiação do laser (áreas do ...

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Divulgações

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Os autores têm sem conflitos de interesse para o relatório.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estes estudos foram financiados por subvenções recebidas do MEXT, JSPS KAKENHI Grant números JP25290009, JP25650120, JP17K07494 e JP17H05984.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
NuSieve GTG AgaroseLonzaCat.#50080de Petri
agarose de 6 cmde fusão FALCONProduto#:351007
agulha de dissecaçãoAS ONE CorporationCat. No. 2-013-01https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MPCarl Zeissde varredura a laser de dois fótons
W Plan-Apochromat 63x/1.0Carl Zeiss63X lente objetiva
Imager.Z1Carl Zeissum microscópio de epifluorescência
ZENCarl ZeissSoftware de aquisição de imagem para microscópios confocais
Junta da Câmara de Hibridização Secure-Seal, 8 câmaras, 9 mm de diâmetro x 0,8 mm de profundidadeSondasMoleculares Catálogo # S-24732Usado como câmara de gravação em câmaras de imagem Ca
Grace Bio-LabsCoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5Usado como uma faca cirúrgica de câmara de gravação comportamental
MANIFaca oftálmica MST15
ORCA-Flash4.0Modelo de Hamamatsu Photonics: C11440-22CUuma câmera científica
HCImageHamamatsu Photonicssoftware de acuisition de imagem
Módulo de gravação de disco rígidoHamamatsu PhotonicsUm módulo de software que permite salvar os arquivos de filme em uma unidade de disco rígido em um curto espaço de tempo
SZX7Olympusestereoscópio
DF PL 0.5XOlympuslente objetiva para SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 VisioFLIR Systems, Inc.Nº do produto GS3-U3-41C6NIR-CCMOS
câmera XIMEA xiQ câmeraXIMEA Nºdo produto MQ042RG-CMCMOS câmera
com anel LED luzCCS Modelo: LDR2-100SW2-LAMalha de nylon LED
32µ mTokyo ScreenN-No.380Thttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Malha de nylon 13µ mTokyo ScreenN-No. 508T-Khttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Metal seive 150 mícrons de aberturaTokyo Screenhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metal seive 75 mícrons de aberturaTokyo Screenhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOSAsahi Food & Saúde, Co. Ltd.fermento de cerveja seco
LabVIEWNational Instrumentsum ambiente de desenvolvimento integrado para programação
Mai-Tai HPSpectra Physics laser de dois fótons 
placa de de baixa temperatura microscópio branca

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  12. Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86(2013).
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