Ablação de uma população Neuronal, usando um Laser de dois fotões e sua avaliação usando imagens de cálcio e gravação comportamental em larvas de Zebrafish

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para ablate uma subpopulação geneticamente rotulada de neurônios por um laser de dois fotões de larvas de peixe-zebra.

Resumo

Para identificar o papel de uma subpopulação de neurônios no comportamento, é essencial para testar as consequências do bloqueio de sua atividade em animais vivos. Remoção a laser de neurônios é um método eficaz para essa finalidade quando os neurônios são etiquetados seletivamente com sondas fluorescentes. No presente estudo, são descritos os protocolos para laser retirando uma subpopulação de neurônios usando um microscópio de dois fotões e testes de suas consequências funcionais e comportamentais. Neste estudo, o comportamento de captura de presas em larvas de zebrafish é usado como um modelo de estudo. O circuito pretecto-hipotalâmico é conhecido por fundamentam esta presa visualmente orientado, captura o comportamento. Zebrafish pretectum foram retirado de laser, e atividade neuronal no lobo inferior do hipotálamo (ilha; o alvo da projeção pretectal) foi examinada. Comportamento de captura de presas após ablação pretectal também foi testado.

Introdução

Para entender como o comportamento surge da atividade neuronal no cérebro, é necessário identificar os circuitos neurais envolvidos na geração desse comportamento. Na fase larval, o zebrafish fornece um modelo animal ideal para estudar a função do cérebro associada com o comportamento porque seus cérebros pequenos, transparentes tornam possível investigar a atividade neuronal em uma resolução de celular em uma ampla área da cérebro enquanto observa o comportamento¹. Imagem de atividade neuronal em neurônios específicos tornou-se possível graças a invenção dos indicadores geneticamente codificado cálcio (Ca) (GECIs), tais como GCaMP

Protocolo

1. ablação de uma subpopulação de neurônios usando um microscópio de dois fotões Laser

Nota: Se os usuários planejam realizar ablação seguinte imagem de Ca, use o UAShspzGCaMP6s linha²¹. Se os usuários planejam realizar gravação comportamental após ablação, use a linha de UAS:EGFP, como a ablação das células EGFP-positivo é mais fácil de realizar do que de células GCaMP6s-expressando.

1. Começar por preparar o acasalamento de uma linha de Gal4 que rotula neurônios específicos a ser estudado e UAS:EGFP ou UAShspzGCaMP6s. Não se esqueça de usar o fundo de nácar para ambos os pais, para ....

Resultados

Os neurônios específicos foram geneticamente rotulados com EGFP ou GCaMP6s, cuja expressão foram expulsos em linhas Gal4. Um gSAIzGFFM119B de linha de Gal4 foi usado para rotular um núcleo na área pretectal (núcleo pretectal superficial de magnocelular) e uma subpopulação de neurônios do bulbo olfatório. Outra linha de Gal4, hspGFFDMC76A, era usada para rotular a ilha. Nós do laser-retirado os neurônios pretectal bilateralmente (Figura 2 pain.......

Discussão

Embora os dois fotões do laser tem uma excelente resolução espacial para ablate especificamente neurônios individuais, cautela deve ser tomada para evitar danos indesejáveis no tecido do cérebro devido ao calor. O passo mais importante no experimento de ablação é determinar a quantidade ideal de irradiação do laser. Irradiação de insuficiente não consegue matar os neurônios. Muita irradiação será calor-danos no tecido circundante, o que irá resultar em efeitos indesejáveis. A gama óptima de irradiação do laser (áreas do .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NuSieve GTG Agarose	Lonza	Cat.#50080	de Petri
agarose de 6 cm	de fusão FALCON	Produto#:351007
agulha de dissecação	AS ONE Corporation	Cat. No. 2-013-01	https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MP	Carl Zeiss		de varredura a laser de dois fótons
W Plan-Apochromat 63x/1.0	Carl Zeiss		63X lente objetiva
Imager.Z1	Carl Zeiss		um microscópio de epifluorescência
ZEN	Carl Zeiss		Software de aquisição de imagem para microscópios confocais
Junta da Câmara de Hibridização Secure-Seal, 8 câmaras, 9 mm de diâmetro x 0,8 mm de profundidade	Sondas	Moleculares Catálogo # S-24732	Usado como câmara de gravação em câmaras de imagem Ca
	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5	Usado como uma faca cirúrgica de câmara de gravação comportamental
	MANI	Faca oftálmica MST15
ORCA-Flash4.0	Modelo de Hamamatsu Photonics	: C11440-22CU	uma câmera científica
HCImage	Hamamatsu Photonics		software de acuisition de imagem
Módulo de gravação de disco rígido	Hamamatsu Photonics		Um módulo de software que permite salvar os arquivos de filme em uma unidade de disco rígido em um curto espaço de tempo
SZX7	Olympus		estereoscópio
DF PL 0.5X	Olympus		lente objetiva para SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio	FLIR Systems, Inc.	Nº do produto GS3-U3-41C6NIR-C	CMOS
câmera XIMEA xiQ câmera	XIMEA Nº	do produto MQ042RG-CM	CMOS câmera
com anel LED luz		CCS Modelo: LDR2-100SW2-LA	Malha de nylon LED
32µ m	Tokyo Screen	N-No.380T	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Malha de nylon 13µ m	Tokyo Screen	N-No. 508T-K	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Metal seive 150 mícrons de abertura	Tokyo Screen		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metal seive 75 mícrons de abertura	Tokyo Screen		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS	Asahi Food & Saúde, Co. Ltd.		fermento de cerveja seco
LabVIEW	National Instruments		um ambiente de desenvolvimento integrado para programação
Mai-Tai HP	Spectra Physics		laser de dois fótons

placa de de baixa temperatura microscópio branca