Avaliação pré-clínica da Bioatividade da OT48 de cumarina Anticancer esferoides, ensaios de formação de colônia e Xenografts Zebrafish

Summary

Aqui, apresentamos o rastreio pré-clínico de cumarinas anticâncer usando zebrafish e cultura 3D.

Abstract

Rastreio pré-clínico in vitro e em vivo de novos agentes terapêuticos são uma ferramenta essencial na descoberta da droga de cancro. Apesar de linhas de células cancerosas humanas respondem aos compostos terapêuticos em culturas de células 2D monocamada (dimensional), sistemas de cultura 3D foram desenvolvidos para compreender a eficácia de drogas em modelos mais fisiologicamente relevantes. Nos últimos anos, observou-se uma mudança de paradigma na pesquisa pré-clínica para validar a potência de novas moléculas nos sistemas de cultura 3D, mais precisamente, imitando o microambiente do tumor. Estes sistemas caracterizam o estado de doença de uma forma mais fisiologicamente relevante e ajudam a obter melhor visão mecanicista e compreensão da potência farmacológica de uma determinada molécula. Além disso, com a tendência atual na melhoria na vivo modelos de câncer, o zebrafish tem emergido como um importante modelo de vertebrados para avaliar a formação de tumor na vivo e estudar o efeito de agentes terapêuticos. Aqui, nós investigamos o efeito terapêutico de Hidroxicumarina OT48 sozinho ou em combinação com BH3 mimetics em linhagem de células de câncer de pulmão A549 usando três sistemas diferentes de cultura 3D, incluindo ensaios de formação de Colônia (CFA), ensaio de formação de esferoide (SFA) e na vivo xenografts zebrafish.

Introduction

Câncer é causada por mutações celulares e consequentemente sinalização de caminhos bioquímicos são rompidos, provocando a divisão celular descontrolada e resistência à morte celular. Tumores interferem com as funções fisiológicas do aparelho digestivo, nervoso, circulatório e posteriormente vizinhas tecidos¹. Apesar dos esforços de pesquisa extensiva, cancro continua a ser a doença fatal mais prevalente no mundo². Medicina de precisão tem sido reconhecida como o fundamento da terapêutica do câncer futuro. Novas entidades moleculares são testadas rotineiramente em combinação com drogas existentes para melhorar os resultad....

Protocol

1. colônia formação ensaios

1. Células de cultura A549 em uma concentração de 20.000 células/cm² em 15 mL de RPMI1640 celular cultura suplementado com 10% FBS (soro Fetal bovino) e 1% antibióticos num balão de² 75 cm numa incubadora de CO₂ a 37 ° C e 5% de CO₂.
2. No dia do experimento, determine a concentração de células usando um hemocytometer. Coletar 50.000 células por centrifugação a 400 x g durante 7 min em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e ressuspender as células em 100 µ l de 1 x PBS estéril (fosfato Buffered Saline) em tubos de 1,5 mL.
3. Dispense a 1,1 mL de meio de baseada em....

Results

Na Figura 2, câncer de pulmão de células linha A549 foi semeada em MCBM que formam colônias após o tratamento com OT48 sozinho ou em combinação com BH3 mimética A1210477 nas concentrações indicadas. Os resultados mostraram que a combinação significativamente reduzido número, tamanho e área de superfície total das colônias após 10 dias de incubação.

Na Figura 3, A549 cél.......

Discussion

As taxas de formação de colônia obtidos com MCBM depende do tipo de célula. Geralmente, para as células não-aderentes, o número de colônias é muito mais alto em comparação com células aderentes. Observamos que as células A549 formaram colônias de 30 a 40 após 10 dias. Anteriormente informamos para as células de leucemia diferente que o número de colônias é entre 200 a 250⁹. Nossos resultados mostraram que OT48 sozinho não produziu uma diminuição significativa do número de colônias sozinhos. No ent.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiais necessários para ensaios de formação de colônias
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500-20	C°
Penicilina-Estreptomicina	Lonza	17-602E-20	C°
Balão de cultura de células T75	SPL	70075	RT
PBS solução	Hyclone	SH30256.02	RT
tubo de 1,5ml	Tubo Extragene-170-C	RT
tubo de 15 ml	Hyundai Micro	H20015	RT
12 bem	SPL	30012	RT
MethoCult	StemCell technologies	4230-20	C°
Brometo de Tetrazólio Azul de Tiazolil (pó MTT)	Sigma	M5622	4 C°
LAS4000	GE Healthcare Technologies		RT
strong>Materiais necessários para o ensaio de formação de esferoides
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500-20	C°
Penicilina-estreptomicina	Lonza	17-602E-20	C°
Balão de cultura celular T75	SPL	70075	RT
PBS solução	Hyclone	SH30256.02	RT
Tripsina-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
Placa de 96 poços Corning costar ultra low attachemnt		Microscopia Corning	3474
	Nikon	Eclipse TS100	RT
strong>Materiais necessários para xenoenxertos de peixe-zebra
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500-20	C°
Penicilina-estreptomicina	Lonza	17-602E-20	C°
Balão de cultura de células T25	SPL	70025	RT
Balão de cultura de células T75	SPL	70075	RT
Balão de cultura de células T175	SPL	71175	RT
Tubo de 1,5 ml	Tubo Extragene	Tube-170-C	RT
Placa de 24 poços	SPL	30024	RT
Petrídico	SPL	10100	RT
PBS solução	Hyclone	SH30256.02	RT
Tripsina-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	71382	RT
Cloreto de potássio (KCL)	Sigma-Aldrich	P9541	RT
Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O)	Sigma-Aldrich	M2773	RT
Nitrato de cálcio tetrahidratado (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	C1396	RT
Solução HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	RT
Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521	RT
Solução de Fenol Vermelho	Sigma-Aldrich	P0290	RT
Metilcelulose	Sigma-Aldrich	M0512	RT
1-fenil-2-tioureia (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	RT
CM-Dil corante	Invitrogen	C7001-20	C°
Capilar de vidro	World Precision Instruments	TW 100F-4	RT
Micropipeta extrator	Instrumento de obturador, EUA	P-97	RT
Micro injetor	World Precision Instruments	PV820	RT
Seringa	KOVAX	1ml	RT
Micro carregador	Eppendorf	5242956003	RT
Lâmina de vidro	Marienfeld	HSU-1000612	RT
Microscopia de fluorescência	Leica	DE / DM 5000B	RT